Progetto PRAL 2003/14

Transcript

1 Progetto PRAL 2003/14 Impiego di lieviti con prticolri proprietà enologiche, selezionti nell Regione Lzio, per il migliormento dell qulità dei vini. RISULTATI DELLA RICERCA ENC - Velletri

2 Indice Sommrio... pg. 3 Aspetti metodologici e tecnologici... pg. 5 Aspetti fermenttivi... pg. 35 Nuovi pprocci per l tipizzzione molecolre di lieviti di interesse enologico... pg. 43

3 SOMMARIO Il presente progetto è il frutto di un collorzione tr CRA - Unità di ricerc per le produzioni enologiche dell Itli centrle VELLETRI (già Istituto Sperimentle per l Enologi), e il Diprtimento di Biologi Cellulre e dello Sviluppo (BCS) dell Università Spienz di Rom. Tle collorzione, già sperimentt con successo negli nni pssti, si giov delle competenze complementri sull fermentzione sviluppte di due gruppi di ricerc coinvolti, nonché dell divers tipologi di strumentzione presente nei lortori dei due Enti. Il gruppo coordinto dl Dr. Getno Ciolfi h mturto un lung esperienz principlmente sugli spetti metolici e tecnologici dell fermentzione mentre il gruppo coordinto dl Prof. Cludio Flcone si occup prevlentemente dello studio genetico e molecolre dei lieviti vinri. Lo scopo principle di quest collorzione è quello di pprofondire d un lto l effetto dell composizione dei mosti e delle condizioni di fermentzione sull qulità del vino e, dll ltro, di migliorre le tecniche di identificzione dei lieviti per comprendere il ruolo di ceppi specifici nel processo di vinificzione. Presso il CRA sono stte effettute prove di fermentzione in presenz/ssenz di ossigeno, zoto e clcio pntotento, utilizzndo due differenti ceppi di lievito e uve con diverso grdo di mturzione, llo scopo di verificre l possiilità di indurre produzioni elevte di composti respoili dell composizione chimic ed orgnolettic dei vini, quli cidi orgnici, cidi grssi, esteri e glicerin. Su tutte le prove sono stte eseguite completmento dell fse di fermentzione nlisi chimico-fisiche, seorili e sttistiche dei vini ottenuti. Le prove sperimentli presso il CRA, come si evince dll trttzione, hnno confermto come l impiego del lievito S6U (irido con crtteristiche fenotipiche riferiili ll rzz fisiologic uvrum) si d preferire in ogni fermentzione e questo perché esprime l meglio l tipicità del vino per i seguenti motivi: contriuisce mntenere lto il vlore di cidità totle e questo rppresent un grnzi di stilità strutturle del vino; produce, in ogni condizione, vlori di glicerin più elevti, quindi il vino ssume connotti di corposità che esltno il rpporto con il territorio; un minore produzione di solfiti gevol un rzionle impiego fine fermentzione e determin un migliore comptiilità mientle. D un punto di vist dei trttmenti l mosto è risultto che: l impiego di ossigeno nel corso dell fermentzione risult ininfluente i fini del risultto metolico del lievito; l impiego di zoto v limitto soltnto i csi di effettivo impoverimento del mezzo, csi rrissimi nelle condizioni di un rzionle enotecnic che non deve prevedere eccessi di chirific. Spesso, inftti, si tende d ddizionre zoto mmonicle nell intento di prevenire rllentmenti o rresti di fermentzione che sono l coeguenz dell mnct rimozione di iniitori e l cus di trttmenti deproteinizznti troppo spinti. Al rigurdo si evidenzi come l impiego di zoto mmonicle deprim le qulità tipiche dell uv poiché rllent il metolismo degli minocidi e peptidi del mezzo; ne coegue che l mggiore tipicità del prodotto v perseguit ttrverso opportune tecniche colturli volte proprio ll migliore espressione del metolismo vritle. Impiegndo lieviti in purezz o con inoculo sclre, si riscontr che nelle prove sclri i principli metoliti sono presenti in concentrzioni inferiori rispetto lle fermentzioni in purezz. Per i motivi discussi successivmente nel testo, ppre evidente come l condott delle fermentzioni de essere opert d un solo lievito l fine di poter ottenere il migliore risultto metolico prevediile e che, nel corso di

4 fermentzioni sclri, il risultto metolico complessivo non può essere coiderto come il rfforztivo delle singole peculirità m, eì, come l ppittimento delle specifiche tendenze metoliche. Questo ftto ppre importnte soprttutto qundo si vogliono esltre le qulità compositive del mosto di prtenz, quindi delle uve e dell miente di provenienz. Infine, recenti risultti di Berovic e Herg (2007) hnno indicto che un inoculo di lievito sottoposto shock termico è in grdo di produrre un incremento del 74% di glicerin nel corso dell fermentzione lcolic. Dt l importnz delle impliczioni di tli risultti, imo voluto verificre l loro vlidità medinte prove sperimentli effettute nelle medesime condizioni opertive descritte dgli Autori. I nostri risultti, ottenuti nche utilizzndo dosi di lievito inoculo differenti, non hnno però indicto lcun vrizione nell concentrzione di glicerolo fine fermentzione. Presso il Diprtimento BCS è stto sviluppto un nuovo sistem molecolre per l identificzione dei lieviti vinri sto sull presenz dei geni che codificno per le lcool deidrogensi (ADH). Il sistem h il vntggio di presentre un doppio controllo in qunto coente di cominre l nlisi del DNA mplificto di ciscun gene e dei reltivi frmmenti di restrizione (RFLP) con il rilevmento delle ttività enzimtiche (zimogrmm) ADH presenti in ciscun ceppo. I ceppi di lievito nlizzti, isolti prevlentemente dll uv, di mosti e dl vino, provengono dlle collezioni del CRA di Velletri e del Diprtimento di Biologi Vegetle dell Università di Perugi. Nel lievito S. cerevisie, il sistem ADH è costituito d quttro geni ltmente coervti (ADH1, 2, 3 e 5) che codificno per ttività enzimtiche che sono fondmentli per l formzione dell etnolo prtire dgli zuccheri presenti nei mosti. L conoscenz delle sequenze nucleotidiche del ceppo di S. cerevisie utilizzto come controllo h permesso di disegnre coppie di primers specifici per l mplificzione di ciscuno dei quttro geni ADH. Quest tecnic h permesso di ottenere frmmenti di DNA di tgli divers specifici per ciscun gene. L mplificzione è stt effettut nche su tutti e quttro i geni contempornemente medinte PCR multiplex llo scopo di ottenere più velocemente un impront molecolre dei ceppi in esme. L digestione dei prodotti di PCR ottenuti con Su3AI, un enzim di restrizione che riconosce le sequenze GATC, e l successiv seprzione dei frmmenti su gel, ci h permesso di ottenere un polimorfismo di restrizione più dettglito e specifico per ciscun lievito nlizzto. Per un successiv verific dell vlidità del metodo, queste tecniche ste sul DNA è stt ffinct l nlisi delle ttività enzimtiche ADH codificte di singoli geni. Quest tecnic, d noi mess punto su minigel e che non richiede pertnto un tempo eccessivo, coiste nell seprzione elettroforetic degli isozimi ADH presenti negli estrtti proteici dei lieviti che vengono poi visulizzte medinte un specific colorzione per ttività. In tl modo è stto possiile definire per ogni ceppo nlizzto uno specifico zimogrmm delle ttività ADH che, confrontto con l nlisi del DNA, h potuto confermre l presenz/ssenz dei rispettivi geni. Di coeguenz, il sistem cominto DNA enzim potree coentire di seguire con precisione le percentuli d impinto dei vri ceppi durnte l fermentzione. Il Coordintore del progetto Prof. Cludio Flcone

5 CRA-Unità di ricerc per le produzioni enologiche dell Itli centrle Velletri Regione Lzio, Progetto PRAL 2003/14: Impiego di lieviti con prticolri proprietà enologiche, selezionti nell Regione Lzio, per il migliormento dell qulità dei vini. ASPETTI METABOLICI E TECNOLOGICI Fvle Stefno, Polo Pietromrchi, Domenico Tieri, Alerto Cedroni, Aldo Grofolo, Getno Ciolfi Premess Nelle vrie fsi che si susseguono durnte il processo tecnologico dell vinificzione, quell dell fermentzione lcolic è sicurmente un degli spetti più sentiti nel mondo enologico, proprio perchè è durnte questo processo iochimico che si determinno le crtteristiche compositive ed orgnolettiche dei vini. Coiderto l interesse rivolto questo rgomento dll industri enologic, l ricerc scientific è d tempo impegnt d ffrontre le prolemtiche legte l iochimismo cellulre del lievito, oltre d pprofondire le conoscenze sugli spetti che possono indurre nomlie quli rresti di fermentzione o fermentzioni stentte. Nonostnte i numerosi progressi relizzti in cntin (controllo dell tempertur, ecc.), si può coiderre che l gestione dell fermentzione è ncor lungi dll essere ottimizzt. In effetti, un dto

6 fondmentle in enologi è rrmente preso in coiderzione, ed in modo impreciso: l vriilità dell mteri prim. Il monitorggio in line dell cinetic fermenttiv (per or ncor un utopi) può servire non solo migliorre il controllo dell ndmento delle fermentzioni, m nche, e soprttutto, pilotrne il controllo. Quest nozione di pilotggio coiste nell dttre gli interventi (tempertur, ggiunte di nutrienti etc.) in funzione dello svolgimento dell fermentzione. A reve o medio termine, coisterà nche in nticipre, grzie d un predizione (modellizzzione) dell ndmento fermenttivo e nel prendere in coiderzione non solo i criteri tecnologici (completmento delle fermentzioni, coumo di frigorie ) m nche criteri più qulittivi. È ormi dimostrto, dll lettertur, come lcuni elementi costituiscno veri e propri fttori limitnti lo sviluppo e il metolismo del lievito, in prticolre: l ossigeno risult essere necessrio i lieviti per sintetizzre cidi grssi e steroli nell fse di crescit eroic, l zoto (sotto form ssimilile) è necessrio ll crescit cellulre dei lieviti e clcio pntotento, respoile dell sintesi di Acetil-coenzim A per un corretto impiego di cetto di derivzione intrcellulre. Seene l fermentzione lcolic si svolg in un miente neroico, è ormi dimostrto come il ruolo dell ossigeno nei mosti influenzi l produzione di numerosi composti e contriuisc ll completezz gusto-olfttiv dei vini; fino d oggi, però, l importnz di questo elemento è stt vlutt soprttutto per ciò che ttiene ll incidenz sull frzione fenolic del mosto e poco si s sull funzione di questo elemento sul metolismo cellulre in condizione di fermentzione neroic. Il ruolo dell ossigeno è generlmente fvorevole ll qulità dei vini, in modo prticolre nell vinificzione in rossi, nche se è necessrio che dosi e modlità d impiego sino strettmente controllte. Diverse e recenti tecniche di vinificzione prevedono l somministrzione rgiont dell ossigeno durnte le fsi che susseguono nell trsformzione d uv vino nche in condizioni di iperossiggenzione. L microssigenzione, durnte l fse di mturzione e ffinmento dei vini, o l contrrio, le vinificzioni in riduzione, eseguite cercndo di limitre l minimo il conttto dei mosti e dei vini con l ossigeno, dimostrno l importnz che riveste questo elemento in enologi. È perciò necessrio rpportre queste tecniche sempre l tipo di uv oggetto di lvorzione in coiderzione dell differente rispost legt ll composizione nlitic del mosto. Uve romtiche (d esempio moscto ) o con lto contenuto di precursori romtici (tr cui si può nnoverre nche l Mlvsi del Lzio) possono essere trttte si con tecniche in riduzione si in ossidzione. Per uve che possiedono un sso contenuto romtico, viene preferit in vinificzione in riduzione, l fine di cercre di mntenere quest dotzione ltrimenti compromess con ossigenzione. Uve dl spore neutro, che pportno i coeguenti vini profumi e romi derivnti dll sol fermentzione lcolic, sono generlmente trttte con techiche ossidtive, che contriuiscono un migliore stilità del vino e d un uso ridotto di solfiti. Le principli esperienze del ruolo dell ossigeno nell fermentzione vinri furono eseguite d RieruGyon e d Slyrolles, i quli, oltre cottre il ruolo fondmentle che riveste nell sintesi lipidic e nell formzione di grndi quntità di steroli e cidi grssi, determinrono che l quntità di ossigeno necessri l corretto svolgimento di questo processo si d coiderrsi tr i 5 e ml/l di ossigeno, somministrto nell fse esponenzile di crescit cellulre del lievito (circ due giorni dopo l inoculo). Si deve Moutonet e d ltri ricerctori di Montpellier i primi studi sull microssigenzione, tecnic nt dll intuizione di ricrere condizioni redox in un mosto o in un vino, vinificto in sertoio in cciio inox, simili quelle che si verificno in un rrique. Si è ccertto che l pporto di ossigeno in fse di ffinmento in un rrique vri d 0,6 3 ml/l/mese in funzione dell tipologi di legno utilizzto e dl grdo di permezione delle doghe, che diminuisce con il tempo di utilizzo (Ferrrini et l., 2001). Alcuni studiosi riportno come mosti fermentti con lieviti Scchromyces cerevisie, in ssenz di ossigeno inizile, producno fine fermentzione vini con più sse concentrzioni di lcoli superiori ed esteri, mentre mosti ddizionti di ossigeno presentno più lti contenuti di questi composti. In presenz

