Come identificare i Cromosomi

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1 Come identificare i Cromosomi Fino al 1970, i cromosomi sono stati classificati in base alle dimensioni ed alla posizione del centromero. A I più grandi (metacentrici) B Grandi (submetacentrici) C Medi (submetacentrici, incluso il chr. X) D Grandi (acrocentrici) E Piccoli (submetacentrici) F Piccoli (metacentrici) G Piccoli (acrocentrici, incluso il chr. Y) 61

2 Bandeggio dei Cromosomi L introduzione di specifiche tecniche di colorazione (bandeggio) a permesso di: Identificare i diversi cromosomi Definire più accuratamente le alterazioni cromosomiche Le tecniche di bandeggio prevedono: Denaturazione o digestione enzimatica dei cromosomi L utilizzo di coloranti che si legano in maniera specifica al DNA Il cromosoma mostra la tipica alternanza di bande chiare e scure. 62

3 International System for human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) 63

4 Tipi di bandeggio TECNICA PROCEDURA BANDING PATTERN Bandeggio G Proteolisi limitata (trattamento con tripsina) seguita dalla colorazione Giemsa Le bande scure sono regioni ricche in AT, le bande chiare sono ricche in GC Bandeggio R (Reverse) Denaturazione al calore (regioni ricche in AT) seguita dalla colorazione Giemsa Le bande scure sono regioni ricche in GC, le bande chiare sono ricche in AT (inverso del bandeggio G) Bandeggio Q Bandeggio C Proteolisi limitata (trattamento con tripsina) seguita dalla colorazione un colorante fluorescente (Quinacrina) Denaturazione con idrossido di bario e poi colorazione con Giemsa Bandeggio analogo al bandeggio G (scure ricche in AT, chiare ricche in GC). Colora selettivamente anche il braccio lungo del chr. Y Colora selettivamente le regioni ricche in eterocromatina costitutiva (centromeri e regioni pericentromeriche) Colorazione NOR Colorazione con Nitrato di Argento Colora selettivamente i satelliti dei chr. acrocentrici 13, 14, 15, 21 e 22 ed è esclusiva di queste regioni 64

5 Bandeggio G 65

6 Confronto tra bandeggi G and R-banding results show the addition of chromosomal material in the short arm of one chromosome 9(der(9)). C-banding results show the presence of heterochromatin into the der(9). 66

7 Bandeggio C 67

8 Colorazione NOR 68

9 Risoluzione del Cariotipo tradizionale Il limite di risoluzione di un analisi del cariotipo standard è di 4-6 Mb Il potere di risoluzione delle tecniche di bandeggio può essere aumentato analizzando i cromosomi in condizioni di minore condensazione (prometafase): Bassa (400 bande) Intermedia (550 bande) Alta (850 bande) 69

10 Cromosoma 4 (G-banding)

11 Cariotipo costituzionale: da quali cellule? Il cariotipo costituzionale può essere ottenuto da qualsiasi tipo di cellula somatica nucleata E fondamentale che la cellula sia in mitosi La fonte più semplice sono le cellule nucleate del sangue E sufficiente un prelievo di sangue venoso Il linfociti hanno un elevato indice mitotico se stimolati in coltura con fitoemoagglutinina (PHA) Fonti alternative di cellule: Fibroblasti (da biopsia cutanea) Una condizione di mosaicismo Cellule del midollo osseo (biopsia midollare) Sospetta leucemia (citogenetica oncologica) Amniociti (prelievo di liquido amniotico) Analisi in epoca prenatale 71

12 Cariotipo di routine Blocca in metafase (depolimerizza i microtubuli del fuso mitotico) 72

13 Cariotipo di routine 73

14 Cariotipo di routine 74

15 Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) dei Cromosomi L analisi dei cromosomi mediante FISH prevede l uso di sonde (molecole di DNA) di lunghezza variabile (2-500 Kb) marcate con un fluoroforo. Marcatura diretta Marcatura indiretta Nella FISH standard la sonda è omogena In alcune applicazioni è possibile utilizzare più sonde contemporaneamente e le immagini sono elaborate da sistemi di analisi computerizzati. E possibile analizzare i nuclei in interfase. Il chromosome painting è la forma più sofisticata di FISH Si utilizzano cocktail di sonde specifiche per i diversi cromosomi Le immagini rielaborate dal computer, in colori virtuali, consentono di distinguere i cromosomi e dettagliarne il bandeggio Il limite di risoluzione è di ~ 40 Kb 75

16 Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) dei cromosomi 76

17 Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) dei cromosomi 77

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20 A. Cariotipo con tecnica classica

21 B. M-FISH

22 C. Rx-FISH Parziale trisomia del braccio corto del Chr 2

23 Rx-FISH (Rainbow Colors X Species) I cromosomi umani sono ibridati con sonde colorate da cromosomi di un primate (Gibbone). Il genoma di questa specie (2n=52) ha omologia del 98% con il genoma umano 83

