Premesse e riepilogo

Premesse e riepilogo Lezione 1

Non esistono dispense autenticate dal Docente Tom Strachan-Andrew Read Genetica molecolare umana Zanichelli integrare con P.J.Russell Genetica EdiSES o altro testo utilizzato nel corso di genetica generale e il testo di Biologia Molecolare Saranno disponibili come supporto allo studio del libro (non sono dispense) i Power Point delle lezioni e fotocopie/pdf per integrare By NA 2

Scopo del corso Lo scopo di questo corso non e quello di imparare la clinica delle malattie, ma capire come si sceglie un test diagnostico nei casi di malattie che coinvolgono il materiale ereditario. Quindi dovrete rinfrescarvi la Genetica fatta finora. In questo corso parleremo di diagnostica e quindi necessariamente dovremo parlare di malattie, ma ora come sempre le malattie ci servono come modelli per capire le strategie.

Cosa significa ricerca delle mutazioni. Vi ricordo che mutazione significa semplicemente variazione di una sequenza confrontata con una sequenza di riferimento. Da questo ne consegue che mutazione non vuol dire che ci sia un effetto patologico. Vi ricordo la definizione di polimorfismo:variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1%. Per definizione un polimorfismo e innocuo, almeno finche non si dimostra il contrario. E comunque vero che generalmente quando si parla di mutazione si intende una variazione patogenetica e il polimorfimo viene chiamato anche variante allelica, tuttavia non e completamente corretto e noi specificheremo sempre mutazione patogenetica o non patogenetica

Mutazioni Il genoma umano, come tutti i genomi e plastico: la sopravvivenza di una specie dipende dalla sua variabilita e dalla capacita di evolvere. Il genoma umano e il risultato di eventi di poliploidizzazione che hanno modificato drasticamente il numero cromosomico. Le mutazioni cromosomiche di solito alterano il fenotipo riducendo la fitness, e sono pertanto rare a livello costituzionale, ma frequenti a livello somatico nei tumori. A livello molecolare si distinguono diversi tipi di mutazione che ormai dovreste conoscere percio vi risparmio il loro elenco. La variazione di una sequenza in una popolazione naturale non comporta necessariamente l insorgenza di un fenotipo anomalo. Quando si parla di alleli di un locus questi sono il risultato di una mutazione che per caso, per effetto della deriva genetica si sono fissati nella popolazione MEterozigosi media per il DNA genomico umano: ~0,0037 (0,37%). Cio significa che in due alleli circa 1:250-1:1000 basi sono diverse

Mutazioni M Va ricordato che le mutazioni avvengono a caso percio sia il DNA codificante che il non codificante sono egualmente suscettibili. Le conseguenze sono ovviamente diverse. Le conseguenze nella parte codificante (che costituisce circa il 3% del genoma umano) sono legate al tipo di mutazione e anche questo lo sapete. Il tasso di mutazione del DNA codificante risulta piu basso rispetto al non codificante in quanto la pressione selettiva agisce eliminando dalla popolazione gli alleli negativi e rendendo di fatto assenti nella popolazione quelle mutazioni che alterino pesantemente la funzione del prodotto genico (per es. le frameshift piu frequenti nel non codificante). Le mutazioni del DNA non codificante hanno effetto se avvengono nelle sequenze regolatrici o nelle sequenze introniche deputate allo splicing. Anche in questo caso l effetto dipende dal mantenimento della funzione.

J Sostituzione silente: non determina alcun cambiamento nel prodotto: l amminoacido resta lo stesso. Dal momento che modifica la sequenza puo originare un RFLP. In qualche caso puo dare origine ad un sito di splicing criptico e quindi essere tutt altro che neutre come la semplice sequenza potrebbe far pensare. LSostituzione non senso: si origina un codone di stop. Dal momento che la pressione selettiva e forte su un prodotto troncato prematuramente, sono rare. KSostituzione di senso errato:si origina un codone per un altro amminoacido J conservativa : il nuovo amminoacido ha caratteristiche chimiche simili al vecchio. Pertanto l effetto sul prodotto puo essere minimo e puo essere definito polimorfismo sia a livello di DNA che di prodotto. L Mutazioni non conservativa: il nuovo ammnoacido e completamente diverso dal vecchio. Puo avere effetti deleteri.