7 di ossigeno inizile, però, è più elevto il contenuto in lcoli superiori scpito degli esteri, per cui il miglior rpporti tr questi due composti induce pere che il non impiego di ossigeno inizile poss incrementre le proprietà seorili dei vini ottenuti (Vlero, et l., 2002). Altre ricerche hnno indgto sull influenz che determin l ddizione di ossigeno durnte l fermentzione sugli steroli contenuti nelle fecce (lisi o scorse) di lievito e l rettività delle stesse nei confronti dell ossigeno. Studi condotti d Croline Forniron-Bonnefond (2003) hnno investigto sull potenzile relzione tr ossigeno ggiunto ceppi di lievito enologici commercili durnte l fse di fermentzione lcolic e l interzione tr fecce di lievito e ossigeno. Sull se di queste indgini, ggiunte di ssi ed eccessivi contenuti di ossigeno, rispettivmente di (7 mg/l) e (37 mg/l), ll fine dell crescit cellulre, sono stti comprti in termini di ripercussioni sull ttività di coumo dell ossigeno delle corrispondenti fecce di lievito. D ciò è emerso che l somministrzione di ossigeno d prte delle cellule di lievito durnte l fermentzione h un influenz positiv sull cinetic di fermenttiv, incrementndo l tempo stesso l formzione di iomss delle cellule. Si è ltresì osservto che i tssi di coumo di ossigeno e l cpcità di coumo d prte delle fecce di lievito, diminuisce qundo l ossigeno viene somministrto durnte l fermentzione. Contempornemente si è registrto un incremento dell sintesi dell ergosterolo e l degrdzione degli steroli ossigeno dipendenti. Tle degrdzione vviene qundo l ossigeno è somministrto in dosi eccessive. Sull se di questi studi risult fondmentle vere un controllo diretto dell ossigenzione dei mosti durnte l FA si per ottimizzre l cinetic fermenttiv, si per controllre l rettività che hnno le fecce di lievito nei confronti dell ossigeno. Diversi studi hnno evidenzito come il contenuto di zoto presente nei mosti contriuiscno ll qulità compositiv e seorili del vino. Mosti che presentno ssi contenuti di zoto prontmente ssimilile, fondmentle per l crescit cellulre dei lieviti e di coeguenz del vigore fermenttivo, vnno incontro rischi di rresti fermenttivi, cinetiche di fermentzione stentte o lente, fvorendo l produzione di tioli non desiderti (es. idrogeno solforto) e lcoli superiori, con sse produzioni di esteri e cidi grssi. Di contro, lti contenuti di zoto ssimilile, oltre determinre vigorose fermentzioni, fvoriscono l formzione di etil cetto, cido cetico e cidità voltile (Bell S., Hechke P., 2005). Altri studi, svolti presso l INRA di Montpellier e cordinti d Jen Mrie Sryrolles, hnno evidenzito che l disponiilità di zoto ssimilile non h influenz sul completo svolgimento dell fermentzione (esurimento degli zuccheri presenti), m che tle dotzione influenzi l velocità di vvio dell fermentzione, i tempi in cui quest rggiunge il mssimo coumo degli zuccheri e sull ltezz del picco di mssim velocità di fermentzione (intes come quntità di zuccheri coumt, o di CO2 sviluppt, nell unità di tempo). Alcune ricerche hnno pprofondito gli spetti e dimostrto nche le interzioni che vvengono in mosti sintetici tr zoto ssimilile e cido pntotenico presenti in dosi vriili. In mezzi sintetici contenenti 250 μg/l l produzione di idrogeno solforto (H2S) diminuisce d 480 μg e 420 μg 4-6 e 80 μg rispettivmente qundo il contenuto in zoto ssimilile è incrementto d mg/l. l contrrio il contenuto di H2S viene incrementto qundo ll umento di zoto prontmente ssimilile coincide un sso vlore di cido pntotenico (Wng et l., 2003).

8 Scopo del lvoro Dll dismin delle cquisizioni si sono volute pprofondire le conoscenze circ l possiilità di indurre produzioni elevte, durnte l fse di fermentzione lcolic, di lcuni dei composti respoili dell composizione chimic ed orgnolettic dei vini, quli cidi orgnici, cidi grssi, esteri e glicerin. A tl fine sono stte llestite e condotte presso il CRA-Unità di ricerc per le produzioni enologiche dell Itli centrle (già Istituto Sperimentle per l Enologi) un serie di prove di fermentzione nlizzndo l interzione che si registr nel mezzo utilizzndo due differenti ceppi di lieviti enologici isolti presso il CRA-ENC, in presenz o ssenz, di ossigeno, zoto e clcio pntotento, su un mosto d Mlvsi puntint (o del Lzio) (foto 1 e 2) ottenuto d uve rccolte mturità fisiologic m con uno stto snitrio differente. Le uve provenivno dl vigneto sperimentle presso l unità di ricerc sede del Centro Dimostrtivo Regionle ARSIAL e d ess condotto (foto3). Tutte le fermentzioni sono stte condotte 25 C fino llo svolgimento di un grdo lcolico del 4%, per poi concludere l FA d un tempertur costnte di 18 C. Su tutte le prove oggetto di studio sono stte eseguite completmento dell fse di fermentzione nlisi chimico-fisiche, seorili e sttistiche dei vini ottenuti. Foto 1

9 Foto 2 Foto 3

10 Mterili e metodi L prov sperimentle è stt eseguit presso il CRA-ENC Unità di ricerc per le produzioni enologiche dell Itli centrle di Velletri. É stt impiegt uv Mlvsi del Lzio, rccolt mnulmente in due msse distinte: l prim mss, denomint MQ (Mlvsi di Qulità) è stt effettut sottoponendo le uve cernit mnule, scrtndo i grppoli in non perfetto stto snitrio; l second mss, denomint MS (Mlvsi Stndrd), è stt effettut simulndo un rccolt meccnizzt, quindi rccogliendo tutti i grppoli presenti sulle pinte, nche quelli in non perfetto stto snitrio. Per ciscun delle msse di uv, di circ 1500 kg cdun, si è seguito lo stesso protocollo di vinificzione in inco, che h previsto nelle prime fsi di lvorzione le seguenti operzioni: dirspo-pigitur, presstur e solfitzione omogene del mosto (50 mg/l), chirificzione sttic (senz usilio di dditivi) per 24 ore 8 C. Trscorso tle tempo è stt spillt un mss omogene di 900L, per ciscun prov, e riprtit in fermentini in cciio inox AISI 316 termocondizionti. Su ciscun fermentino è stt vvit l fermentzione lcolic utilizzndo due distinti ceppi di lievito isolti presso il CRA-ENC, lievito Scchromyces cerevisie r.f. uvrum S6U e lievito Scchromyces cerevisie AT1. I lieviti sono stti scelti in virtù delle loro crtteristiche metoliche le più comptiili con l tipologi di vini dell rele lzile. Le condizioni opertive sui fermentini, uguli per entrme le prove (MQ e MS), hnno previsto condizioni differenti di fermentzione lcolic in presenz o ssenz di ossigeno, zoto e clcio pntotento, e sono di seguito rissunte nello schem riportto in Tell 1. Tutte le prove oggetto di studio, fine fermentzione lcolic, sono stte sottoposte d nlisi chimiche e fisiche, inoltre, per ogni prov si sono eseguiti trttmenti di chirific, stilizzzione trtric e proteic, filtrzione ed infine vvite ll fse di imottiglimento. Dopo circ 3 mesi dl loro confezionmento in ottigli, tutti i vini sono stti sottoposti d esme orgnolettico e seorile. Le prove sono stte llestite presso l cntin sperimentle del CRA-Unità di ricerc per le produzioni enologiche dell Itli centrle di Velletri impiegndo un impinto pilot (foto 4) dimeionto per effetture fermentzioni sperimentli, impinto finnzito totlmente con fondi regionli ttrverso convenzioni e progetti PRAL (2000/44, 2002/59, 2003/22) In foto 5 si evidenzi il prticolre strumentle del microossigentore. Foto 4

11 Foto 5 11

12 Schem opertivo N fermentino Lievito AT1 S6U AT1 S6U AT1 S6U AT1 S6U AT1 S6U Ossigeno NO NO NO NO NO NO SI SI SI SI Azoto SI SI NO NO SI SI NO NO SI SI Clcio Pntotento SI SI NO NO NO NO NO NO NO NO Lievito: le dosi di inoculo utilizzte sono stte per il lievito S6U di 20 g/hl (peso secco) e di lievito AT1 in dose di 2 Milioni cellule/m L sotto form di mosto di vvimento. Il lievito S6U, isolto nell rele lzile, per le sue qulità metoliche e tecnologiche viene prodotto industrilmente dll società Lllemd-Llvin e distriuito in tutte le ree enologiche del Pinet. Questo lievito h ottenuto un espresso riconoscimento d studiosi di tutto il mondo; primenti il Centro per l Sperimentzione in Vitivinicoltur di Veron e l Università degli studi di Veron lo hnno indicto come il miglior lievito per l produzione di vini in Vlpolicell. Si trtt di un lievito irido nturle con crtteristiche fenotipiche dell rzz S. uvrum (Tosi,Zpproli,2005). Il lievito AT1, isolto nch esso nell rele lzile è uno dei migliori ceppi dell rzz fisiologic cerevisie ed è stto preferito per le sue qulità romtiche e metoliche. Ossigeno: quttro prove sono stte trttte fornendo ossigeno (Rivoir S.p.A.) in dose complessiv di 2,5 ml/l per die, somministrto medinte microssigentore (ditt Tecnl) d intervlli regolri di 30 minuti nell rco delle 24 ore. Azoto ssimilile: sull se delle nlisi eseguite dopo pigidirsptur, presstur e omogeneizzzione dell mss, è stto ggiunto zoto prontmente ssimilile, sotto form di solfto (50%) e fosfto di mmonio (50%), fino rggiungere un contenuto nel mosto complessivo di 237 mg/l ed ggiunto in un unic somministrzione ll inizio dell fermentzione. Clcio Pntotento: sui fermentini interessti è stto fornito clcio pntotento in dose di 1 mg/l e somministrto in unic soluzione ll inizio dell fermentzione. Anlisi chimiche: sulle tutte le prove oggetto di studio sono stte eseguite nlisi chimico-fisiche secondo le metodiche ufficili riportte sull G.U. delle Comunità Europee L.272 del 3//1990. Le nlisi dei composti voltili sono stte eseguite secondo i metodi Ginnotti S., Di Stefno R. (1991) e Di Stefno R. (1991). Anlisi sttistiche: tutti i dti ottenuti dlle nlisi chimicho-fisiche sono stti trttti con Test ANOVA (α = 0.05). Anlisi Seorili: circ tre mesi dopo il loro confezionmento in ottigli, i vini ottenuti dlle prove MQ e MS sono stti sottoposti d esme orgnolettico utilizzndo il Test di Krmer (o dell ordimnento) ttrverso il qule il pnel di degusttori è stto chimto d esprimere un giudizio di grdevolezz complessivo, ordinndo i vini in ordine crescente di grdimento. 12