24 Comparative Genomic Hybridization (CGH) Consente di evidenziare alterazioni quantitative (delezioni/duplicazioni) nei cromosomi metafasici. Il DNA estratto da due sorgenti cellulari diverse (Campione e Controllo) è marcato con due differenti fluorofori Entrambi i pool di sonde sono ibridati con cromosomi matafasici fissati su un vetrino I segnali di fluorescenza lungo i cromosomi sono dosati e sovrapposti (merge) evidenziando in colori virtuali il differente dosaggio Trova applicazione in citogenetica oncologica dove spesso si osservano cariotipi fortemente alterati. 84

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26 Array-CGH E l ulteriore evoluzione del CGH su cromosomi metafasici, ma con risoluzione molto elevata che consente di evidenziare alterazioni del numero di copie (Copy Number Variation, CNV) anche di 3.5 Kb. Il DNA estratto da due sorgenti cellulari diverse (Campione e Controllo) è marcato con due differenti fluorofori Entrambi i pool di sonde sono ibridati su un vetrino (microarray) su cui sono state fissate specifiche sequenze oligonucleotidiche rappresentative dell intero genoma I segnali di fluorescenza sono dosati e sovrapposti (merge) evidenziando in colori virtuali il differente dosaggio Consente di ricondurre immediatamente l alterazione osservata ad una precisa regione/sequenza del genoma. 86

27 Array-CGH 87

28 Array-CGH 88

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30 Polimorfismi cromosomici I cromosomi umani possono presentare variazioni morfologiche (polimorfismi) in diversi individui. Spesso interessano regioni costituite da DNA ripetitivo, funzionalmente inattivo e quindi non hanno alcun effetto patologico. Rientrano nella variabilità individuale che, a diversi livelli, si osserva nel nostro genoma. 90

31 Satelliti dei cromosomi acrocentrici Polimorfismi cromosomici più frequenti: Assenza dei satelliti di un cromosoma acrocentrico Espansione del DNA satellite Espansione delle regioni NOR Evidenziabili con il bandeggio C o colorazione NOR. 91

32 Variazioni dell eterocromatina pericentromerica Sono in genere espansioni, ma anche delezioni o inversioni. Tutti i cromosomi, più frequente in chr. 1, 9 e 16 L espansione dell eterocromatina pericentromerica del chr. 9 è presente nell 8% degli individui L inversione della stessa regione del chr. 9 è presente nell 1.5% degli individui Evidenziata con bandeggio C 92

33 Polimorfismi dell eucromatina Sono denominati HSR (Homogeneously Staining Regions). Bene caratterizzata la variante 9p+ (amplificazione di un segmento della banda 9p12) Altre varianti polimorfiche descritte a 15q11.2, 16p11.2 e 8p

34 Copy Number Variations (CNV) Sono una classe di varianti polimorfiche dell eucromatina normalmente presenti nella popolazione generale. Sono evidenziabili mediante array-cgh (per l elevata risoluzione della tecnica) Sono delezioni o amplificazioni di segmenti genici, in genere di piccole dimensioni ( Kb fino a 3Mb) Sono presenti in più del 1% della popolazione. 94

35 DGV 95

36 DECIPHER 96

37 3 anni, figlio unico di genitori non consanguinei Gravidanza normo decorsa (parto cesareo a termine) Tratti dismorfici Impianto basso delle orecchie Strabismo occhio dx Ipertelorismo Fronte alta e prominente Capelli sottili con attaccatura alta Labbro pendente Linguaggio assente Comportamenti ripetitivi RITARDO PSICOMOTORIO 97

38 acgh ISCAv2 8x60K (International Standard Cytogenetic Array) Delezione in eterozigosi (de novo) di circa 4.4Mb (chr1: ) a 1q24.2-q24.3, rilevata con 65 sonde. 98

39 UCSC genome browser chr1: La delezione coinvolge circa 40 geni. L aploinsufficienza della regione 1q24-q25 è stata associata a difetti cognitivi, bassa statura, microcefalia, mani e piedi piccoli, dita corte, più una variabilità di altri segni e sintomi. 99

40 100

41 Anomalie cromosomiche Alterazioni che interessano il DNA genomico determinando la perdita o l acquisizione di interi cromosomi o segmenti di essi. Se l alterazione è tale da poter essere visibile al microscopio ottico si parla allora di anomalia o aberrazione cromosomica. Le anomalie cromosomiche possono essere: Costituzionali, se presenti in tutte le cellule dell organismo. Somatiche, quando interessano un piccolo sottogruppo di cellule o tessuti (mosaicismo, neoplasie). Le anomalie costituzionali risultano da alterazioni nelle cellule germinali, nella fecondazione o nei primissimi stadi dello sviluppo embrionale. Le anomalie cromosomiche sono in genere anomalie di numero e anomalie strutturali. 101