Mutazioni Il tasso e il tipo di sostituzioni percio e estremamente variabile fra i diversi geni. Alcune proteine come le ubiquitine hanno un livello di conservazione totale nella scala zoologica dall uomo al lievito. La loro sequenza a livello di DNA indica che le sostituzioni ci sono, ma sono praticamente tutte sinonime. All estremo opposto ci sono geni pochissimo conservati se non in brevi domini nell evoluzione come SRY. SRY ha una funzione chiave in tuttii mammiferi, ma questa e demandata all HMG box, che corrisponde a 78 aa. I segmenti N- e C- terminali sono estremamente variabili, indicando che per la funzione del gene questi segmenti non sono critici

Mutazioni dinamiche Mutazioni dovute all espansione di trinucleotidi localizzati nelle regioni codificanti o non-codificanti di alcuni geni, si originano per errori nella replica del DNA. KNon tutte le espansioni sono instabili. Se l aumento di lunghezza non e eccessivo, e una mutazione patogena ma stabile nella trasmissione. Si comportano cioe come le mutazioni canoniche, e seguono le leggi di Mendel Gene HOXD13 : l espansione determina la formazione di lunghi tratti di polialananina, e provoca sinpolidattilia. E rimasta stabile per 7 generazioni L Quando una sequenza trinucleotidica cambia le proprie dimensioni da una generazione all altra si parla di mutazioni dinamiche

Mutazioni che alterano i meccanismi epigenetici: Imprinting Principio dell equivalenza dei gameti: l espressione di un gene non dipende dal sesso del genitore che lo trasmette. Esclusione allelica: in alcuni tipi cellulari viene espresso uno solo dei due alleli, anche se entrambi sono in grado di esprimersi. Si ha una emizigosi funzionale:linfociti B e immunoglobuline, geni dei recettori olfattivi nei neuroni...

Ricordiamo cosa non e e cosa e l imprinting LL eredita mitocondriale non segue il principio dell equivalenza dei gameti, ma in questo caso non si parla di imprinting: i gameti sono effettivamente non equivalenti in termini di contenuto genico perche il gamete maschile non contribuisce alla dotazione di mitocondri dell embrione. L L eredita legata al sesso non segue il principio dell equivalenza dei gameti, ma di nuovo i gameti sono effettivamente non equivalenti perche i cromosomi sessuali non sono del tutto omologhi. L espressione di un fenotipo dovuto a un locus localizzato sui cromosomi sessuali dipende dal sesso della progenie. Imprinting genomico: espressione differenziata di un gene perfettamente funzionale legata all origine parentale, indipendente dal sesso della progenie, che puo essere limitata nello spazio e nel tempo.

Modifiche nella configurazione della cromatina Il cambiamento di configurazione, legato ad un effetto di posizione per un riarrangiamento, puo portare alla manifestazione di fenotipi patologici: Aniridia: silenziamento del gene PAX6 Distrofia Facioscapolomerale: una delezione di 3-4Kb elimina dalla regione compresa fra due geni: FRG1 e FRG2, delle sequenze ripetute denominate D4Z4. La perdita di queste sequenze porta questi due geni normalmente localizzati in due domini diversi, a mappare nello stesso dominio. L assenza delle ripetizioni che interagiscono con proteine regolatrici per modificare l espressione di questi geni, comporterebbe un over espressione, con conseguente fenotipo patologico