13 Risultti delle prove sperimentli Di seguito vengono riportte le principli nlisi chimico-fisiche dei mosti di prtenz, ci sono differenze significtive, l prov MS evidenzi un mosto proveniente d uve con rccolt posticipt, lo si deduce dll concentrzione zuccherin (20,43 % per MQ contro, 22,8 % per MS), dll cidità titolile in vlore superiore ll MQ, dl contenuto in APA livello inferiore. Purtroppo nell prov MS si evidenzi un contenuto in cidità voltile elevto (0,92 g/l fronte dello 0,16 per l prov MQ), questo ftto dimostr come l snità delle uve er lqunto compromess. Per un certo verso, l cos è stt volut e progrmmt proprio l fine di vlutre l eventule incidenz dell cido cetico sul metolismo del lievito m nche per individure eventuli differenze dovute ll divers tipologi di zoto presente; inftti, con lo svilupprsi dell muff grigi l su crescit impone l idrolisi di prte del contenuto proteico dell cino e coeguente coumo di prte dell zoto minocidico dello stesso. A riprov di ciò, le nlisi evidenzino come l APA presente nel mosto MS si inferiore quello in MQ. Nell llestire le prove, quindi, quell su mosto MS conterrà un quntittivo di zoto mmonicle superiore l mosto MS tle, però, d preggire il vlore finle di APA. Anlisi dei mosti di prtenz PROVA MQ (Tell 1) Zuccheri ph Ac. Titolile APA* (mg/l) SO2 totle Ac. Voltile deità 20 C 20,43 3,37 6, ,16 1,0801 *Azoto mmonicle, per le prove che lo prevedevno, è stto ddizionto fino rggiungere vlore di 237 mg/l: 150 mg/l sotto form di fosfto e 150 mg/l di solfto. PROVA MS (Tell 2) Zuccheri ph Ac. Titolile APA* (mg/l) SO2 totle (mg/l) Ac. Voltile deità 20 C ,44 7, ,92 1,0925 * Azoto mmonicle, per le prove che lo prevedevno, è stto ddizionto fino rggiungere 237mg/L : 234mg/L sotto form di fosfto e 234 mg/l di solfto. Di seguito sono riportti i dti reltivi lle nlisi chimico-fisiche dei vini (tell 3 e 4) ottenuti nonché le elorzioni sttistiche nche dei composti voltili (dll tell 5 18). In tell 19 vengono riportte le principli significtività sttisticmente ccertte indicndo con il segno più e meno il vlore mggiore e il minore in termini ssoluti; per lcuni prmetri, ritenuti ugulmente importnti si è voluto sottolinere il significto del vlore riscontrto pur non essendo, questo, sttisticmente significtivo. Tli vlori sono stti indicti con un cerchietto. 13

14 ANALISI DEI VINI PROVA MQ (Tell 3) nlisi Alcol % vol deità 20 C ,75 11,56 11,65 11,59 11,7 11,16 11,65 11,38 11,68 11,45 0, ,9931 0,9927 0, , , , , , ,9935 estrtto totle g/l 21,6 22,4 21,3 21,9 21,3 23,2 21,3 22,2 21,5 22,6 ph 3,38 3,32 3,4 3,35 3,32 3,23 3,4 3,33 3,33 3,28 cidità voltile g/l 0,17 0,19 0,21 0,14 0,14 0,16 0,17 0,18 0,18 0,17 cidità titolile g/l 6,07 6,90 5,92 6,9 6,15 7,65 6,11 7,27 6,26 7,2 SO2 totle mg/l 37,76 27,52 33,92 23,04 31, ,76 20, ,48 l dominnte (P.O. 1cm) 574, , , , , , , , ,5 575,972 luminosità y% (P.O. 1cm) 98,63 96,52 96,05 95,44 95,99 94,85 96,74 95,48 96,32 95,14 sturzione P% (P.O. 1cm) 5,63 5,15 5,53 5,21 5,96 5,98 5,59 6,15 5,55 6,04 s 420 nm (P.O. 1cm) 0,077 0,074 0,081 0,081 0,084 0,09 0,081 0,091 0,081 0,089 flvni vnillin mg/l di (+)- ct. 38,97 48,85 55,25 50,02 64,56 41,29 50,02 51,76 43,04 55,83 polifenoli totli mg/l di (+)- ct. 177,18 184,64 183,52 173,45 173,07 195,45 190,60 185,75 180,91 180,91 cidi ICT Acido cffeico mg/l 34,67 34,33 35,44 35,44 36,11 33,78 36,67 35,56 36,22 36,00 cido mlico g/l 2,34 2,67 2,42 2,61 2,34 2,66 2,37 2,66 2,42 2,69 cido lttico g/l 0,01 0,01 0,02 0,03 0,01 0,03 0,01 0,02 0,02 0,02 cetldeide mg/l glicerin g/l 4,8 6,1 5,1 6,1 5,5 6,7 5,4 6,5 5,4 6,4 14

15 ANALISI DEI VINI PROVA MS (Tell 4) nlisi Alcol % vol deità 20 C ,60 13,48 13,53 13,61 13,37 13,47 13,41 13,58 13,52 13,49 0, ,9934 0, ,9937 0, , ,9948 0, , ,99340 estrtto totle g/l 31,5 28,4 31,3 28,8 34,6 29,1 33,8 28,6 32,2 29,1 estrtto ridotto g/l 26,8 27,23 27,41 zuccheri g/l 7,8 7,57 5,79 ph 3,48 3,36 3,53 3,45 3,48 3,35 3,53 3,44 3,47 3,33 cidità voltile g/l 0,60 0,56 0,74 0,61 0,59 0,58 0,66 0,62 0,6 0,58 cidità titolile g/l 6,66 7,47 6,45 7,37 6,45 7,67 6,45 7,35 6,45 7,83 SO2 lier mg/l 1,92 2,11 2,37 2,18 1,54 1,28 1,28 1,28 1,92 1,92 SO2 totle mg/l 36,48 36,48 33,92 39,04 33,28 26,88 38,4 30,4 39,68 24,96 ceneri g/l 3,02 2,89 2,9 2,87 3,11 3,1 2,92 2,89 3,06 3,07 lclinità delle ceneri meq/l 31,44 31,12 35,5 34,66 31,2 30,4 36,68 36,3 31,16 30,44 577, ,325 l dominnte (P.O. 1cm) 575, , , , , , , ,281 luminosità y% (P.O. 1cm) 88,66 77,49 84,65 77, 87,60 80,79 86,50 78,72 86,18 80,39 sturzione P% (P.O. 1cm),75 18,89 14,85 20,20 11,29 16,59 12,65 17,74 12,59 16,81 s 420 nm (P.O. 1cm) 0,188 0,316 0,241 0,337 0,198 0,284 0,217 0,304 0,217 0,281 29,66 33,73 31,41 32,57 36,06 29,08 27,34 36,06 28,50 32,57 199,56 195,08 208,88 198,06 202,17 189,11 209,63 2,00 196,20 192, 35,56 38,44 37,11 38,78 36,00 37,00 36,67 40,78 34,33 39,00 flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l 15

16 ANALISI DEI VINI PROVA MS (Tell 4) nlisi cido trtrico g/l 2, 2,25 2,04 2,18 2,13 2,21 1,98 2,09 1,96 2,21 cido mlico g/l 1,93 2,28 2,01 2,42 1,83 2,18 2,07 2,46 1,97 2,37 cido lttico g/l 0,07 0,04 0,04 0,05 0,13 0,17 0,06 0,06 0,13 0,12 cetldeide mg/l glicerin g/l 6,1 7,6 6,6 7,2 6,8 7,9 7 7,5 6,9 8,1 ANALISI STATISTICA DEI COMPOSTI VOLATILI (MQ+MS) (Tell 5) MQ MS Numero di dti 20 medi dev.st. medi dev.st. isomil cetto esil cetto fenil cetto S Acetti ,171 0,021 0,614 0,052 (S Acetti/Ac. Acetico) x etil C etil C etil C S Esteri etilici C C C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi 0,115 0,007 0,131 0,013 C C lcol isomilico pentnolo esnolo lcol enzilico Acido cetico (g/l) UVA

17 ANALISI STATISTICA DEI COMPOSTI VOLATILI (MQ+MS) (Tell 5) 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol 11,56 0,18 13,51 0,08 deità 20 C 0, , , ,00094 estrtto totle g/l 21,9 0,7 30,7 2,3 ph 3,33 0,05 3,44 0,07 cidità voltile g/l 0,17 0,02 0,61 0,05 cidità titolile g/l 6,64 0,61 7,02 0,57 SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) 575,09 0,82 577,31 1,08 luminosità y% (P.O. 1cm) 96,12 1,07 82,81 4,38 sturzione P% (P.O. 1cm) 5,68 0,34 15,24 3,30 s 420 nm 0,083 0,006 0,258 0,053 flvni vnillin mg/l di (+)- ct polifenoli totli mg/l di (+)- ct cidi ICT Acido cffeico mg/l 35,4 0,9 37,4 1,9 cido mlico g/l 2,5 0,2 2,2 0,2 cido lttico g/l 0,02 0,01 0,09 0,05 cetldeide mg/l 15,3 4,7 25,9 6,7 glicerin g/l 5,8 0,6 7,2 0,6 (P.O. 1cm) UVA 17

18 LIEVITO (Tell 6) PROVA MQ+MS Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto Acetti Acido cetico (g/l) ( Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C Esteri etilici C6 C8 C Acidi grssi Esteri etilici/ Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l S6U medi , , ,48 0, ,6 3,34 0,38 7, ,95 87,19 11,88 0, ,9 2,5 0,06 19,5 7,0 dev.st , , ,11 0, ,4 0,07 0,22 0,31 7 1,44 8,82 6,59 0,117 2,3 0,2 0,05 2,3 0,7 AT1 medi , , ,59 0, ,0 3,43 0,41 6, ,45 91,73 9,04 0, ,9 2,2 0,05 21,7 6,0 dev.st , , ,95 0, ,0 0,08 0,25 0,23 3 1,12 5,43 3,72 0, ,9 0,2 0,05 11,0 0,8

19 (Tell 7) PROVA (MQ+MS) Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l 20 NO 12 medi , , ,54 0, ,3 3,39 0,39 6, ,25 89,48,50 0, ,1 2,3 0,05 20,7 6,4 OSSIGENO SI 8 dev.st. medi ,237 0, ,014 0, ,03 12,52 0, , ,8 26,4 0,08 3,39 0,24 0,40 0,62 6, ,52 576,13 7,88 89,43 5,78,39 0,3 0, ,5 36,9 0,3 2,4 0,05 0,06 7,6 20,5 1,0 6,7 dev.st , , ,05 0, ,1 0,09 0,24 0,62 8 1,49 7,42 5,19 0, ,0 0,3 0,05 8,6 0,9 19

20 (Tell 8) PROVA (MQ+MS) Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l SI 12 medi , , ,52 0, ,5 3,36 0,38 6, ,13 89,88, 0, ,0 2,3 0,06 20,4 6,5 AZOTO NO 8 dev.st. medi ,218 0, ,013 0, ,02 12,55 0, , ,9 26,2 0,08 3,43 0,22 0,42 0,64 6, ,50 576,31 7,37 88,83 5,12,99 0,093 0, ,6 37,1 0,3 2,4 0,06 0,04 8,3 20,9 1,0 6,4 dev.st , , ,06 0, ,1 0,07 0,26 0,57 7 1,52 8,15 6,14 0, ,9 0,2 0,02 7,6 0,8

21 (Tell 9) PROVA (MQ+MS) Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l 20 SI 4 medi , , ,60 0, ,0 3,39 0,38 6, ,86 90,32,11 0, ,8 2,3 0,03 22,0 6,2 CPANTOTENATO NO 16 dev.st. medi ,232 0, ,011 0, ,09 12,52 0, , ,8 26,4 0,07 3,39 0,23 0,40 0,58 6, ,02 576,29 9,57 89,25 6,38,54 0,115 0, ,9 36,6 0,3 2,3 0,03 0,06 9,2 20,3 1,1 6,6 dev.st , , ,02 0, ,0 0,09 0,24 0,63 7 1,37 7,26 5,37 0, ,8 0,3 0,05 7,7 0,9 21

22 ANALISI STATISTICA DEI COMPOSTI VOLATILI (Tell ) PROVA MQ Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l 22 LIEVITO S6U 5 medi , , ,43 0, ,5 3,30 0,17 7, ,69 95,49 5,71 0, ,0 2,7 0,02 19,2 6,4 dev.st , , ,17 0, ,5 0,05 0,02 0,31 4 0,74 0,63 0,48 0, ,9 0,0 0,01 3,0 0,3 AT1 5 medi , , ,69 0, ,4 3,37 0,17 6, ,49 96,75 5,65 0, ,8 2,4 0,01 11,4 5,2 dev.st , , ,04 0, ,1 0,04 0,03 0,12 3 0,30 1,09 0,17 0, ,8 0,0 0,01 1,3 0,3

