TECNICHE CROMATOGRAFICHE Cromatografia è il termine generico che indica una serie di tecniche di separazione di molecole simili in base alle loro proprietà chimiche e fisiche. Questo metodo di separazione di anali9 si basa sulla loro distribuzione tra due fasi: fase mobile e fase stazionaria. Fase mobile o eluente: si muove con con9nuità a conta<o con la fase stazionaria (gas o liquido). Fase stazionaria: fase fissa (liquido o solido). 1
Distribuzione di un analita tra due fasi liquide immiscibili: Coefficiente di ripar9zione K D = C M C F C M : concentrazione dell analita nella fase mobile (verde) C F : concentrazione dell analita nella fase fissa (blu) Ipo9zziamo K D = 1 e C F = C M = ½ C all equilibrio M 1 ½ C M 1 ½ C M 2 ½ C M 1 ½ C M 2 M 1 ½ C ½ C F 1 F 1 F 1 F 2 F 1 F 2 Le concentrazioni seguono il triangolo di Tartaglia. 2
M 2 M 1 M 3 M 2 M 1 1/8 C M 3 M 2 1/8 C M 1 F 1 F 2 F 1 F 2 F 3 F 1 1/8 C F 2 1/8 C F 3 etc. per un numero elevato di recipien9 (pia@ teorici) si otene una gaussiana: E quindi possibile separare anali9 con diverso K D 3
Una colonna cromatografica è un sistema con un elevato numero di piat teorici: Più è lunga la colonna, maggiore il numero di piat teorici, migliore la separazione. Ma ci sono dei limi9: tempo, spesa, etc. 4
Fase mobile Fase stazionaria Volume di ritenzione: volume di eluente necessario ad eluire la massima concentrazione dell analita dalla colonna cromatografica Volume morto: volume di ritenzione di un analita non tra<enuto dalla colonna Tempo morto: tempo di uscita del volume morto Tempo di ritenzione: tempo di uscita della massima concentrazione dell analita 5
Cromatografia di adsorbimento fase stazionaria: solido fase mobile: liquido o gas Fase stazionaria: allumina, silice, etc. grande area superficiale (800 m 3 /g per l allumina), elevata porosità ed atvità. A@vità: forza di a<razione che l adsorbene esercita sul soluto forze di London, Van der Waals, legame idrogeno L analita deve essere solubile nella fase mobile. 6
Cromatografia di riparezione fase stazionaria: liquido (supportato) fase mobile: liquido o gas Distribuzione tra due fasi liquide immiscibili tra loro secondo i differen9 K D. La fase stazionaria è supportata su un solido inerte, ma c è sempre un parziale effe<o di adsorbimento sul solido. non c è separazione ne<a tra cromatografia di ripar9zione e cromatografia di adsorbimento 7
Cromatografia a scambio ionico fase stazionaria: solido (resine scambiatrici) fase mobile: liquido (acqua contenente ioni) Resina scambiatrice: polimero contenente ioni che possono essere scambia9. Può avere gruppi acidi: resina scambiatrice caeonica o gruppi basici: resina scambiatrice anionica Analisi dell acqua: 8
Fase stazionaria : palline di vetro rivestite di cellulosa (scambiatore anionico o cationico) Fase mobile: solventi acquosi Uso comune: separazione di proteine 9
Cromatografia per filtrazione su gel fase stazionaria: gel poroso fase mobile: liquido o gas La resina (fase stazionaria) con9ene un elevato numero di pori di diversa dimensione distribui9 sta9s9camente in essa riempi9 di solvente (fase mobile). Le par9celle sono tra<enute in base alle loro dimensioni. Le par9celle troppo grandi vengono eluite con il volume morto; le par9celle troppo piccole vengono co- eluite; le par9celle di medie dimensioni vengono tra<enute dai pori di dimensioni superiori. 10
Cromatografia per affinità fase stazionaria: solido fase mobile: liquido 3 Sfru<a l affinità (legame seletvo) tra un substrato ed il suo ligando. Ad esempio tra un enzima ed il suo substrato, tra rece<ori ed ormoni, tra an9geni ed an9corpi. 11
Fase stazionaria : granuli di resina coniugata al ligando Fase mobile: solventi acquosi Uso comune: separazione di proteine molecola A Ligando specifico per la molecola A Altre molecole non affini al ligando 12
Cromatografia su colonna: Cromatografia su strato sotle (TLC): 13
HPLC: cromatografia liquida ad alta risoluzione o cromatografia liquida ad alta pressione L alta pressione consente di utilizzare matrici estremamente fini e quindi, aumentando il numero di interazioni con la matrice, di aumentare il numero di patti teorici. Consente di analizzare quantitativamente e qualitativamente miscele di molecole piccole derivatizzate, rispetto a composti di riferimento Vantaggi : Velocità di esecuzione Riproducibilità della separazione Semi-automaticità del procedimento Svantaggi : Costo degli apparati e delle colonne Utilizzabile per analisi o in purificazioni su piccola scala di laboratorio 14