Mutazioni cromosomiche Sono una categoria di mutazioni rara nel costituzionale, e il piu delle volte sono patogenetiche. Possono provocare patologie gravi a livello dell individuo e quindi non vengono ereditate. Oppure ridurre la fitness per la presenza di gameti sbilanciati, ma possono venir trasmesse alla generazione successiva per la loro tollerabilita in eterozigosi. Sono frequenti nei tumori, dove possono indurre la tumorigenesi a causa della creazione di geni ibridi, o perche portono alla sovraespressione di geni

Repetita iuvant Perche bisogna sempre tener presente cosa andiamo a testare oltre che il come: i test sono tanti e oggi ce ne sono alcuni che abbreviano il percorso, ma vanno scelti caso per caso vi ricordate le complicazioni negli alberi genealogici? e gli altri problemi che abbiamo trattato nelle prime lezioni di genetica umana? sono ostacoli quando si vuole iniziare a studiare un fenotipo e ci si domanda: come si eredita? dove mappa? che funzione potrebbe avere il gene wild type? le variazioni che trovo in un gene candidato sono patogenetiche e giustificano il fenotipo? Sono sicura di studiare il gene giusto e non uno collegato? sono ostacoli anche quando si fa diagnostica perche potrei trovarmi in una situazione di quel tipo nelle famiglie che richiedono il test e quindi sbagliare tenete presente che il test genetico si fa una volta sola nella vita il suo risultato non cambia durante la vita By NA

complicazioni:penetranza

Penetranza & Nel caso dei caratteri mendeliani classici il fenotipo corrisponde esattamente al genotipo (compatibilmente con la dominanza e la recessivita ). Spesso pero a livello del singolo individuo questo puo non essere vero o immediamente evidente. & Un carattere presenta penetranza pari al 100% quando tutti i portatori di un certo allele manifestano il fenotipo corrispondente: pisello verde o giallo, colore bianco, rosso, rosa o striato dei fiori, nanismo acondroplasico nell uomo, gruppo sanguigno. & Un carattere presenta penetranza pari al 70% quando solo il 70% degli individui portatori dell allele manifestano il fenotipo. By NA 16

Penetranza & La penetranza e quindi un concetto che si riferisce alla popolazione. A livello del singolo individuo il carattere ha solo due possibilita : si manifesta o non si manifesta. E piu frequente nei caratteri dominanti ed e piu evidente nella genetica umana perche la genetica umana si applica ad una popolazione selvatica. Gli animali da laboratorio sono geneticamente piu omogenei, anche se chi opera con i transgenici sa bene che un gene inserito in un ceppo invece che in un altro puo portare ad espressioni diverse del fenotipo e questo aspetto viene sempre tenuto presente & Sapere che un fenotipo puo non essere completamente penetrante, e critico per studiarne la genetica o fornire consulenza genetica: un certo soggetto che non manifesta il carattere puo essere portatore dell allele mutato & Es. Osteogenesi imperfetta : fragilita ossea, sclere blu,anomalie dei denti perdita dell udito.alcuni soggetti presentano solo le sclere blu. E critico percio il livello 17 di By NA indagine

Penetranza ed espressivita & La penetranza ridotta non e da confondere con l espressivita variabile & L espressivita e il grado di gravita con cui fra gli individui che presentano il fenotipo questo si esprime: puo costituire un sottoinsieme degli individui penetranti & Es. Neurofibromatosi: presenza di tumori lungo i nervi periferici e regioni di pigmentazione scura ( macchie di caffelatte )Tutti i portatori presentano almeno uno dei segni, ma la gravita puo essere diversa anche all interno della stessa famiglia: un genitore con macchie e piccoli tumori cutanei benigni puo avere un figlio che presenta tumori estesi e maligni. (questa differenza non e prevedibile, si puo solo quantizzare il rischio di ereditare l allele non il fenotipo) By NA 18