23 (Tell 11) PROVA MQ Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l OSSIGENO NO 6 medi , , ,57 0, ,0 3,33 0,17 6, ,18 96,25 5,58 0, ,0 2,5 0,02 15,8 5,7 dev.st , , ,21 0, ,7 0,06 0,03 0,67 8 0,90 1,30 0,35 0, ,9 0,2 0,01 5,6 0,7 SI 4 medi , , ,54 0, ,9 3,34 0,18 6, ,96 95,92 5,83 0, ,1 2,5 0,02 14,5 5,9 dev.st , , ,15 0, ,6 0,05 0,01 0,61 9 0,80 0,74 0,31 0, ,5 0,2 0,01 3,3 0,6 23

24 (Tell 12) PROVA MQ Tell 12 Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l 24 AZOTO SI 6 medi , , ,55 0, ,1 3,31 0,17 6, ,11 96,24 5,72 0, ,2 2,5 0,02 15,3 5,8 dev.st , , ,22 0, ,7 0,05 0,02 0,65 8 0,93 1,34 0,34 0, ,1 0,2 0,01 5,5 0,7 NO 4 medi , , ,57 0, ,7 3,37 0,18 6, ,06 95,93 5,62 0, ,8 2,5 0,02 15,3 5,8 dev.st , , ,13 0, ,5 0,04 0,03 0,64 8 0,76 0,61 0,39 0, ,6 0,1 0,01 3,8 0,6

25 (Tell 13) PROVA MQ Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l CPANTOTENATO SI 2 medi , , ,66 0, ,0 3,35 0,18 6, ,46 97,57 5,39 0, ,5 2,5 0,01 17,5 5,5 dev.st , , ,13 0, ,6 0,04 0,01 0,59 7 0,34 1,50 0,34 0, ,2 0,2 0,00 7,8 0,9 NO 8 medi , , ,53 0, ,9 3,33 0,17 6, ,25 95,75 5,75 0, ,7 2,5 0,02 14,8 5,9 dev.st , , ,19 0, ,7 0,06 0,02 0,65 8 0,85 0,63 0,33 0, ,9 0,1 0,01 4,2 0,6 25

26 (Tell 14) PROVA MS Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l 26 LIEVITO S6U 5 medi , , ,53 0, ,8 3,39 0,59 7, ,21 78,90 18,04 0, ,8 2,3 0,09 19,8 7,7 dev.st , , ,06 0, ,3 0,06 0,02 0,21 6 0,37 1,66 1,51 0, ,4 0,1 0,06 1,6 0,4 AT1 5 medi , , ,49 0, ,7 3,50 0,64 6, ,41 86,72 12,43 0, ,9 2,0 0,09 32,0 6,7 dev.st , , ,09 0, ,5 0,03 0,06 0,09 3 0,67 1,51 1,59 0, ,1 0,1 0,04 2,3 0,4

27 (Tell 15) PROVA MS Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l OSSIGENO NO 6 medi , , ,51 0, ,6 3,44 0,61 7, ,31 82,72 15,43 0, ,1 2,1 0,08 25,5 7,0 dev.st , , ,09 0, ,4 0,07 0,06 0,55 4 1,24 5,01 3,88 0, ,3 0,2 0,05 6,3 0,7 SI 4 medi , , ,50 0, ,9 3,44 0,62 7, ,30 82,95 14,94 0, ,7 2,2 0,09 26,5 7,4 dev.st , , ,07 0,002 2,5 0,08 0,03 0,69 7 0,96 3,97 2,72 0, ,8 0,2 0,04 8,2 0,6 27

28 (Tell 16) PROVA MS Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l 28 AZOTO SI 6 medi , , ,49 0, ,8 3,41 0,59 7, ,14 83,52 14,49 0, ,7 2,1 0,11 25,5 7,2 dev.st , , ,07 0, ,4 0,07 0,02 0,64 6 1,27 4,55 3,38 0, ,8 0,2 0,05 7,6 0,8 NO 4 medi , , ,53 0, ,6 3,49 0,66 6, ,55 81,74 16,36 0, ,3 2,2 0,05 26,5 7,1 dev.st , , ,09 0,004 2,4 0,05 0,06 0,53 4 0,80 4,54 3,30 0, ,9 0,2 0,01 6,1 0,4

29 (Tell 17) PROVA MS Numero di dti isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 etil C6 etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 C S Acidi grssi S Esteri etilici/s Acidi grssi C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide dietil succinto 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Alcol % vol deità 20 C estrtto totle g/l ph cidità voltile g/l cidità titolile g/l SO2 totle mg/l l dominnte (P.O. 1cm) luminosità y% (P.O. 1cm) sturzione P% (P.O. 1cm) s 420 nm (P.O. 1cm) flvni vnillin mg/l di (+)- ct. polifenoli totli mg/l di (+)- ct. cidi ICT Acido cffeico mg/l cido mlico g/l cido lttico g/l cetldeide mg/l glicerin g/l CPANTOTENATO SI 2 medi , , ,54 0, ,0 3,42 0,58 7, ,25 83,08 14,82 0, ,0 2,1 0,06 26,5 6,9 dev.st , , ,08 0, ,2 0,08 0,03 0,57 0 2,08 7,90 5,76 0, ,0 0,2 0,02,6 1,1 NO 8 medi , , ,50 0, ,9 3,45 0,62 7, ,32 82,74 15,34 0, ,5 2,2 0, 25,8 7,3 dev.st , , ,08 0,000 2,4 0,07 0,05 0,61 6 0,93 3,97 3,04 0, ,0 0,2 0,05 6,5 0,5 29

30 (Tell 18) SCHEMA RIASSUNTIVO DELLE SIGNIFICATIVITA STATISTICAMENTE ACCERTATE Composti Mosto di prtenz Lievito Ossigeno MQ MS uvrum cerevisie 2-fenil cetto n.s. n.s. Acetti ( Acetti/Ac. Acetico)x esteri etilici + Acidi grssi ( esteri etilici/cidi grssi) si no Azoto si no Clcio Pntotento si no n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. + - n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. etil-3-oh-utirrto + - etil-4-oh-utirrto n.s. n.s. ++ nidride solforos totle n.s. n.s. cidità titolile n.s. cido mlico 2-feniletnolo + - n.s. n.s n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. -- n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. cido cetico n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. glicerin n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s Legend colori: = generle (MQ+MS); = MQ (Mlvsi di Qulità); = MS (mlvsi Stndrd); Legend vlori: + = mggiore produttore; - = minore produttore; = sttisticmente non significtivo, tendenz concordnte. 30

31 Figur n. 1 31

32 Commento dei risultti Anlizzndo l lettertur rigurdnte il controllo del metolismo del lievito, ppre evidente come l stess ci conced un notevole quntità di prove in cui l visione d ssieme è sempre molto limitt e i trttmenti, effettuti in condizioni prticolri, spesso risultno difficilmente riproduciili. Il significto di queste prove, dunque, può essere ricondotto l vlore di tendenz metolic, ppre, però, difficile individure l dinmic dei fenomeni iochimici che interessno il metolismo dell cellul del lievito nel corso dell fermentzione. Inftti, nonostnte i numerosi progressi relizzti in cntin (controllo dell tempertur, ecc.), si può coiderre che l gestione dell fermentzione è ncor lungi dll essere ottimizzt. In effetti, un dto fondmentle in enologi è rrmente preso in coiderzione, ed in modo impreciso: l vriilità dell mteri prim.il monitorggio in line dell cinetic fermenttiv (per or ncor un utopi) può servire non solo migliorre il controllo dell ndmento delle fermentzioni, m nche, e soprttutto, pilotrne il controllo. Quest nozione di pilotggio coiste nell dttre gli interventi (tempertur, ggiunte di nutrienti ) in funzione dello svolgimento dell fermentzione. A reve o medio termine, coisterà nche in nticipre, grzie d un predizione (modellizzzione) dell ndmento fermenttivo e nel prendere in coiderzione non solo i criteri tecnologici (completmento delle fermentzioni, coumo di frigorie ) m nche criteri più qulittivi. Come riportto in premess, imo notizie precise sull funzione dell zoto come ccelertore del metolismo cellulre e dell ccresciuto ssorimento e metolismo degli zuccheri, come pure dell zione dell ossigeno sull futur proile evoluzione dell componente polifenolic del mezzo, dell zione del clcio-pntotento qule regoltore, in cso di crenz, del processo di iosintesi delle molecole prtire d cetto. Aimo pure en chire le differenze metoliche legte lle due tipologie di metolismo riconduciili ll espressione fenotipic uvrum e quello di tipo cerevisie (Grof olo,ciolfi, Lo Sclzo,1995). Nel cso dell presente indgine, si è voluto llestire un esperimento complesso, impiegndo mezzi differenti e trttmenti differenti l fine di individure le rispondenze metoliche che potessero comportre un più puntule coiderzione sull impiego di lieviti in riferimento ll tipologi di vino lzile soprttutto per ciò che ttiene ll componente fiss (cidità) e romtic di fermentzione, ovvero per quell componente che crtterizz l corposità, l persistenz l finezz delle sezioni olftto-gusttive. Nello specifico, un oiettivo importnte è stto quello di vlutre il significto dell presenz di glicerin e di come fosse possiile ottenere il mssimo dell su espressione nei vini. I due tipi di mosto oggetto dell sperimentzione MS e MQ, si trtt dell stess uv in differenti condizioni di stto in cui l elemento discriminnte è dto dl diverso contenuto in cido cetico inizile (cidità voltile pri 0,16 per MQ e 0,92 per MS), ed è questo il principle fttore di regolmentzione dell sintesi dei composti metolici. D un punto di vist sttistico, il test di significtività è stto pplicto su tutti i trttmenti per evidenzire l incidenz del mezzo (MQ,MS) tell 5, l incidenz del lievito (uvrum, cerevisie) tell 6, quindi rispettivmente di ossigeno tell 7, zoto tell 8, clcio-pntotento tell 9. I prmetri sttisticmente significti, inftti, risultno essere per l prov (MQ) un più coistente presenz di cetti, esteri etilici, cidi grssi, etil-3-oh-utirrto, cido mlico. Per contro l second serie (MS) f registrre differenze significtive positive in merito gli indici di esterificzione, cetldeide e glicerin. Questo diverso comportmento metolico risult fcilmente riconduciile ll presenz, nel mezzo, di elevt concentrzione di cido cetico; questo, inftti, nel corso dell fermentzione viene rissorito dll cellul come dimostr l su concentrzione finle e v d interferire con cetto di derivzione mitocondrile (fig.1). Elemento significtivo è un mggiore concentrzione in glicerolo, è un ftto, 32

33 questo, importnte e d tenere in coiderzione qundo viene progrmmt l vendemmi. Dl punto di vist dei trttmenti, l impiego di ossigeno nel corso dell vinificzione non comport lcun evento metolico sttisticmente significtivo e, pertnto, non trov lcun giustificzione prtic dl punto di vist metolico per il lievito. In effetti l sintesi dei grssi di cui si er ipotizzto essere influenzt dll ossigeno è regolt dl uon utilizzo di cetto intrcellulre su volt medito d micronutrienti di ntur proteic che il lievito non è in grdo di sintetizzre in neroiosi m che è presente nel mosto fresco. L impiego di C-pntotento, può vere un effetto metolico sttisticmente significtivo soltnto per l sintesi di 2-feniletnolo nel seo che l su presenz comport un minore produzione. Il ftto trov un giustificzione in qunto l disponiilità di un migliore utilizzzione di cetto intrcellulre comport un minor metolismo di minocidi romtici. Coiderto che non è uspicile un minore presenz di 2-feniletnolo nel mezzo, il C-pntotento può essere impiegto soltnto in presenz di un evidente crenz. Un mggiore disponiilità di zoto sotto form mmonicle, quindi di immedit utilizzzione, comport significtivmente soltnto un minore produzione di 2-feniletnolo e prllelmente di cido cetico; inftti, l disponiilità di zoto prontmente ssimilile, d un lto comport un minor metolismo degli minocidi romtici, dll ltro, un migliore utilizzo di cetto intrcellulre soprttutto di derivzione mitocondrile venendo ridursi quello di origine minocidico. Di prmetri riscontrti, si evidenzi, comunque, che pur non essendo significtiv l differenz, il 2-feniletnolo in termini ssoluti registr vlori più ssi l dove è minore il contenuto in APA zoto fcilmente ssimilile; in tl cso imo un minori disponiilità minocidic così come prevediile per l tesi MS. Per quest ultim prov, inftti, l condizione di minore snità delle uve h comportto nche un minore disponiilità minocidic. Anche questo risultto evidenzi come l impiego di zoto mmonicle in fermentzione de essere limitto soltnto i csi di effettiv crenz; deficit zotti nei mosti nturli che non ino suito trttmenti di chirific spinti non hnno rgione di essere ed è ene ricordre, perltro, che eccedere in trttmenti di chirific può comportre grvi prolemi di fermentzione e produzioni eccessive di cido cetico per un impoverimento del mezzo delle frzioni zotte peso molecolre sso quli gli minocidi e i piccoli peptidi ssimilili dl lievito. Prove sperimentli, inftti, hnno dimostrto che un eccessivo impoverimento dell frzione zott può cusre rllentmenti ed rresti di fermentzione e il fenomeno è legto soprttutto ll sportzione di micronutrienti proteici respoili del controllo metolico dell cellul, micronutrienti che, in condizioni di neroiosi, il lievito non è in grdo di sintetizzre. E vero che l somministrzione di zoto mmonicle comport un ccelerzione del metolismo degli zuccheri e quindi dell fermentzione, questo ftto, però, non corrisponde un metolismo di migliore qulità nel precostituire un vino ottimle e rispettoso dell miente di produzione. Vedimo, or, i riscontri metolici sttisticmente significtivi qundo mettimo confronto i due lieviti nell iieme delle prove e riscontrimo che cerevisie si crtterizz per l mggiore produzione di cetti, solfiti, cidità voltile, così come nelle spetttive, mentre uvrum si crtterizz per un mggiore produzione di etile-3-oh- utirrto, cido mlico, m nche f registrre un vlore di cidità titolile superiore e di glicerin dell ordine di 1 g/l e nche più. Questi fti evidenzino il vntggio 33

