2006. S. PRIMROSE, R. TWYMAN, B. OLD,

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1 Biochimica dinamica degli Organismi Geneticamente Modificati: 8 CFU Obiettivi del modulo: Portare lo studente ad essere in grado di conoscere le principali metodologie per lo sviluppo di organismi geneticamente modificati di origine animale e vegetale sia per scopi di ricerca in ambito biotecnologico che per il loro impiego nel settore agro-alimentare/industriale. Inoltre, lo studente acquisirà dimestichezza con i principali database disponibili per l analisi strutturale di geni e proteine. Infine, il corso intende trasferire allo studente un analisi critica delle principali metodologie per il controllo della presenza di organismi geneticamente modificati in diverse matrici alimentari. Programma del modulo: Organismi geneticamente modificati (OGM): definizione. Principali metodi per l ottenimento di organismi geneticamente modificati. Applicazioni biotecnologiche per la produzione di OGM (microrganismi, animali, piante). Utilizzo di database esistenti in rete e di software per l analisi di sequenze nucleotidiche ed aminoacidiche. Metodologie di analisi per la determinazione di OGM in matrici alimentari. Principali metodi di valutazione qualitativa della presenza di sequenze nucleotidiche specifiche per OGM. Analisi quantitativa del contenuto di OGM. Metodi di analisi dei prodotti di espressione dei transgeni. Aspetti di sicurezza ambientale e sanitaria e normative vigenti. Controllo di qualità nella diagnostica OGM. Stato dell arte sull impiego di OGM in campo agroalimentare e zootecnico. Aspetti di sicurezza ambientale e di salute derivanti dall impiego di OGM. Cenni sulle normative vigenti in campo nazionale ed internazionale. Testi Consigliati I. COZZANI, E. DAINESE Biochimica degli Alimenti e della Nutrizione, Ed. PICCIN, S. PRIMROSE, R. TWYMAN, B. OLD, Ingegneria genetica, Principi e Tecniche, Zanichelli, 2004.

2 Gli OGM: un problema di definizione? Definizione dalla regolamentazione degli OGM nell Unione europea Gli OGM possono essere definiti come organismi (e microrganismi) in cui il materiale genetico (DNA) è stato alterato artificialmente in un modo che non avviene in natura né mediante incroci selettivi né mediante ricombinazione spontanea. Tale tecnologia, variamente definita come moderna biotecnologia, tecnologia del DNA ricombinante o ingegneria genetica, consente la selezione e il trasferimento di singoli geni da un organismo ad un altro, anche di specie non correlate. DL n. 92 del 3/31/1993 art. 3, recepimento della Direttiva Comunitaria 90/220/CE

3 OGM o biologico: è questo il dilemma?

4 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM) Microorganismi Animali Vegetali

5 Cassetta genica Regione codificante Promotore Terminatore

6 Cassetta 1 Cassetta 2 P1 Transgene 1 T1 P2 Transgene T2 2

7 Geni marcatori Conferiscono la possibilità di operare una selezione (ad es. geni di resistenza ad antibiotici o pesticidi) Vengono usati in associazione ad altri geni strutturali in costrutti complessi Gene marcatore Gene strutturale

8 Prodotti di espressione dei transgeni Enzimi Proteine non enzimatiche Costrutti anti-senso

9 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM) Microorganismorganismi Animali Vegetali

10 Esempi di enzimi ottenuti mediante tecnologia del DNA ricombinante usati in tecnologia alimentare 1- Proteasi - Chimosina (Aspergillus niger, Kluveromyces lactis, Escherichia coli) - Subtilisina (Bacillus subtilis) 2- Glicosidasi - - galattosidasi (Saccharomyces fragilis) - -amilasi (Bacillus sp.) - cellulasi (Apergillus oryzeae, Trichoderma sp.) 3- Esterasi - lipasi (Aspergillus orizeae, ecc.)