Se il fenotipo e sindromico Espressivita variabile L alla base c e l ignoranza del difetto di base e/o della mutazione & SINDROME: insieme di segni che nel singolo individuo possono presentarsi tutti o solo in parte & e tipica dei fenotipi dominanti, anche se la recessivita potrebbe essere interpretata come un effetto della espressivita variabile & l allele a meno che non sia deleto o completamente inattivato, a livello molecolare e sempre dominante : il problema e avere i mezzi per vederlo & al livello di popolazione un fenotipo presenta espressivita variabile quando all interno dell insieme di soggetti sicuramente portatori il fenotipo presenta gravita e/o complessita diversa. Anche all interno della famiglia ci puo essere espressivita variabile By NA MPENETRANZA ED ESPRESSIVITA SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO AL FENOTIPO ALL INTERNO DI UNA POPOLAZIONE 19

Complicazioni: espressivita variabile

complicazioni: imprinting

Mosaicismo MOSAICISMO SOMATICO E/O DELLA LINEA GERMINALE: un individuo presenta alcune cellule mutate e altre no. Se le cellule mutate sono in prevalenza rispetto a quelle wild-type si possono manifestare segni clinici della malattia. La mutazione e insorta durante lo sviluppo embrionale. Piu precocemente insorge maggiore e il numero di cellule mutate. MESISTE UN RISCHIO DI TRASMISSIONE DELLA MALATTIA. Anche se non quantizzabile. Questo sembra spiegare casi di famiglie con piu di un figlio affetto, ma genitori sani e non By NA portatori della mutazione 22 (se nota).

Figure 3.7, A new mutation in X-linked recessive Duchenne muscular dystrophy - Human Molecu... Mosaicismo germinale http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk7573/figure/a300/?report=objectonly Figure 3.7 A new m utation in X-linked recessive Duchenne m uscular dystrophy The three grandparental X chromosomes were distinguished using genetic markers, and are shown in blue, gray and white (ignoring recombination). III1 has the grandpaternal X, which has acquired a mutation at some point in the pedigree. There are four possible points at which this could have happened: If III 1 carries a new mutation, the recurrence risk for all family members is very low. If II 1 is a germinal mosaic, there is a significant risk (but hard to quantify) for her future children, but not for her sisters. If II 1 was the result of a single mutant sperm, she has the standard recurrence risk for X-linked recessives, but her sisters are free of risk. If I 1 was a germinal mosaic all the sisters have a significant risk, which is hard to quantify. From: Chapter 3, Genes in pedigrees Human Molecular Genetics. 2nd edition. Strachan T, Read AP. New York: Wiley-Liss; 1999. Copyright 1999, Garland Science. NCBI Bookshelf. A service of the National Library of Medicine, National Institutes of Health. By NA 1 of 1 13/09/13 15.22

Mosaicismo germinale N OI CSp PSp 225 nt 72 nt 63 nt La diversa intensita della banda indica che nel padre in n di cellule mutate e ridotto,ecco perche non manifesta la malattia By NA M la mutazione e presente anche nelle cellule germinali del padre 24

Eterogeneita genetica M Eterogeneita genetica di locus LIl fenotipo e il risultato di una catena di interazioni: il risultato finale puo risultare simile anche quando i locus sono diversi. JE importante identificare con precisione i criteri di M Eterogeneita allelica/serie allelica L definizione Fenotipi diversi possono essere originati da By NA mutazioni in siti diversi dello stesso gene o da 25

Complementazione Figure 3.3, Complementation: parents with autosomal recessive profound hearing loss often ha... http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk7573/figure/a280/?report=objectonly Figure 3.3 Com plem entation: parents with autosom al recessive profound hearing lo ss often have children with norm al hearing II 6 and II 7 are offspring of unaffected but consangineous parents, and each has affected sibs, making it likely that each has autosomal recessive hearing loss. All their children are unaffected, showing that II 6 and II7 have nonallelic mutations. From: Chapter 3, Genes in pedigrees Human Molecular Genetics. 2nd edition. Strachan T, Read AP. New York: Wiley-Liss; 1999. Copyright 1999, Garland Science. NCBI Bookshelf. A service of the National Library of Medicine, National Institutes of Health. L eterogeneita di locus e comune nelle sindromi che si originano per l alterazione di un pathway complesso By NA 1 of 1 13/09/13 14.50 26