34 compositivo di un fermentto d uvrum piuttosto che d cerevisie soprttutto in relzione d un componente cidic di mggiore complessità e di glicerin che conferisce corposità e rotondità. Per qunto rigurd l second serie di prove, in ggiunt ll significtività di cui i metolici elencti per l prim prov, cottimo, per uvrum, un mggiore produzione di esteri, cidi grssi e reltivi rpporti di esterificzione. Del perché di questo comportmento rispetto ll prim serie risiede in un mggiore disponiilità di cetto intrcellulre di cui si è prlto precedentemente. All fine del ciclo produttivo, i vini finiti sono stti sottoposti ll nlisi seorile. Nel sottoporre i vini quest nlisi si è voluto vlutre se tr i cmpioni oggetto di studio ci fossero delle differenze e quli risultssero i più pprezzti. E stto così possiile confrontre l spetto glole di ciscun vino (spetto visivo, olfttivo e gusttivo) e sull eventule grdimento d prte del coumtore. A tle rigurdo è stto utilizzto il test di Krmer o test dell ordinmento, il qule prevede che i degusttori sino chimti ordinre in successione decrescente, dl più grdito l meno grdito, tutti i cmpioni sottoposti d nlisi. Il pnel er formto d 12 degusttori esperti i quli sono stti sottoposti i cmpioni in form nonim, ed è stto chiesto loro di ordinre secondo l metodic già descritt tli cmpioni. Le nlisi dei risultti sono stte poi elorte utilizzndo l tell del test di Krmer (Uigli, 2004). Dll elorzione di tli dti è emerso che i cmpioni che hnno riscosso mggior grdimento, presentno differenze seorili sttisticmente significtive: Prov MQ Al primo posto il vino n 2 (ottenuto dl trttmento con lievito S6U, senz ggiunt di ossigeno e con ggiunt di zoto e clcio pntotento); l secondo posto il vino n 5 (ottenuto dl trttmento con lievito AT1, senz ggiunt di ossigeno e clcio pntotento, con ggiunt di zoto). Prov MS Al primo posto il vino n 5 (ottenuto dl trttmento con lievito AT1, senz ggiunt di ossigeno e clcio pntotento, con ggiunt di zoto); l secondo posto il vino n 4 (ottenuto dl trttmento con lievito S6U, senz ggiunt di ossigeno, clcio pntotento e zoto). Nel corso delle prove, come si evince dll trttzione, imo rilevto un elevto numero di prmetri che vengono proposti per un nlisi più prticolre d oper del tecnico o dello studioso. Volendo fornire un giudizio sintetico e riepilogtivo, si può ffermre come il lievito S6U si d preferire in ogni fermentzione e questo perché mggiormente rispondente ll tipicità del vino per i seguenti motivi: - contriuisce mntenere lto il vlore di cidità totle e questo rppresent un grnzi di stilità strutturle del vino; - produce, in ogni condizione, vlori di glicerin più elevti, quindi il vino ssume connotti di corposità che esltno il rpporto con il territorio; - un minore produzione di solfiti gevol un rzionle impiego fine fermentzione e determin un migliore comptiilità mientle. D un punto di vist dei trttmenti si evidenzi che: - l impiego di ossigeno nel corso dell fermentzione risult ininfluente i fini del risultto metolico dell cellul di lievito; - l impiego di zoto v limitto soltnto i csi di effettivo impoverimento del mezzo, csi rrissimi nelle condizioni di un rzionle enotecnic che non deve prevedere eccessi di chirific. Spesso, inftti si tende d ddizionre zoto mmonicle nell intendo di prevenire rllentmenti o rresti di fermentzione. In reltà questi ccidenti o sono coeguenz di iniitori non rimossi o sono l cus di trttmenti deproteinizznti troppo spinti. Al rigurdo si evidenzi come l impiego di zoto mmonicle deprim le qulità tipiche dell uv poiché rllent il metolismo degli minocidi e peptidi del mezzo; ne coegue che l mggiore tipicità del prodotto v perseguit ttrverso opportune tecniche colturli volte proprio ll migliore espressione del metolismo vritle. 34

35 Aspetti fermenttivi: FERMENTAZIONI SCALARI CON IMPIEGO DI DUE CEPPI SACCHAROMYCES CEREVISIAEE CON CARATTERISTICHE METABOLICHE DIFFERENTI. Introduzione Il ruolo che i lieviti enologici svolgono nel corso dell fermentzione lcolic è sicurmente fondmentle per l uon riuscit dell stess e dei prodotti metolici che vengono elorti seguito dell trsformzione degli zuccheri in lcol; prodotti, respoili delle crtteristiche orgnolettiche e seorili dei vini ottenuti. Certmente l utilizzo di ceppi di lievito selezionti d uso enologico, possono contriuire dre un impront l vino e ll su definizione qulittiv, nche se l pporto primrio nell composizione enochimic del vino rimne quello dto dl vitigno e dll qulità dell uv. Negli ultimi tempi l ricerc h posto un grnde ttenzione ll selezione e studio dei diversi ceppi di lievito venti crtteristiche enologiche, nche in funzione dei metoliti che essi sono in grdo di produrre nel corso dell loro ppliczione in fermentzione. Questo lvoro di ricerc h vuto come fine quello testre e verificre l possiilità di indurre l produzione di elevti quntittivi di metoliti nel corso dell fermentzione lcolic impiegndo lieviti differenti per tipologi di metolismo ipotizzndo un interzione tle d coentire il rfforzmento delle reciproche peculirità. Inftti, numerose sono stte le prove sperimentli in tl seo impiegndo, però, lieviti di specie diverse. Fr le tnte prove eseguite si segnlno i risultti di Kurit (2008); l Autore h effettuto prove con l impiego, in ssocizione, di Scchromyces cerevisie e Pichi noml. Il risultto metolico h coentito di ppurre come l ttività di sintesi di cetti è risultt potenzit in virtù dell migliore predisposizione metolic d prte di Picchi legt d un ttività estersic cellulre di livello superiore. Per questo sono stti utilizzti due ceppi di lievito Scchromyces cerevisie: S6U, irido nturle con fenotipo dell rzz fisiologic uvrum e AT1 dell rzz cerevisie. Il primo si crtterizz per un elevt produzione di cidi grssi, glicerin, feniletnolo, migliore cpcità esterosintetsi; il secondo per un elevt produzione di cetti. Uno dei prmetri mggiormente significtivi è rppresentto dl contenuto in glicerolo di un vino; nche su questo composto si sono concentrte ttenzioni e studi volti d esltrne l espressione metolic. Mterili e metodi L prov è stt condott presso il CRA-Unità di ricerc per le produzioni enologiche dell Itli centrle (CRA-ENC) con sede in Velletri (Rom). Per l eseguimento di quest ricerc è stt utilizzt uv di Mlvsi del Lzio, rccolt mturità fisiologic in dt 02//07 e conferit nei locli dell cntin sperimentle del CRA-ENC. Il rccolto, di circ 0 kg, è stto sottoposto lle operzioni di vinificzione che hnno contemplto in sequenz l fse di pigidirsptur e presstur soffice, quest ultim eseguit con idropress pressione crescente fino 1r. Sull mss è stt ftt ggiunt di nidride solforos in dose di 50 mg/l. Di seguito il mosto h suito l fse di chirific prefermenttiv, eseguit tempertur di 6 C per 24 h senz usilio di codiuvnti di chirific. Le crtteristiche chimiche del mosto, dopo le fsi preliminri di pigidirsptur e presstur, sono di seguito riportte in tell 1. 35

36 Anlisi sul mosto di prtenz (Tell 1) Anlisi sul mosto di prtenz Zuccheri % ph Ac. Titolile (g/l) APA (mg/l) Deità 21 C Ac. Voltile (g/l) 20,08 3,38 5, ,0764 0,16 Trscorso tle tempo è stt eseguit l spilltur del mosto limpido e dopo omogeneizzzione dell mss ottenut, si è proceduto riprtire 4 litri di mosto negli 8 fermentini oggetto di studio, dell cpcità di 5 litri cduno. Le prove sono stte contrssegnte e inoculte con lieviti selezionti seguendo lo schem riportto in tell 2. Clssificzione delle prove oggetto di studio (Tell 2) Fermentino sigl 1 S6U TQ 1 BIS S6U TQ 2 AT1 TQ 2 BIS AT1 TQ 3 S6U SCAL 3 BIS S6U SCAL 4 AT1 SCAL 4 BIS AT1 SCAL lievito S6U S6U AT1 AT1 S6U S6U AT1 AT1 dose 20 g/hl 20 g/hl 80 ml del mosto di vvimento 80 ml del mosto di vvimento 20 g/hl 20 g/hl 80 ml del mosto di vvimento 80 ml del mosto di vvimento modlità prov prov in purezz prov in purezz prov in purezz prov in purezz prov ferm. sclre vvit con S6U prov ferm. sclre vvit con S6U prov ferm. sclre vvit con AT1 prov ferm. sclre vvit con AT1 L fse di fermentzione lcolic è stt vvit utilizzndo 2 ceppi di lievito diversi, lievito S6U llo stto secco e lievito AT1 nelle dosi di 2,5 Milioni di cellule/ml circ. Per ciscun prov, eseguit in doppio, è stto seguito un protocollo di vinificzione che h previsto un gestione dell tempertur controllt di vinificzione nel seguente modo: dll inoculo del lievito fino l rggiungimento di un grdiente lcolico nel mosto di 4% vol. l tempertur di fermentzione è stt mntenut costnte 25 C; quindi l tempertur è stt portt 18 C fino ll svintur. Le fermentzioni delle prove 1 S6U TQ, 1 BIS S6U TQ, 2 AT1 TQ, 2 BIS AT1 TQ, sono stte condotte rispettivmente di lieviti S6U e AT1 in purezz. Le prove 3 S6U SCAL e 3 BIS S6U SCAL sono stte vvite ll fermentzione utilizzndo lievito S6U. Al rggiungimento di 4 grdi lcolici il mosto è stto filtrto sterilmente (con crtucci filtrnte di 0,45 micron e sotto cpp sterile) e di seguito reinoculto con il lievito AT1. Stesso procedimento è stto seguito per le prove 4 AT1 SCAL e 4 BIS AT1 SCAL, inoculte inizilmente con lievito AT1 e dopo ver rggiunto tenore lcolico di 4% vol. sono stte filtrte sterilmente e reinoculte con lievito S6U. Su tutte le prove sono stte eseguite nlisi chimico-fisiche, secondo metodo ufficile (Gzzett Ufficile delle Comunità europee L272/90 e Reg. CEE 2676/90), nlisi dei composti voltili (Ginotti S., Di Stefno R., 1991). Le elorzioni sttistiche sono stte eseguite utilizzndo ANOVA semplice e Test di Tukey. 36