11 Applicazioni biotecnologiche degli enzimi Ambito di applicazione Industria del pellame Enzimi usati Tripsina da animali macellati o da microrganismi GM Impiego e vantaggi Per rimuovere componenti proteiche o peli. Industria farmaceutica e presidi medici Tripsina, plasmina, ecc. Per detergere le ferite e dissolvere coaguli. Nel trattamento delle infiammazioni Diversi enzimi Usati come strumenti Diagnostici nella biochimica clinica

12 Applicazioni biotecnologiche degli enzimi Ambito di applicazione Enzimi usati Impiego e vantaggi Problemi Detersivi biologici Proteinasi Amilasi Industria tessile Amilasi Enzimi batterici Prelavaggio e applicazione diretta Rimozione residui amilacei da stoviglie Per togliere l appretto. Resistono a C. Allergie negli addetti alla lavorazione

13 Applicazioni biotecnologiche degli enzimi Ambito di applicazione Industria dei prodotti da forno Enzimi usati -amilasi fungine inattivate a 50 C Impiego e vantaggi Catalizzano la degradazione dell amido della farina in zuccheri. Proteinasi Nei biscotti per abbassare il contenuto proteico della farina.

14 Applicazioni alimentari degli enzimi Ambito di applicazione Enzimi usati Impiego e vantaggi Problemi Industria casearia Rennina (chimosina GM) da stomaco di giovani ruminanti (vitelli, agnelli, capretti) Lipasi Usata per idrolizzare le proteine per la produzione di formaggi. Per la maturazione di Gorgonzola e Roquefort Non si possono usare gli animali più vecchi perché in questi viene sostituita dalla pepsina. Prezzo elevato. Lattasi Scindono il lattosio in glucosio e galattosio

15 Ambito di applicazione Industria della Birra Applicazioni alimentari degli enzimi Enzimi usati Enzimi prodotti dall orzo nella fase di macerazione. Enzimi prodotti industrialmente: Amilasi, glucanasi, proteinasi. -glucanasi Amiloglucosidasi Proteinasi Impiego e vantaggi Scindono l amido e le proteine, formando zuccheri semplici, aminoacidi e peptidi usati poi dai lieviti per produrre alcool. Scindono i polisaccaridi e le proteine del malto. Migliora le caratteristiche della filtrazione. Birre a basso contenuto calorico Rimuovono la torbidità della birra durante l immagazzinamento.

16 Applicazioni alimentari degli enzimi Ambito di applicazione Industria dell amido Enzimi usati Amilasi, amiloglucosidasi, glucoamilasi. Glucosio isomerasi Enzimi immobilizzati Impiego e vantaggi Convertono l amido in glucosio (sciroppi). Convertono il glucosio in fruttosio (aumento potere dolcificante) Produzione di sciroppi ad alto contenuto di fruttosio* * Usati in U.S.A. e Giappone, ma la UE ne proibisce l uso per proteggere i prodotti di barbabietole da zucchero.

17 Il mercato mondiale degli enzimi microbici

18 Produzione di enzimi industriali nel mondo occidentale Tre settori di mercato assorbono da soli l 80% delle vendite di enzimi per impiego industriale: la conversione degli amidi (40%), la produzione di detersivi (30%) e l'industria casearia (10%). In questo ultimo settore il mercato si sta ampliando notevolmente.

19 Produzione di enzimi industriali nel mondo occidentale In termini quantitativi, l impiego di enzimi usati per usi diagnostici è piuttosto scarso. In questo caso infatti gli enzimi sono immobilizzati in sistemi sempre più miniaturizzati e la quantità totale di enzima impiegato è piuttosto bassa. Nelle produzioni industriali in cui si usano gli enzimi come additivi (1 o 2 kg per 1000 kg di substrato) si impiegano generalmente formulati liquidi di rado purificati e a basso costo (dai 5 ai 30 dollari al kg). Quindi, gli enzimi destinati alle applicazioni analitiche, diagnostiche e terapeutiche sono impiegati in piccole quantità (mg o g), ma devono avere un elevato grado di purezza. In questo caso i costi sono molto più elevati (circa dollari al kg).

20 Modificazioni degli enzimi La modificazione degli enzimi, finalizzata a migliorarne o ad alterarne le proprietà catalitiche è una pratica in uso da diverso tempo. In passato, si ottenevano queste modificazioni mediante selezione di mutazioni casuali, oggi si ricorre all ingegneria delle proteine mediante analisi della struttura tridimensionale e sviluppo di mutazioni sito- specifiche. I principali obiettivi in questo ambito sono i seguenti:

21 Produzione industriale di proteine - La produzione di enzimi microbici avviene generalmente in colture in fase liquida simili a quelle impiegate per la produzione di antibiotici. - Il terreno di coltura è molto importante, esso deve soddisfare i fabbisogni energetici dei microrganismi e fornire un apporto adeguato di azoto e carbonio. La scelta fra materie prime a costi diversi dipenderà dal valore del prodotto finale.

