COOH. a ottica, % Purezza. Eccesso enantiomerico, %

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1 Determinazione purezza stereoisomerica Una volta effettuata una reazione stereoselettiva dobbiamo determinare: 1. Quale è la configurazione relativa e/o assoluta dello stereoisomero maggioritario 2. Con quale eccesso abbiamo ottenuto uno stereoisomero rispetto all altro Questo risulta relativamente facile per diastereoisomeri: entrambi i compiti saranno più difficili per determinare eccessi enantiomerici o la configurazione assoluta L eccesso enantiomerico (ee) è espresso dall equazione: ee = [R] [S] [R] + [S] x 100 (se R>S) %[R] = [R] [R] + [S] x 100 = 100 ee% 2 + ee% Se ee= 93% allora [R] = 96,5 Cioè il 93% è R e il 7% è racemo Se ee=100% il prodotto viene definito enantiomericamente puro

2 Metodi per la determinazione della composizione enantiomerica Si può agire su: 1a) su gli enantiomeri come tali, non separati 2a) su gli enantiomeri come tali e separati 1b) su gli enantiomeri trasformati in diastereoisomeri, non separati 2b) su gli enantiomeri trasformati in diastereoisomeri e separati Ogni metodo ha i suoi problemi ed è passibile di errore Polarimetria E il metodo più semplice ma non è molto preciso né molto affidabile. Sperimentalmente si basa sul confronto del potere ottico rotatorio con un valore noto e presunto essere quello del campione puro Teoricamente si basa sull esistenza di una relazione lineare tra il potere ottico rotatorio e la composizione enantiomerica secondo l equazione: [α] ee% = x 100 [α] max Incertezza circa del 3%

3 Potere ottico rotatorio La purezza ottica non sempre è uguale all eccesso enantiomerico Perché questo accada non devono essere presenti in soluzione fenomeni di aggregazione Me Et COOH Acido (S)-2-etil-2-metil succinico COOH a ottica, % Purezza Eccesso enantiomerico, % PO non lineare rispetto all ee Effetto Horeau

4 Variazione del valore dell [α] al variare della concentrazione 220 a]d 25 [alpha Ph Me H O concentrazione (g/100 ml) Risonanza Magnetica Nucleare Essendo equivamenti per simmetria due enantiomeri danno spettri NMR identici. Tuttavia, in presenza di un agente enantiopuro che interagisce in modo non coovalente con gli enantiomeri, questi possono dare segnali anisocroni, che, se integrati separatamente, consentono la determinazione dell ee. In pratica, protoni enantiotopici per paragone esterno (quelli di R e di S) e indistinguibili diventano diastereotopici e differenziabili I due principali tipi di additivi chirali enantiopuri sono: Chiral Shift Reagents (CSR) Chiral Solvating Agents (CSA) Nelle condizioni migliori il metodo ha un accuratezza del 2%.

5 Chiral Shift Reagents (CSR) Leganti Trifluoroacetil canfora Eptafluorobutanoil canfora Dicanforil metano Lantanide shift reagents: tris complessi di β-dichetonati Complessi ottaedrici: Europio (Eu) Praseodimio (Pr); Itterbio (Yb) Complessi ottaedrici di dichetoni Dichetone achirale simmetrico Due complessi enantiomerici, e Λ Λ Dichetone achirale non simmetrico Due coppie di complessi diastreoisomerici, cis- e Λ e trans- e Λ trans cis cis Λ trans Λ

6 Dichetone chirale simmetrico, enantiopuro (C 2 ) Due complessi diastereoisomerici, e Λ Λ Dichetone chirale non simmetrico, enantiopuro (C 1 ) Quattro complessi diastereoisomerici, cis- e Λ e trans- e Λ trans cis cis Λ trans Λ Trifluoroacetil canfora Eptafluorobutanoil canfora Quattro complessi diastereoisomerici, cis- e Λ e trans- e Λ trans cis cis Λ trans Λ

7 trans cis cis Λ trans Λ Complessazione con un legante esterno outer sphere: complesso 1:1 4 siti A,B,C,D 2 siti E,F 12 COMPLESSI 1:1 La situazione potrebbe essere ancora più complessa (stechiometria 1:1, struttura cambia dopo la complessazione Il CSA potrebbe non essere monomerica) In realtà i vari complessi sono in rapido equilibrio quindi quello che si osserva è lo spetto mediato, una volta che il sistema ha raggiunto l equilibrio. La cosa importante è ricordare che quello che si osserva è lo spettro di specie che equilibrano velocemente! La larghezza dei picchi dipende: dove δ= = differenza di chemical shift k= la costante di velocità dello scambio