37 Anlisi chimico-fisiche sui vini (Tell 3) 1 S6U TQ 1 BIS S6U TQ 2 AT1 TQ 2 BIS AT1 TQ 3 S6U TQ 3 BIS S6U TQ 4 AT1 TQ 4 BIS AT1 TQ Alcol % vol,95 11,12,65 11,03 9,43,12 9,79 9,42 deità 20 C 0, , , ,9945 1, , ,0014 1,00435 estrtto totle g/l 30,1 22,9 25,4 23,9 42,2 34, ,4 estrtto ridotto g/l 23,5 22, ,3 19,8 23,19 20,1 20,3 zuccheri g/l 7,6 1,1 6,4 3,6 23,4 11,91 18,9 25,1 ph 3,42 3,42 3,43 3,43 3,45 3,29 3,46 3,46 cidità voltile g/l 0,32 0,28 0,2 0,19 0,70 0,34 0,76 0,7 cidità titolile g/l 6,60 6,75 6,18 6,3 5,64 6,80 5,79 5,88 SO2 totle mg/l 22,40 23, ,16 20,48 12,80 25,6 21,11 575, , , , , , ,4 574,011 luminosità y% (P.O. 1cm) 96,16 96,80 97,27 97,11 96,36 95,48 97,17 96,94 sturzione P% (P.O. 1cm) 5,04 5,00 5,20 5,00 5,23 6,06 6,24 6,34 s 420 nm (P.O. 1cm) 0,071 0,071 0,075 0,072 0,085 0,097 0,089 0,092 flvni vnillin mg/l di (+)- ct. 54,67 52,93 47,11 51,76 26,75 25,59 31,99 30,24 polifenoli totli mg/l di (+)- ct. 168,22 164,87 182,40 178,67 167,48 168,04 171,95 181,84 cidi ICT Acido cffeico mg/l 33,67 33,89 34,33 34,78 44,33 47,56 45,56 45,89 cido mlico g/l 2,39 2,57 2,36 2,37 0 0, cido lttico g/l 0,03 0,02 0,03 0,01 1,77 0,03 1,91 1,92 cetldeide mg/l glicerin g/l 5,6 5,8 4,8 5 5,3 5,7 5,6 5,8 nlisi l dominnte 1cm) (P.O. 37

38 Anlisi dei composti voltili (Tell 4 ) COMPOSTI VOLATILI isomil cetto 1S6U TQ* AT1 TQ* S6U SCAL* AT1SCAL* 2155 esil cetto fenil cetto S Acetti ,30 0,20 0,52 0,73 15,19 55,61 5,50 4,32 etil C etil C etil C S Esteri etilici C C C S Acidi grssi ,11 0,12 0,08 0,09 C C lcol enzilico feniletnolo etil lttto cetoino nd etil-3-oh-utirrto enzldeide g-utirrolttone nd dietil succinto metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto Acido cetico (g/l) (S Acetti/Ac. Acetico) x -3 S Esteri etilici/s Acidi grssi lcol isomilico 1-pentnolo esnolo Not: I dti riportti in tell rppresentno l medi ottenut dlle due ripetizioni eseguite per ogni prov. (*) le prove 1S6U TQ e 2AT1 TQ sono stte condotte utilizzndo i ceppi di lievito indicti in purezz mentre le prove 3 S6U SCAL e 4 AT1 SCAL sono stte condotte di rispettivi lieviti (fino l rggiungimento di 4 % lcol) ed in seguito reinoculte rispettivmente con AT1 e S6U così come descritto in mterili e metodi. 38

39 Anlisi sttistic dei composti voltili (ANOVA un vi =0,05) (Tell 5) Risultti ANOVA un vi (=0,05) LSD: letter ugule gruppi omogenei 1S6u 2At1 3S6U SCAL 4At1 SCAL isomil cetto esil cetto c 2-fenil cetto S Acetti, (S Acetti/Ac. Acetico) x etil C6 c c etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 c c C S Acidi grssi c c S Esteri etilici/s Acidi grssi c d C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo,c c lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto etil-3-oh-utirrto enzldeide g-utirrolttone dietil succinto, 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto glicerin g/l Acido cetico (g/l) -3 39

40 Anlisi sttistic dei composti voltili (Test di Tukey) (Tell 6) Risultti ANOVA un vi (=0,05) Tukey: letter ugule gruppi omogenei 1S6u 2At1 3S6u SCAL 4At1 SCAL isomil cetto esil cetto 2-fenil cetto S Acetti,, (S Acetti/Ac. Acetico) x etil C6 c c etil C8 etil C S Esteri etilici C6 C8 c c C S Acidi grssi,,c c S Esteri etilici/s Acidi grssi c,c C4 C12 lcol isomilico 1-pentnolo esnolo, lcol enzilico 2-feniletnolo etil lttto, etil-3-oh-utirrto enzldeide g-utirrolttone dietil succinto, 3-metil-tiopropnolo etil-4-oh-utirrto N-(3-metil-utilcetmide) monoetilsuccinto glicerin g/l, Acido cetico (g/l) -3 40

41 Risultti e discussione In tell 3 e 4 sono riportti i dti reli riscontrti nei vini; in tell 4 e 5 vengono riportte le elorzioni sttistiche degli stessi. Di risultti ppre evidente come le crtteristiche metoliche dei due lieviti in purezz risultino confermte in relzione lle spetttive; si pone l ccento sul ftto che l rzz fisiologic cerevisie produce mggiori quntittivi di cetti e minor contenuto in cidi grssi come pure un minor contenuto in glicerin. Nel cso di fermentzioni sclri, si evidenzi come i principli metoliti si riscontrino in concentrzioni inferiori rispetto lle fermentzioni in purezz in qunto l ttività di rissorimento cellulre comprime l sintesi dei composti metolici e comprime, per coeguenz, nche l cpcità esterosintetsi: questo ftto vle si qundo d vvire l fermentzione si l rzz cerevisie, si con l rzz uvrum, per contro i due fermentti tendono d essere indistinti. Questo comportmento può essere dovuto in prte d un impoverimento del livello nutrizionle del mosto, m è soprttutto legto gli equiliri delle rezioni enzimtiche endocellulri qundo, nell fse di crescit del lievito d vvio dell fermentzione, risult prevlente l ssorimento dei metoliti dl mezzo. Per i motivi di cui imo discusso, ppre evidente come l condott delle fermentzioni de essere opert d un solo lievito l fine di poter ottenere il migliore risultto metolico possiile e che, nel corso di fermentzioni sclri, il risultto metolico complessivo non può essere coiderto come il rfforztivo delle singole peculirità m, eì, come l ppittimento delle specifiche tendenze metoliche. Questo ftto ppre importnte soprttutto qundo si vogliono esltre le qulità compositive del mosto di prtenz, quindi delle uve e dell miente di provenienz. Dll nlisi iliogrfic si evince come, recentemente, Berovic e Herg (2007) sseriscono che un inoculo di lievito sottoposto shock termico d 18 C 45 C per 20 minuti rggiunti in 5 minuti, cus un incremento di glicerin nel corso dell fermentzione lcolic del 74%. Questo risultto si coeguiree in qunto l innlzmento termico determin, nell cellul, un norme espressione di triosofosfto isomersi persistente durnte l fermentzione giudizio degli Autori; per coeguenz risulteree incrementt l conversione di diossicetone fosfto in glicerolo. Per verificre tle ipotesi, imo llestito diverse prove sperimentli nelle stesse condizioni opertive dettte dgli Autori e impiegndo nche dosi di lievito inoculo differenti prtire d quell impiegt nell esperimento, si llo stto secco che fresco senz riscontrre, però, lcun vrizione nell concentrzione di glicerolo fine fermentzione e impiegndo due stipiti di lievito differenti (AT1 llo stto fresco e S6U llo stto secco). 41

42 Biliogrfi - Amti, A., Arfelli, G., Cstellri, M., Simoni, M. (2000). Effetto dell ossigenzione controllt sull frzione fenolic dei vini rossi. Industri delle evnde XXIX: Bell, S., Hechke, P. (2005). Impliction of nitrogen nutrition. Austrlin Journl of Grpe nd Wine Reserch. 11, Autori vri, PRAL 2000/44 Identificzione e vlorizzzione dell iodiversità dei lieviti vinri. Università L Spienz Dip. Biol. Cellulre e dello Sviluppo, Istituto Sperimentle Enologi Velletri, Regione Lzio, Assessorto per le Politiche dell Agricoltur. - Berovic M., Herg M. (2007). Het shock on Scchromyces cerevisie inoculum increses glycerol production in wine fermenttion. Biotechnol Lett, 29: Buescher, W.A., Siler, C.E., Morris, J.R., Threlfll, R.T., Min, G.L., Cone, G.C. (2001). High Alcohol Wine Production from Grpe Juice Concentrtes. Am. J. Enol. Vitic., 52:4: Di Stefno, R. (1991). Proposl for method of smple preprtion for the determintion of free nd glucoside terpenes of grpes nd wines. Bull.O.I.V., 64: Ferrrini, R., Zironi, R., Celotti, E., D Andre, E. (2001). Ruolo dell ossigeno nei processi di vinificzione ed ffinmento dei vini. L Enologo 11: Forniron-Bonnefond, C., Aguer, E., Deytiex, C., Sroyrolles, J., Slmon, J. (2003). Impct of oxygen ddition during enologicl fermenttion on sterol content in yest lees nd their rectivity towrds oxygen. Journl of Bioscience nd Bioengineering. 95:5: Grofolo A.,Ciolfi G., Lo Sclzo R. (1995) Il controllo del metolismo secondrio del lievito. Bilogi Oggi, IX, n.1. - Gmon B., Monteil V:, Remize F., Cmrs C., Dequin S. (2006) Effects of GPD1 Overexpression in Scchromyces cerevisie Commercil Wine Yest Stri Lcking ALD6 Genes. Appl. Environ Microiol., July; 72(7): Gzzett Ufficile delle Comunità Europee L272 del 3//90, Regolmento CEE n 2676/90. Ginnotti, S., Di Stefno, R. (1991) Metodo per l determinzione dei composti voltili di fermentzione. L Enotecnico,, Guinrd, J.X., Nole, A.C. (1986). Proposition d une terminologie pour une description nlytique de l rôme des vi. Sc. Alim. 6, Miller, A.C., Wolff, S.R., Bisson, L.F., Eeler, S.E. (2007) Yest Strin nd Nitrogen Supplementtion: Dynmics of Voltile Ester Production in Chrdonny Juice Fermenttion. Am. J. Enol. Vitic. 58:4 - Kurit O. (2008). Increse of cette ester-hydrolysing esterse ctivity in mixed cultures of Scchromyces cerevisie nd Pichi noml. Journl of Applied Microiology, 4, 5 - Riéreu Gyon, P., Duourdieu D., Donèche B., Lonvud A. (1998). Trttto di Enologi vol. I Edgricole. - Riéreu Gyon, P., Duourdieu D., Donèche B., Lonvud A. (1998) Trttto di Enologi vol. II, Edgricole. - Slmon, J. (2006). Interction etween yest, oxygen nd polyphenols during lcoholic fermenttion: Prticl implictio. Food Science nd Tecnology. 39:9: Schneider, V. (1998). Must Hyperoxigention: A Review. Am. J. Vitic., Vol.49, 1: Tosi E, Zpproli G. (2005) I lieviti iridi impiegti in enologi:l esempio del ceppo industrile S6U, irido nturle Scchromyces cerevisie x Scchromyces uvrum, nell produzione di vino mrone dell Vlpolicell. rivist internet di viticoltur ed enologi, n. 11/2. - Uigli, M. (2004). I profili del vino. Il Sole 24 ore-edgricole. - Vlero, E., Moyno, L., Milln, M.C., Medin, M., Orteg, J.M. (2002). Higher lcohols nd ester production y Scchromyces cerevisie. Influence of the initil oxygention of the grpe must. Food Chemestry. 78:1: Wng, X.D., Bohlscheid, J.C., Edwrds, C.G. (2003). Fermenttive ctivity nd production of voltile compounds y Scchromyces grown in sintetic grpe juice medi deficent in ssimille nitrogen nd/or pnthotenic cid. Journl of Applied Microiology. 94:

43 Nuovi pprocci per l tipizzzione molecolre di lieviti di interesse enologico Respoile: Prof. Cludio Flcone * Prtecipnti ll ricerc: Dr.ss Mri Luis Sponziello Dr. Michele Sliol * Prof. Cludio Flcone TEL: (39) FAX: (39) cludio.flcone@unirom1.it 43