42 Anomalie nel numero dei cromosomi Se ne distinguono tre classi: Poliploidia Aneuplodia Mixoploidia (mosaicismo e chimerismo) La poliploidia più comune è la triploidia (3n) determinata dalla fecondazione di un ovulo da parte di due spermatozoi (dispermia) o da una fecondazione che coinvolge un gamete diploide. La tetraploidoia (4n) è invece dovuta al non completamento della prima divisione zigotica. La poliploidia costituzionale è comunque una condizione molto rara. Interessa l 1-3% dei concepimenti, quasi mai vivi alla nascita, ed è incompatibile con la vita. 102

43 Poliploidia 103

44 69,XXY (57%) Cariotipo triploide 69,XXX (40%) 69,XYY ( 3%) Un corredo cromosomico triploide (3n) è una tra le più frequenti cause di aborto spontaneo (15% delle anomalie cromosomiche nei materiali abortivi; 1/14). Eccezionalmente nei nati vivi ma precocemente letale (1:10.000). Rischio di ricorrenza per la coppia è trascurabile. 104

45 Cariotipo tetraploide (92,XXYY) Un corredo cromosomico tetraploide (4n) è sempre letale. Rappresenta il 6% delle anomalie cromosomiche nei materiali abortivi. Rischio di ricorrenza per la coppia è trascurabile. 105

46 Aneuploidie (1) L aneuploidia è il risultato dell aggiunta di copie di un cromosoma alla coppia normale di omologhi (ad esempio la trisomia) o della perdita di un cromosoma omologo (monosomia). Le cause possono essere: Non-disgiunzione - I cromosomi appaiati, durante la meiosi I, o i cromatidi fratelli, durante la meiosi II, non sono in grado di separarsi. Ritardo anafasico - Un cromosoma non viene incorparato nel nucleo di una delle cellule figlie al termine della divisione cellulare a seguito della sua ritardata migrazione durante l anafase. 106

47 Non-disgiunzione 107

48 Ritardo anafasico 108

49 Aneuploidie (2) L aneuploidia può avere effetti diversi a seconda se ad essere interessati sono gli autosomi o i cromosomi sessuali. Nullisomia (perdita di un coppia di omologhi) e monosomia (perdita di un cromosoma) sono letali. La trisomia è in genere letale. La trisomia del 13 (sindrome di Patau) e la trisomia del 18 (sindrome di Edwards) possono essere a termine. La trisomia del 21 (sindrome di Down) la sopravvivenza è fino ai 40 anni o più. Quando sono interessati i cromosomi sessuali la situazione è meno drammatica. Condizioni tipo XXX, XXY, XYY creano minori problemi e danno una buona aspettativa di vita. Nella sindrome di Turner (45,X0) il 99% sono aborti spontanei, ma quelli che sopravvivono sono di intelligenza normale ma infertili e con modesti segni fisici. La condizione 45,Y è sempre letale. 109

50 Cariotipo con trisomia

51 Cariotipo con Sindrome di Turner (45,X0) 111

52 Aneuploidie nei nati vivi Anomalie autosomiche trisomia 21 (sindrome di Down) 1/750 trisomia 18 (sindrome di Edwards) 1/7.000 trisomia 13 (sindrome di Patau) 1/ Anomalie dei cromosomi sessuali Sindrome di Klinefelter (47,XXY) 1/900 maschi Sindrome XYY (47,XYY) 1/1.000 maschi Sindrome della tripla X (47,XXX) 1/1.200 femmine Monosomia X o S. di Turner (45,X0) 1/2.500 femmine 112

53 Mixoploidia Presenza di due o più linee genetiche nello stesso organismo: Mosaicismo (origine dallo stesso zigote) Chimerismo (raro, da due zigoti distinti) Comuni i mosaicismi aneuploidi (difetti di non disgiunzione mitotica in fasi embrionali precoci) 113

54 Anomalie strutturali dei cromosomi (1) Le anomalie strutturali sono il risultato di rotture nei cromosomi in uno o più punti e della loro successiva riparazione. Esse possono essere: Bilanciate - se non c è acquisizione o perdita netta di materiale cromosomico. Non bilanciate - se c è acquisizione o perdita netta di materiale cromosomico. Le rotture cromosomiche derivano da danni al DNA (radiazioni, agenti chimici) o da errori durante i processi di ricombinazione (appaiamento ineguale): Danno riparato correttamente Danno irreparabile (la cellula è avviata all autodistruzione) Riparazione non corretta (anomalie strutturali). 114