22 Produzione industriale di proteine La produzione industriale di proteine da microrganismi avviene prevalentemente in colture in fase liquida o su substrato solido. Fra i substrati più comuni figurano gli idrolisati amilacei, la melassa, il liquido di spremitura dei torsoli di mais, il siero del latte e molti cereali. - La produzione di enzimi fungini (amilasi, proteinasi, pectinasi e cellulasi) su substrato solido (Giappone ed estremo Oriente) vede l impiego come substrato di una miscela formata da crusca di grano o di riso e nutrienti salini su grandi vassoi incubati in camere a temperatura costante.

23 Produzione industriale di proteine Per gli enzimi microbici vengono impiegati dei bioreattori in acciaio inossidabile con una capacità di m3. La crescita dei microrganismi è influenzata dai nutrienti e dal fatto che parametri ambientali come la temperatura, il ph e l ossigenazione vengano mantenuti ai livelli ottimali.

24 Tipi di bioreattori

25 Produzione industriale di proteine I criteri per la scelta del microrganismo più adatto per una determinata produzione enzimatica prevedono la considerazione di diversi fattori, i più importanti sono: 1) I costi di produzione; 2) Enzima endocellulare o esocellulare; 3) Eventuale presenza di enzimi o metaboliti nocivi; 4) Presenza di odori o colori sgradevoli; 5) Sensibilità alla temperatura e a valori estremi di ph; 6) Facilità di recupero dell enzima; Livelli di sintesi dell interleuchina3 realizzati in sistemi ospiti diversi:

26 Produzione su vasta scala di proteine mediante fermentazione

27 Produzione industriale di proteine In una coltura a sistema chiuso (batch culture) vengono inoculati volumi fissi di terreno liquido contenente I microrganismi: durante la crescita le sostanze nutritive si consumano e i metaboliti e la biomassa aumentano determinando cambiamenti nel metabolismo cellulare. L andamento della crescita vede una fase iniziale (1) di latenza (lag phase) di adattamento ambientale delle cellule, una fase transitoria di incremento (2) seguita da una fase esponenziale (3) o logaritmica (log phase), da una fase di decremento (4) una fase stazionaria (5) e una fase di estinzione (6).

28 Produzione industriale di enzimi E.coli che sintetizza acetolattato-sintasi

29 Vantaggi delle colture a sistema chiuso Inoltre, quando si impiegano organismi geneticamente modificati (OGM) è obbligatorio per legge evitare ogni contaminazione da parte di microrganismi indesiderati e la possibilità che l organismo coltivato diffonda accidentalemente nell ambiente. Nelle maggior parte dei casi gli enzimi vengono prodotti da colture in batch che durano da 30 a 150 ore. I metodi di coltura continua hanno trovato scarsa applicazione nella produzione industriale di enzimi: è essenziale che entro il bioreattore permangano condizioni di assoluta sterilità in ogni fase della produzione.

30 Produzione di proteine da cellule singole (SCP) Nell ambito dei progetti che prevedono l incremento della produzione di proteine utili per l alimentazione vi è quello, ancora in fase sperimentale, della produzione di proteine da microorganismi (batteri, lieviti, muffe, miceti) che crescono come cellule singole (SCP) o filamenti di cellule. I problemi principali sono legati sia all educazione alimentare, sia alla tipologia dei terreni impiegati per la produzione di SCP (derivati del petrolio). Alcuni prodotti sono stati commercializzati per l alimentazione animale: in Gran Bretagna la ICI ha costruito un impianto di produzione su larga scala ( L) che impiega il batterio Methylophilus methylotrophus che cresce in metanolo che produceva SCP in commercio con il nome di Pruteen (costi troppo elevati).

31 Purificazione degli enzimi nei processi industriali Tutte le operazioni di estrazione e purificazione del prodotto finale vengono definite operazioni a valle. Solitamente negli impianti di produzione la maggior parte del personale è impeganto nelle operazioni a valle: integrazione di competenze tra chimici, biologi e ingegneri dei processi produttivi. Per essere adatti alla distribuzione commerciale, i prodotti finali dei processi di purificazione devono avere un certo grado di stabilità: per molti enzimi e proteine la forma di elezione è quella disidratata ottenuta mediante essicazione o liofilizzazione.

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33 Le lavorazioni a valle