44 Tipizzzione molecolre di lieviti scchromyces di interesse enologico PREMESSA L identificzione dell composizione dell flor dei lieviti ll interno del mosto si rende necessri per il migliormento delle crtteristiche qulittive del vino. Trdizionlmente, l identificzione e l crtterizzzione di specie di lievito e di specifici ceppi ll interno dell stess specie si svno sull nlisi di trtti morfologici e soprttutto sulle loro crtteristiche fisiologiche specifiche. Queste crtteristiche sono però fortemente influenzte dlle condizioni di coltur e possono produrre risultti incerti e tlvolt non corretti. Recentemente sono stte sviluppte numerose tecniche molecolri innovtive che costituiscono vlidi metodi lterntivi in grdo di mettere in rislto l diversità genetic dei ceppi (Kellis et l.,2003; Richrd e Dujon 2006; Schuller et l., 2004). In tle mito, l mplificzione di sequenze di DNA specifiche trmite PCR è divenuto un metodo molecolre lrgmente utilizzto in qunto ltmente riproduciile. A quest tecnic sono stti successivmente ffincti metodi di nlisi più seiili quli l RAPD (Rndom Amplifiction of Polymorphic DNA) (Quesd e Cenis, 1995), l RFLP (Restriction Frgment Length Polymorphism) (Guillmon et l.., 1998) e l AFLP (Amplified Frgment Length Polymorphism) (Azumi nd Goto-Ymmoto, 2001). Negli nni più recenti tli tecniche sono stte impiegte per lo studio dell vriilità di sequenz di lcune regioni del genom, soprttutto di quelle in cui sono loclizzti i geni che codificno per gli RNA riosomili (rrna). In prticolre, sono stti nlizzti i domini D1/D2 dei geni codificnti per il 26S rrna (Litil et l.., 2006) e le regioni interne spzitrici trscritte (ITS) del cluster dei geni riosomili (26S, 18S e 5S) (Guillmon et l.., 1998; Grnchi et l.., 1999; Esteve-Zrzoso et l.., 1999). L ttenzione e stt rivolt nche llo studio del polimorfismo di singoli geni specifici coervti nei lieviti quli il 5S, Actin e Metionin 2 (Dniel e Meyer,2003; Antunovics et l.., 2005). Ad onor del vero, nessuno di questi metodi fino d oggi si è rivelto in grdo di grntire d solo risultti che coentno l identificzione cert di un specie o di un ceppo di lievito. A queste tecniche si possono ffincre ltre metodiche che però presentno lo svntggio di essere più complesse e che possono richiedere costose pprecchiture, quli l nlisi del criotipo medinte l impiego dell tecnic PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) (Crdinli e Mrtini, 1994). V menziont infine l nlisi del DNA mitocondrile (mtdna) che present un vriilità genetic intriec mggiore rispetto l DNA nuclere. Rimne pertnto importnte identificre nuove regioni vriili del genom che possno coentire l identificzione cert dei ceppi livello dell loro specie e, possiilmente, mettere in evidenz le differenze ll interno dell stess specie. A tle scopo, si è cercto di mettere punto un sistem discriminnte sto sull mplificzione dei geni ADH, presenti in tutti i lieviti, che codificno per ttività lcool deidrogensiche. I ceppi di lievito nlizzti, isolti prevlentemente dll uv, di mosti e dl vino, sono stti forniti dll Istituto Sperimentle per l Enologi di Velletri (or CRA-Unità di ricerc per le produzioni enologiche dell Itli centrle Velletri), e dl Diprtimento di Biologi Vegetle dell Università di Perugi. 44

45 MESSA A PUNTO DI UN NUOVO CRITERIO DI IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE AMPLIFICAZIONE DEL SISTEMA GENICO ADH Il metodo di screening genetico molecolre d noi utilizzto per discriminre i ceppi di lievito isolti dll Istituto Sperimentle per l Enologi di Velletri (or CRA-Unità di ricerc per le produzioni enologiche dell Itli centrle Velletri) si s sull nlisi del sistem delle lcool deidrogensi (ADH). Questo sistem è costituito d tre geni principli, chimti ADH1, ADH2 e ADH3, che codificno per ttività lcool deidrogensiche coinvolte nel metolismo dell etnolo (Cyricy 1975; 1979; Young e Pilgrim 1985). L espressione dei geni che compongono il sistem delle lcool deidrogensi viene regolt livello trscrizionle, in funzione del tipo di fonte di cronio disponiile per le cellule. In prticolre i geni ADH1e ADH2 codificno rispettivmente per le proteine enzimtiche Adh1p e Adh2p, entrme loclizzte nel citoplsm. ADH1 viene espresso in modo semicostitutivo e viene indotto d glucosio. Il gene ADH2 codific per un ttività respoile dell utilizzzione dell etnolo ccumulto durnte l fermentzione e ctlizz l conversione dell etnolo d cetldeide, con concomitnte riduzione del NAD+ NADH. L espressione del gene ADH2 viene repress in presenz di glucosio e indott su fonti di cronio respirili, come etnolo e glicerolo. In S.cerevisie esiste un terzo gene, ADH3, che codific per un lcool deidrogensi loclizzzione mitocondrile. L presenz di Adh3p ument di circ tre volte durnte l crescit su glicerolo. L isozim Adh3p prtecip d un sistem nvett etnolo-cetldeide cpce di regolre l equilirio redox NAD+/ NADH tr il citoplsm e il mitocondrio (Bkker et l., 2000). Esistono inoltre ltri geni ADH, quli ADH5, che semrno essere coinvolti nel metolismo degli lcoli superiori (Dickion et l., 2003). L scelt di questo sistem genico per il lvoro di crtterizzzione è stt effettut principlmente per due motivi: - i geni ADH sono presenti in tutti i lieviti fermenttivi in qunto necessri per l produzione di etnolo durnte l vinificzione prtire dlle lte concentrzioni zuccherine presenti nei mosti; - i geni ADH mostrno tr loro un lt omologi e potreero quindi costituire un uon sustrto per nlizzre le vrizioni ceppo e/o specie dipendente nell sequenz del loro DNA. Nel nostro lvoro di crtterizzzione è stto nlizzto il polimorfismo dei geni ADH1, ADH2, ADH3 e ADH5 medinte mplificzione per PCR utilizzndo specifici DNA primers per ciscun gene. L mplificzione dei geni ADH è stt condott si seprtmente sui singoli geni (PCR) che utilizzndo contempornemente le coppie di tutti i primers (vedi Tell in Mterili e Metodi) reltivi i 4 geni nello stesso tuo di rezione (PCR-multiplex). Per ottenere un profilo più dettglito del pttern dei DNA mplificti, questi sono stti sottoposti successivmente digestione medinte Su3AI, un enzim di restrizione che tgli con lt frequenz le molecole di DNA riconoscendo sequenze specifiche. Infine, imo cercto di mettere in relzione l ssenz dell mplificto dei singoli geni con l presenz/ 45

46 ssenz del corrispondente enzim. A tle scopo, dopo estrzione delle proteine cellulri, le singole ttività ADH sono stte seprte medinte elettroforesi su gel ntivi di crilmide e l loro presenz è stt confermt medinte un sggio di ttività sto su un colorzione specific. Per verificre l cpcità discriminnte del metodo di identificzione, l nlisi effettut su ceppi vinri di lievito forniti dl CRA-Unità di ricerc per le produzioni enologiche dell Itli centrle Velletri, è stt estes ceppi ottenuti dll collezione del Diprtimento di Biologi Vegetle (DBVPG) dell Università di Perugi, utilizzndo il ceppo di lortorio BY 4741 pprtenente ll specie Scchromyces cerevisie come riferimento. 46

47 Mterili e Metodi Ceppi, terreni e condizioni di coltur Le cellule di lievito sono stte coltivte 28 C in terreno YP liquido (1% estrtto di lievito, 2% peptone) su gittore rotnte ddizionto con Glucosio 1%. Tell dei ceppi nlizzti nel lvoro. * C-S6u deriv d un incrocio tr un ceppo di S.cerevisie e un ceppo di S.uvrum CEPPO SIGLA GENERE E SPECIE PROVENIENZA BY 4741 WT Scchromyces cerevisie r.f. cerevisie Diprtimento Biologi Cellulre e dello Sviluppo ROMA A Scchromyces cerevisie r.f. uvrum B-S11c 2 Scchromyces cerevisie r.f. cerevisie C-SC2 3 Scchromyces ynus C-S6u* 4 Scchromyces cerevisie r.f. uvrum D-S16 5 Scchromyces ynus E-AT1 6 Scchromyces cerevisie r.f. cerevisie F-S12c 7 Scchromyces cerevisie r.f. cerevisie DBVPG 1708 C2 Scchromyces cerevisie r.f. cerevisie DBVPG 1180 U1 Scchromyces cerevisie r.f. uvrum DBVPG 1391 U2 Scchromyces cerevisie r.f. uvrum DBVPG 6032 B1 Scchromyces ynus r.f. ynus DBVPG 6131 B2 Scchromyces ynus r.f. tuiformis DBVPG 1648 I2 Scchromyces cerevisie r.f. itlicus DBVPG 1369 H2 Scchromyces cerevisie r.f. chevlieri DBVPG 1976 H3 Scchromyces cerevisie r.f. chevlieri CRA Unità di ricerc per le produzioni enologiche dell Itli centrle VELLETRI Diprtimento di Biologi Vegetle PERUGIA 47

48 Estrzione di DNA totle d lievito I ceppi sono stti inoculti in terreno liquido e ftti crescere fino d un deità di 8 cellule/ml ll tempertur di 28 C sotto gitzione. Le cellule sono stte rccolte medinte centrifugzione, lvte con TE (Tris EDTA), e trttte con tmpone di estrzione (Triton X-0, SDS 1%, NCl 0mM, TE ph 8). L sospeione è stt trttt con PCI (fenolo,/chcl3/lcool isomilico in rpporto 25:24:1 rispettivmente) e le cellule sono stte sottoposte rottur meccnic con plline di vetro su vortex per 4 minuti. Dopo ggiunt di 0,2 ml di TE e dopo centrifugzione è stt recupert l fse cquos ed il DNA è stto precipitto con l ggiunt di tre volumi di etnolo 95. Dopo centrifugzione e rimozione dell etnolo il DNA veniv ridisciolto in TE+RNAsi per eliminre l contminzione dovut llo RNA. Amplificzione del DNA trmite PCR L mplificzione è stt eseguit utilizzndo il kit dell TKR SHUZO CO., LTD con le seguenti modlità: DNA 50ng MgCl2 25mM Tmpone PCRII X dntp 50µM Oligo Forwrd 50pmole/l Oligo Reverse 50pmole/l Tq polimersi 2,5U/l H2Odd Fino volume di 50μl Le condizioni di tempo e tempertur delle rezioni erno le seguenti: DENATURAZIONE: 5 minuti 94 C 30 CICLI Denturzione 30 secondi 94 C Iridzione 30 secondi 58 C Allungmento 45 secondi 72 C TERMINE ALLUNGAMENTO: 4 minuti 72 C I prodotti di mplificzione sono stti controllti su gel di grosio ll concentrzione del 1,2%. Il DNA è stto messo in evidenz medinte l ggiunt l gel di grosio di romuro di etidio ll concentrzione finle di 0,5mg/ml e medinte illuminzione con rggi UV. 48

49 Schem di mplificzione dei Geni ADH GENE ADH1 Primers Diretto 5 ATCCCAGAAACTCAAAAAGGTG 3 Tgli mplificto PCR Tempertur di iridzione p 58 C 990 p 58 C 1.0p 58 C 876 p 58 C Inverso 5 AGTGTCAACAACGTATCTACCA 3 ADH2 Diretto 5 CAAGTTGGAGCATAAGGATATC 3 Inverso 5 AGTGTCAACAACGTATCTACCA 3 ADH3 Diretto 5 ACGTCAACATTGTTCACCAGG 3 Inverso 5 AGTATCGACGACGTATCTACCC 3 ADH5 Diretto 5 TGGCCATTTCAATTGAAATTTCC 3 Inverso 5 AGTCTCAACAACATATCTACCA 3 Primers, dimeioni in pi di si (p) dei prodotti di PCR ttesi e tempertur di iridzione. 49

50 PCR (Polymerse Chin Rection) L PCR è un tecnic che prevede l mplificzione di un sequenz di DNA di cui si conoscono gli estremi. Per relizzrl si h isogno di: - Sequenz d mplificre - NTP (nucleoclosidi tri fosfti, come ATP, CTP, GTP, TTP) - Primer (Sequenze complementrie gli estremi dell sequenz d mplificre - TAQ (un polimersi estrtt d un termofilo, in grdo di non denturrsi d lte temperture) - Buffer (i tmponi necessri per l rezione di elongzione) L PCR vviene in un serie di cicli composti d tre fsi: - nell prim imo l seprzione dei frmmenti, fse che vviene d lte temperture - un fse di Anneling, ppimento, in cui i primer si ppiono filmenti - fse in cui l TAQ polimersi sfruttndo l OH liero fornito di primer, polimerizz usndo come stmpo l sequenz. Nel primo ciclo si h un dupliczione dl primer fino ll fine del frmmento, m ne cicli successivi si h l mplificzione dell sol sequenz compreso tr i due primers. 50