8 Dipendenza dalla forza del campo magnetico Poiché δ H 0 il υ aumenterà con il quadrato della forza del campo Quindi poiché in presenza degli CSR δ sono grandi, il problema diventa particolarmente grave (infatti dobbiamo integrare i picchi per determinare l eccesso enantiomerico. Analisi migliori a H 0 bassi. Dipendenza dalla temperatura L incremento della temperatura ha un effetto opposta sulla larghezza del segnale, riducendola Quindi per migliorare la separazione e l integrazione bisogna effettuare gli spetti con spettrometri a basso campo e utilizzare elevate temperature

9 Origine dell anisocronia indotta ( δ) δ è dovuta a due fenomeni: K R K S (+)-CSR. R e (+)-CSR. S hanno geometrie diverse Entrambi i meccanismi sono operativi K R K S Protoni enantiotopici vengono differenziati (diventano diastereotopici) e H H OH O H 3 C S CH 3 e H D D H OH OH Anche la sostituzione isotopica viene evidenziata

10 Cosa succede se il CSR è racemo? diventa Spettro (R) = R libero + (+)-CSR. R e (-)-CRS. R Spettro (S) = S libero + (+)-CSR. S e (-)-CRS. S δ = 0 Per situazioni intermedie (ee=80%) Spettro (R) = R libero + (+)-CSR. R e (-)-CRS. R Spettro (S) = S libero + (+)-CSR. S e (-)-CRS. S Spettro (R) Spettro (S) δ 100% < δ 80% 0

11 Lantanoidi = Acidi Hard Basi Hard ammine primarie>alcoli>chetoni>aldeidi>eteri>esteri>nitrili Sono stati anche usati con: solfossidi, ammino acidi e complessi di transizione Istruzioni per l uso:

12 Chiral Solvating Agents (CSA) Pirkle (1966) provò l ipotesi di Mislow (1965) che nuclidi enantiotopici potessero diventare anisocroni in un solvente chirale (JACS, 1966, 88, 1837) H OH CF 3 H NH 2 CF 3 CSR vs CSA 1. CSA sono sostanze diamagnetiche: poiché la dinamica dei CSA e le interazioni con un soluto chirale possono essere ragionevolmente capite, spesso può essere usata per la determinazione della configurazione assoluta. 2. Negli CSA l anisocronia tre gruppi enantiotopici è spesso dovuta alla presenza nell CSA di funzioni anisotropiche, ad esempio gruppi aromatici. 3. La variazione di chemical shift indotta è inferiore a quella fornita dai CSR e il metodo può essere utilizzato con un numero minore di composti. Un vantaggio di avere δ piccoli è che l effetto sulla larghezza di riga del campo magnetico non è un problema. 4. Poiché CSA sono diamagnetici l allargamento del picco non è un problema come con i CSR. Quindi è spesso possibile valutare i rapporti enantiomerici confrontando l altezza dei picchi.

13 Chiral Solvating Agents Chiral Solvating Agents Meccanismo di Azione K R (+)-CSA. R (+)-CSA + R,S (+)-CSA. S K S (+)-CSA è una singola specie δ è dovuta a due fenomeni: K R K S (+)-CSA. R e (+)-CSA. S hanno geometrie diverse Poiché CSA sono diamagnetici possiamo usarne un eccesso con 5 equivalenti di CSA tutto il soluto è complessato

14 Chiral Solvating Agents Interazioni a tre punti Terza interazione: Ar R 2 Ar R 1 Nello spettro che si ottiene R 2 risuona a campi più alti a causa della schermatura dovuta all anello aromatico. Nello spettro che si ottiene R 1 risuona a campi più alti a causa della schermatura dovuta all anello aromatico. Se la natura delle interazioni OH E H con B 1 e B 2 è nota possiamo usare questo metodo per la determinazione della configurazione assoluta Caso della diidrochinina (-) (±) ee= 50% Williams, T. JACS 1969, 91,, 1871

15 Assumendo associazioni binarie, il fenomeno può essere spiegato assumendo l esistenza dei seguenti equilibri: Per l enantiopuro: S + S. S Per il racemo: S + S. S + R + R. R + R. S Per l arricchito in S: S + S. S + R + R. S L eccesso di S agisce da CSA per il racemato Chiral Shift Reagents (CSR) Spettro 1 H NMR (100 MHz) n-esanolo con Eu(dmp)3 (0.29 equiv)

16 1 H NMR (100 MHz) della (S)- e (±)-α-fenil etil ammina con Eu(3-pivaloil pivaloil-d-canfora) 3 Assegnazione Configurazione meso e dl meso e (R,S)-2-butene ossido 1 H NMR (100 MHz) con Eu(tfc) 3