Eterogeneita genetica di locus &Questo concetto si applica alla popolazione ed e un indice della nostra ignoranza dei processi che portano all espressione del fenotipo &Il fenotipo puo essere molto lontano dal gene e dal suo prodotto primario in quanto esso risulta dall interazione di prodotti genici. Il primo passo e definire le modalita di trasmissione: Uno stesso fenotipo puo mostrare tipi di ereditarieta diversa :questo immediatamente segnala la presenza di piu loci. Retinite pigmentosa ~12 locus X-linked, ~20 locus autosomici trasmessi sia come caratteri recessivi che dominanti By NA Alterazioni del collagene di tipo1: ci sono 2 loci dal momento che questo collagene e formato da un eterotrimero: il fenotipo viene comunque identificato come Osteogenesi imperfetta 27

Eterogeneita allelica/serie allelica L Fenotipi diversi possono essere originati da mutazioni in siti diversi dello stesso gene o da tipi diversi di mutazione. AR : la mutazione puntiforme che provoca l inattivazione del gene origina la femminilizzazione testicolare. L espansione di triplette l atrofia muscolo-spino-bulbare Ret: Mutazioni che provocano la perdita di funzione originano la sindrome di Hirschsprung. Mutazioni puntiformi che generano un aumento di funzione originano tumori familiari delle ghiandole endocrine PMP22: la duplicazione di una regione di 1.5 Mb provoca CMT1A,distrofia muscolare neurogena con ipomielinizzazione delle fibre nervose. La delezione della stessa regione HNPP: sindrome neurologica con paralisi e ipermielinizzazione By NA 28

Ancora complicazioni:serie allelica L Fenotipi diversi possono essere originati da mutazioni in siti diversi dello stesso gene o da tipi diversi di mutazioni. MNON CONFONDERE CON ALLELIA MULTIPLA/ ETEROGENEITA ALLELICA: il gene white in Drosophila, i gruppi sanguigni nell uomo la maggior parte delle malattie genetiche By NA 29

Eredità digenica La malattia è dovuta all effetto additivo di mutazioni ETEROZIGOTI in loci diversi Forma di retinite pigmentosa che si manifesta in individui DOPPI ETEROZIGOTI per i geni ROM1 e per la periferina (RDS) che codificano per i fotorecettori. Le mutazioni in eterozigosi separatamente non causano alcun fenotipo patologico

Eredità digenica pedigree AFFETTO ROM1+/- RDS+/- ROM1+/+ RDS+/+ NON AFFETTO ROM1+/+ RDS+/+ ROM1+/- RDS+/- ROM1+/- RDS+/+ ROM1+/+ RDS+/-

Eredità triallelica Sindrome di Bardet Biedl (BBS): sindrome dismorfica caratterizzata da obesità, polidattilia, patologia renale, deficit cognitivo Carattere autosomico recessivo, ma la condizione che si riscontra è quella di due mutazioni in un locus ed eterozigote in un altro locus associato X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X AFFETTI BBS2 BBS4 BBS6 X Mutazione X X X X X X X X NON AFFETTI

Eredità triallelica pedigree BBS6 wt/a242s BSS2 wt/y24x BBS6 wt/wt BSS2 wt/y24x BBS6 wt/wt BSS2 wt/y24x BBS6 wt/147x BSS2 wt/q59x BBS6 wt/a242s BSS2 wt/wt BBS6 wt/a242s BSS2 Y24X/Y24X BBS6 wt/wt BSS2 wt/wt BBS6 wt/147x BSS2 Y24X/Q59X BBS6 wt/wt BSS2 Y24X/Q59X AFFETTO NON AFFETTO

MECCANISMO BI/TRIALLELICA A B A B C D A B C B D x A x B A x B A x x B legame meno stabile assenza del fenotipo x A comparsa del fenotipo B A D C D B x Funzione x B x A C D x

NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul libro By NA 35