51 Digestione di molecole di DNA con endonuclesi di restrizione e loro nlisi Per l digestione delle molecole di DNA è stt ust 1 unità di enzim per µg di DNA. L rezione di tglio è stt effettut in un opportun soluzione tmpone specific per l enzim Su3AI) ll tempertur di 37 C. L esito dell digestione è stto controllto medinte elettroforesi su gel di grosio ll concentrzione finle del 2%. L cors elettroforetic è stt effettut d un voltggio costnte tr 50 e 150 Volts nel tmpone TBE (Tris Bse 89mM, cido orico 89mM, EDTA ph 8,3 2mM). I frmmenti di DNA prodotti sono stti messi in evidenz medinte l ggiunt l gel di grosio di romuro di etidio ll concentrzione finle di 0,5 mg/ml. Estrzione di proteine totli di lievito Le cellule provenienti d un precoltur contenente glucosio 2%, vengono seminte in tui tteriologici sterili contenenti 5 ml di terreno YP oppure in 20 ml di terreno minimo in eute, supplementto con le opportune fonti di cronio. Dopo crescit fino ll fse trdo-esponenzile, le cellule vengono centrifugte per minuti 3000 rpm 4 C e risospese in 180 µl di soluzione contenente TE 1X ( Tris-EDTA ph 7.4) e Triton-X0 llo 0.1% per ogni 0,1g di cellule. L rottur dell prete cellulre viene effettut meccnicmente per gitzione dell sospeione di cellule su vortex, dopo ggiunt di sferette di vetro del dimetro di 0.5mm. Tle trttmento dur circ minuti e l vvenut rottur viene verifict l microscopio ottico. I cmpioni vengono quindi centrifugti per 5 minuti rpm per eliminre il pellet cellulre e il superntnte recuperto viene centrifugto per ltri 5 minuti rpm permettendo l seprzione di un fse soluile. L quntità delle proteine totli presenti nei cmpioni in esme viene determint medinte un sggio colorimetrico ll lunghezz d ond di 595 nnometri utilizzndo il rettivo Brdford (Coomssie Brillnt Blu G250 0,01%, etnolo 4,7%, cido fosforico 8,5%) (Brdford, 1976). Seprzione elettroforetic delle proteine in condizioni non denturnti Le proteine degli estrtti cellulri sono stte seprte sull se ll cric elettric possedut medinte elettroforesi in condizioni non denturnti su gel di policrilmide l 5%. Il tmpone impiegto nell cors elettroforetic è così composto: Tris se 25 mm, glicin 192 mm, in cqu idistillt. Sono stti cricti su ogni pozzetto del gel circ µg di proteine totli di ciscun cmpione diluito in un volume finle di 8-15µl di un soluzione contenente Tris-HCl ph mm, glicerolo 25%, ß-mercptoetnolo 0mM e lu di romofenolo come trccinte. L cors elettroforetic è stt effettut 4 C per circ 1 or d un mperggio costnte di 25mA in un pprto per elettroforesi BioRd Mini proten II. Colorzione degli enzimi ADH medinte sggi di colorzione per ttività L ttività lcool deidrogensic (ADH) è stt evidenzit incundo il gel per -15 minuti tempertur miente in 5 ml di un soluzione contenente: mg di NAD+, 0,4 mg di fenzin metsolfto (PMS) e 1 mg di Sli di lu di nitro tetrzolio (NTB) e 15 µl di etnolo 95%. L ttività enzimtic è stt rilevt medinte l formzione specific di nde di colore viol-lu nelle regioni del gel in cui è migrt l ttività. Il sggio è sto su rezioni di ossidoriduzione ctlizzte dgli enzimi stessi. L colorzione è dovut ll riduzione del sle di tetrzolio, ccettore finle degli elettroni nell rezione innesct dll enzim. 51

52 RISULTATI Anlisi degli mplificti del sistem genico ADH L nlisi degli mplificti dei geni ADH condott su ceppi ottenuti dlle collezioni del CRA di Velletri e del DBVPG è riportt in Figur 1. L nlisi è stt eseguit d tre cinque volte per ciscun ceppo. Come si può osservre, utilizzndo primers specifici per i singoli geni ADH, si ottengono i rispettivi mplificti che mostrno migrzioni tr loro diverse medinte gel-elettroforesi. Nel ceppo 2 (S.cerevisie B-S11c) dell collezione di Velletri, il gene ADH2 mostr più prodotti di mplificzione che tendono scomprire qundo vengono mplificti contempornemente tutti e quttro i geni (Figur 1). Per tle motivo, sui ceppi dell collezione di Perugi è stt utilizzt direttmente quest ultimo tipo di tecnic (Figur 1). L mnct mplificzione di un singolo gene può essere interprett come indice dell ssenz del gene stesso. I risultti, rissunti nell Tell 1, sono esposti qui di seguito. - Nel ceppo di riferimento di S.cerevisie sono presenti gli mplificti di tutti i geni sggiti. Dl confronto degli ltri ceppi con questo, si può osservre che: - ADH1, che codific il principle enzim respoile dell ttività fermenttiv, è presente in tutti i ceppi di tutte le specie sggite pprtenenti entrme le collezioni. Inoltre, l tgli del DNA mplificto per PCR rimne l stess in tutti i csi. - ADH2, nell collezione di Velletri, è presente negli uvrum mentre è del tutto ssente nel ceppo di S.cerevisie E-AT1 e nei ynus C-SC2 e D-S16. Quest ultimo risultto non si riscontr nei ynus B1 e B2 dell collezione di Perugi nei quli l mplificto ADH2 è presente e di tgli ttes, così come in tutti gli ltri ceppi sggiti di quest collezione. - ADH3 è presente in tutti i cerevisie di entrme le collezioni m mostr un presenz vriile nelle ltre specie nlizzte. Inftti, per qunto rigurd i ceppi clssificti come uvrum, l mplificto è presente nel ceppo C-S6u dell collezione di Velletri e mostr nde di tgli divers nel ceppo A-270. Nel cso degli uvrum dell collezione di Perugi, l mplificto è presente nel ceppo U1 mentre è del tutto ssente nel ceppo U2. Per qunto rigurd l specie ynus, l mplificto ADH3 è presente nei ceppi C-SC2 e D-S16 dell collezione di Velletri e ssente nei ceppi B1 e B2 dell collezione di Perugi. - ADH5 è presente in tutti i ceppi di tutte le specie sggite pprtenenti d entrme le collezioni. 52

53 Digestione degli mplificti del sistem genico ADH ottenuti per PCR Per ottenere un pttern di identificzione molecolre più ffidile, i prodotti di PCR dei geni ADH sono stti sottoposti restrizione utilizzndo Su3AI, un enzim di restrizione che tgli con lt frequenz il DNA specifico per l sequenz GATC. Questo pproccio coente di evidenzire più in dettglio il polimorfismo di ciscun ceppo. L nlisi è stt effettut dpprim sul ceppo di lortorio di riferimento BY4741 (Fig.2) e successivmente sui ceppi dell collezione di Velletri (Fig.3) e di Perugi (Fig.4). Come si può vedere, l digestione degli mplificti genici, ottenuti si singolrmente che iieme dl ceppo di controllo BY4741, h fornito un serie di frmmenti di restrizione crtteristici di ciscun gene e concordi con l loro sequenz nucleotidic. Il pttern RFLP che si ottiene semr essere crtteristico per ciscun ceppo in qunto questi differiscono tr loro per l dimeione di lcuni frmmenti e nel loro numero, coerentemente con il numero di geni mplificti in ciscun ceppo. Per qunto rigurd l collezione di Perugi, il ceppo C2 di S. cerevisie mostr un pttern di restrizione identico l cerevisie di controllo, conferm dell ffidilità dell tecnic. Con piccole differenze, questo pttern si osserv si nel ceppo di itlicus (I2) che nei due ceppi di chevlieri (H2, H3) che, notorimente, sono sinonimi di cerevisie. Un diverso profilo è risultto comune per i ceppi U2, clssificto nell collezione di Perugi come S. uvrum, e i ceppi B1 e B2 di ynus. Dl momento che vevmo precedentemente osservto che nel ceppo U2 non è presente l mplificto del gene ADH3, peculirità mostrt nche di ceppi di ynus dell stess collezione, possimo ipotizzre che l clssificzione di questo ceppo si stt erronemente ttriuit ll specie uvrum. Un discorso simile può essere ftto per il ceppo U1 di uvrum che mostr un pttern di restrizione più simile l ceppo H3 di chevlieri e l C2 di cerevisie. Anlisi del pttern proteico delle lcool deidrogensi L ssenz in un determinto ceppo di lievito dell mplificto di un gene dell tgli ttes può essere dovut ll mncnz del gene stesso o l rirrngimento dell regione codificnte del gene. Per verificre che ll ssenz dell mplificto corrispondesse effettivmente l ssenz del gene, imo cercto di stilire un relzione con l presenz/ssenz del corrispondente enzim. A tle scopo, dopo rottur delle cellule ed estrzione delle proteine cellulri, le singole ttività ADH sono stte seprte medinte elettroforesi su gel ntivi di crilmide e l loro presenz è stt mess in evidenz medinte un sggio di ttività per colorzione specific. I risultti di quest nlisi sui ceppi dell collezione di Velletri hnno mostrto, che ll ssenz degli mplificti ADH2 e ADH3 corrisponde effettivmente l mncnz delle corrispondenti ttività enzimtiche (Figur 5). E interessnte notre che i ceppi 1 e 4 (uvrum) mostrno un pttern enzimtico 53

54 sovrpponiile m comunque nettmente diverso d quello osservto nei ceppi dell specie cerevisie e ynus. Per qunto rigurd i ceppi dell collezione di Perugi, questi mostrno tutti dei profili enzimtici identici tr loro e con i cerevisie e ynus dell collezione di Velletri. Fnno eccezione i ceppi B1 e B2 di ynus e U2 di uvrum che mostrno un profilo simile tr loro e pertnto, come già sottolineto sull se dell nlisi degli RFLP, semrno pprtenere ll stess specie. Inoltre, il loro zimogrmm ADH è przilmente sovrpponiile quello osservto negli uvrum dell collezione di Velletri. Nell Tell 2 è rissunt in modo schemtico l relzione tr l ssenz dell mplificto dei singoli geni con l presenz/ssenz del corrispondente enzim. 54

55 FIGURE E TABELLE ) ) Figur 1. ) Amplificzione medinte PCR dei geni ADH nel ceppo di riferimento BY 4741 e nei ceppi di lievito dell collezione di Velletri. Sono indicti con 1, 2, 3 e 5 rispettivmente gli mplificti dei geni ADH1/2/3/5; con T gli mplificti totli dei quttro geni ottenuti medinte PCR-multiplex. ) Amplificzione medinte PCR-multiplex dei geni ADH nei ceppi di lievito dell collezione di Perugi. M indic i mrctori di peso molecolre. 55

56 Tell 1. Rissunto schemtico dell presenz/ssenz degli mplificti corrispettivi i geni ADH nei ceppi di lievito delle collezioni di Velletri e di Perugi. * L sterisco indic l presenz di un mplificto che mostr un migrzione divers d quell osservt nel ceppo di riferimento o l presenz di mplificti multipli per lo stesso gene. 56

57 Figur 2. Profilo di restrizione dei DNA mplificti dei geni ADH ottenuti dl ceppo di lortorio di riferimento BY Figur 3. Profilo di restrizione ottenuto con l enzim Su3AI degli mplificti ADH dei ceppi dell collezione di Velletri. Le frecce indicno l dimeione dei frmmenti del ceppo di controllo. 57

58 . DI G E ST I ONE Su3A I C E PPI DE L L A C OL L E Z I ONE DI PE R UG I A M B 1 H 2 B 2 H 3 I 2 U1 U2 C 2 WT M Figur 4. Profilo di restrizione ottenuto con l enzim Su3AI degli mplificti dei geni ADH ottenuti di ceppi dell collezione di Perugi. 58

59 ) ) Figur 5. Profilo elettroforetico delle lcool deidrogensi (ADH) nei ceppi delle collezioni di Velletri () e di Perugi (). 59