17 Chiral Derivating Agents (CDAs) Trasformazione degli enantiomeri in diastereoisomeri Requisiti: 1. Il CDA deve essere enantiopuro o perlomeno la sua purezza enantiomerica deve essere nota. 2. La reazione del CDA con entrambi gli enantiomeri deve essere quantitativa o perlomeno le velocità relative dei due processi devono essere note 3. Il CDA non deve racemizzare nelle condizioni di derivatizzazione o nel corso dell analisi e le condizioni di reazioni devono essere sufficientemente i t blande da non far racemizzare il substrato t 4. Per l analisi NMR il CDA deve avere un gruppo funzionale che fornisce un singoletto e che risuona in zone libere dello spettro per facilitare l integrazione. Per l analisi HPLC il CDA deve avere un gruppo cromoforo Purezza enantiomerica del CDA Analita (R + S) + CDA (R ) Analita (S) + CDA (R + S ) Analita (S + R) + CDA (R + S ) R-R R + S-R S-R + S-S S S-R + R-R R + S-S S + R-S Con un CDA e Analita con un ee= 90% Analita + CDA (0.95 S R) (0.95 R S ) R-R R + S-R + R-S + S-S S (R-R R + S-S ) S ) + (S-R + R-S ) = = 90.5 : 9.5 ee misurato = 81%

18 Chiral Derivating Agents (CDAs) Ph MeO CF 3 O OH Acido di Mosher (±) H L 3 L XH 2 + CF 3 Ph Cl MeO O L 3 L 2 H O X CF 3 OMe Ph + H O CF 3 L 2 X L 3 Ph OMe X=O, NH Analisi dei prodotti via NMR: Ph MeO CF 3 O OH -OMe 1 H NMR; -CF CF F NMR Chiral Derivating Agents (Estere di Mosher) ee= 7.8%

19 Analisi dei prodotti via NMR: Eventualmente l aggiunta di uno shift reagent come Eu(fod) 3 (fod=6,6,7,7,8,8,8-heptafluoro-2,2-dimetil-3,5-ottandionato) aiuta a differenziare ulteriormente i segnali diastreoisomerici Il rapporto si determina via integrazione dei segnali

20 Chiral Derivating Agents (Estere acido mandelico) ee= 11.7% Acido di Mosher vs acido mandelico

21 Achiral Derivating Agents Agente derivatizzante achirale bifunzionalizzato AX 2 = COCl 2, CH 2 (COCl) 2, C 6 H 4 (COCl) 2, Me 2 SiCl 2, Ph 2 SiCl 2, PCl 3 Agente derivatizzante achirale bifunzionalizzato Risoluzione parziale Miscela R:S=90:10 (ee=80%) dl = 81:1, ee= 98.8% (82%)

22 Cromatografia con fasi chirali (HPLC & GC) Vantaggi: 1. Non vi sono problemi di risoluzione cinetica derivanti dalla derivatizzazione con un reagente chirale enantiopuro. 2. L ordine di eluizione di due enantiomeri può fornirci la configurazione assoluta (se nota o per serie di composti simili). 3. Elevata sensibilità dell analisi dei rivelatori per HPLC o per GC (eventualmente si può derivatizzare l analita). 4. Efficace separazione dei due enantiomeri grazie all uso di tecniche ad elevata efficienza (HPLC e GC) che facilitano l integrazione. Il metodo è particolarmente adatto per analizzare compioni ad elevato arricchimento enantiomerico. Modo d uso: 1. Analisi del racemo e ottimizzazione della separazione 2. Confronto con un campione a configurazione nota 3. Pre-trattamento del campione da analizzare senza influenzarne le caratteristiche. Arricchimento enantiomerico per cromatografia Formazione di complessi etero e omochirali (il fenomeno non si osserva con i composti racemi)

23 Cromatografia: principi base t 0 = tempo in cui la fase mobile attraversa la colonna (nessuna interazione) t R = tempo di ritenzione i del soluto V 0 = volume morto V R = volume di ritenzione κ = rapporto di capacità = A s /A m A s = quantità di soluto nella fase stazionaria A m = quantità di soluto nella fase mobile Rapporto di capacità= κ'=a s /A m =(t R -t o )/t o Fattore di separabilità = α = κ 2 '/ κ 1 '=(t R2 -t o )/ (t R1 -t o ) G = -RT lnα α = 1.1 (25 C) α = e G/RT G =56cal/mol

24 Selettività vs Energia Libera Il G G è significativo perché vi è un amplificazione dell interazione Risoluzione R S = 2(t R2 -t R1 )/(w 1 +w 2 ) w = ampiezza

25 Racemizzazione della fase stazionaria Racemizzazione dell analita nel corso dell analisi Meccanismo di azione - interazione a tre punti G G molto piccoli (ca 50 cal/mol)! Legami ad idrogeno, interazione π π

26 Colonne chirali HPLC tipo Pirkle Fase stazionaria chirale Soluto chirale Colonne chirali HPLC tipo Pirkle

27 Colonne chirali HPLC tipo Pirkle Substrati non funzionalizzati: analisi GC

28 Substrati non funzionalizzati Colonne HPLC CHIROBIOTIC CHIROBIOTIC V Possono essere usati in tre diversi tipi di modalità: Modalità inversa Modalità organica polare Modalità normale

29 CHIROBIOTIC V Colonne HPLC - CHIROBIOTIC CHIROBIOTIC T CHIROBIOTIC TAG