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56 Anomalie strutturali dei cromosomi (2) Se in uno stesso cromosoma si verificano due rotture, si osserva di solito uno di questi eventi: Inversione cromosomica - Quando il segmento viene invertito prima di risaldare i due punti (riarrangiamento bilanciato). Delezione interstiziale - I due frammenti terminali vengono saldati, ma il segmento intermedio è perduto (riarrangiamento non bilanciato). Cromosoma ad anello - Le estremità del segmento ai punti di rottura si risaldano formando una struttura ad anello (riarrangiamento non bilanciato). Come risultato di un appaiamento ineguale: Duplicazione Un segmento del cromosoma risulta essere duplicato (riarrangiamento non bilanciato) 116

57 Inversione cromosomica 117

58 Delezione interstiziale 118

59 Cromosoma ad anello 119

60 Duplicazione cromosomica 120

61 Anomalie strutturali dei cromosomi(2) Se le rotture si verificano su due o più cromosomi si possono ottenere cromosomi ibridi e il processo è detto di traslocazione cromosomica. Si conoscono tre tipi di traslocazioni cromosomiche: Traslocazione reciproca - E un riarrangiamento bilanciato che si verifica quando viene scambiato materiale distale ai punti di rottura sui due cromosomi. Fusione centrica (Robertsoniana) - Si verifica quando le rotture avvengono vicino al centromero di due cromosomi acrocentrici. Traslocazione con inserzione - Deriva da tre rotture cromosomiche ed implica l escissione di un frammento ed il suo inserimento in un terzo punto di rottura solitamente su di un altro cromosoma. Tutte queste alterazioni possono anche essere asintomatiche ma i portatori possono essere a rischio di generare monosomia o trisomia parziale nella progenie. 121

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63 Traslocazione reciproca 123

64 Fusione centrica (Robertsoniana) Nell uomo, la traslocazione robertsoniana coinvolge due dei 5 cromosomi acrocentrici (13, 14, 15, 21 e 22) 1-2 Mb di geni per l RNA ribosomiale tra due blocchi di eterocromatina. 124

65 1 persona su 1300 è portatrice di una traslocazione rob(13;14) Il cariotipo di soggetti con traslocazione rob ha 45 chr. 125

66 45,XX,rob(14;21)(q10;q10) 126

67 Frequenza ed effetto delle traslocazioni robertsoniane 127

68 Traslocazione con inserzione 128

69 Conseguenze cliniche delle anomalie strutturali dei cromosomi Sono in genere il risultato di uno sbilancio nell espressione dei geni coinvolti nel riarrangiamento. Anomalie cromosomiche bilanciate (vere) possono essere asintomatiche, tranne il caso di: Una rottura che interrompe un gene importante. Una rottura che altera l espressione di un gene senza interromperlo ma separandolo da un elemento regolatore o spostandolo in una regione eterocromatica. Traslocazioni tra un cromosoma X e un autosoma che sono soggette ad inattivazione non casuale della X. Gli individui portatori di anomalie cromosomiche bilanciate possono avere figli con cariotipi sbilanciati. 129

70 X-inactivation Il sesso maschile è determinato dalla presenza del cromosoma Y. Si sono evoluti meccanismi per compensare la differenza di dosaggio genico del cromosoma X, presente in 2 copie nelle femmine e in 1 copia nei maschi. Nelle femmine uno dei due cromosomi X è inattivato casualmente in ciascuna cellula allo stadio di blastocisti.

71 X-inactivation L inattivazione inizia a livello del centro di inattivazione dell X (XIC) a Xq13. XIC codifica un lungo RNA non codificante (~17 kb) espresso solo dal chr. X inattivato. L RNA si lega al chr. X e si pensa recluti fattori proteici che fanno assumere alla cromatina una forma chiusa, inattiva. L inattivazione dell X non è completa (regioni PAR, geni che sfuggono anche parzialmente all inattivazione).

72 Traslocazione X-autosoma 132

73 Traslocazione reciproca bilanciata 133

74 Traslocazione reciproca bilanciata La formazione di tetravalenti aiuta a capire: solo con la segregazione alternata si formano gameti normali o con traslocazione bilanciata, mentre le segregazioni adiacenti 1 e 2 portano alla 134 traslocazione sbilanciata o alla trisomia

75 Inversione pericentrica I cromosomi normale e invertito si appaiano formando, rispettivamente, un ansa ed un anello. La ricombinazione all interno dell ansa parziale delezione o duplicazione 135 terminale sbilanciata.

76 Inversione paracentrica I cromosomi normale e invertito si appaiano formando, rispettivamente, un ansa ed un anello. La ricombinazione all interno dell ansa forma un cromosoma dicentrico e acentrico (instabili). 136

77 Isocromosoma Sono il prodotto di un anomala fissione del centromero (trasversale e non longitudinale) in anafase. Rari nell uomo ad eccezione di: i(xq) S. di Turner i(21q) S. di Down 137