E una cromatografia di adsorbimento che usa alte pressioni (50-350 atmosfere). E impiegata per la separazione di sostanze non vola9li, neutre o ioniche, e di sostanze termolabili come, ad esempio, amminoacidi, pep9di e proteine, carboidra9. Si presta facilmente a misure quan9ta9ve. Viene u9lizzata per la determinazione (qualita9va e quan9ta9va) di uno o più anali9 in matrici complesse (plasma, alimen9) difficilmente risolvibili con altre tecniche anali9che. Efficienza: performance del par9colare sistema. Risoluzione: misura dell abilità del metodo nel separare completamente due componen9. poco efficiente e poco risolta buona efficienza e buona risoluzione 15
Gas- Cromatografia (GC) La colonna è un sotle tubo capillare molto lungo (metri) sulle cui pare9 è depositata la fase stazionaria. La fase mobile è un gas inerte. Il meccanismo di separazione è adsorbimento e ripar9zione. Il campione deve essere vola9le in un intervallo tra la temperatura ambiente e circa 350 C. Consente di analizzare quantitativamente e qualitativamente miscele di molecole piccole a bassa polarità, rispetto a composti di riferimento Vantaggi : Elevata sensibilità Riproducibilità della separazione Semi-automaticità del procedimento Svantaggi : Costo degli apparati e delle colonne Utilizzabile per analisi Non consente purificazione, poiché il campione viene vaporizzato prima della corsa e poi rivelato ad alte temperature 16
EleLroforesi Tecnica anali9ca basata sul movimento di par9celle cariche in un campo ele<rico. La mobilità delle par9celle dipende dalla forza ele<rosta9ca che agisce sulla par9cella, ossia dal rapporto carica/massa della par9cella, e dalla forma della par9cella stessa. La velocità di migrazione aumenta all aumentare della carica ne<a del campione e diminuisce all aumentare della massa molecolare (a causa delle forze frizionali ed ele<rosta9che) L ele<roforesi può essere condo<a in soluzione: elelroforesi a flusso conenuo oppure su un gel: elelroforesi a fronte mobile o elelroforesi zonale Nell ele<roforesi a flusso con9nuo si avrà una elevata velocità di migrazione; nella ele<roforesi zonale invece la velocità sarà minore (maggiori forze frizionali ed ele<rosta9che) e il campione si muoverà a bande o zone. Gel: resina acquosa porosa contenente un tampone. Il gel funge anche da setaccio molecolare: separazione in base alle dimensioni 17
Molte molecole biologiche (ammino acidi, pep9di, proteine, DNA, RNA) hanno gruppi ionizzabili (acidi o basici) e pertanto ad un determinato ph esistono in soluzione come specie cariche (posi9ve o nega9ve), che so<o l azione di un campo ele<rico migrano al catodo o all anodo. Il tampone presente nel gel man9ene costante lo stato di ionizzazione delle molecole da separare. x Marcatori di Mr e calcolo della massa delle proteine Il ph del tampone è molto importante in presenza di anfoli9 (es., ammino acidi), di cui determina la carica (posi9va o nega9va) e quindi il polo di migrazione. y R f = x/y La Mr di una proteina può essere determinata confrontando la sua mobilità con quella di una serie di proteine aventi Mr nota (standard), che vengono separate sullo stesso gel. Si riporta in grafico la distanza percorsa da ciascuna delle proteine standard, in funzione del logaritmo in base 10 del suo Mr, costruendo una curva di calibrazione. Si misura quindi la distanza di migrazione della proteina avente Mr incognita e per interpolazione si ottiene il valore di Mr cercato 18
Un alimentatore fornisce corrente con9nua agli ele<rodi e la corrente è mantenuta lungo il circuito dall ele<rolisi dell acqua. Si può usare un colorante per definire il fronte del solvente, ed un colorante per individuare la zona di interesse. 19
Le bande vengono rivelate mediante assorbimento e/o fluorescenza UV o mediante coloran9. 20
L ele<roforesi può essere bidimensionale: in una dimensione la separazione viene fa<a in base alla massa molecolare, mentre nella seconda direzione in base al punto isoele<rico, in un gradiente di ph. Punto isoelelrico: valore di ph al quale una molecola ha carica ele<rica ne<a nulla. ph basso: Le proteine vengono protonate Carica positiva Anodo Anodo 4 5 6 IPG strip Campo elettrico Proteine acide 7 8 9 10 ph alto: Le proteine vengono deprotonate carica negativa Le proteine cariche migrano all interno del gradiente di ph Catodo Quando le proteine raggiungono il valore di ph corrispondente al proprio pi, la loro carica netta diviene zero ed esse focalizzano come bande discrete Catodo Proteine basiche 21
EleLroforesi bidimensionale: alta risoluzione E L I 3 I p g c 22
Tecniche di rivelazione Dipendono dal 9po di cromatografia e possono essere spe<roscopiche (es. UV- Vis), chimiche (reagen9 per TLC), spe<rometriche (massa), fisiche (ionizzazione di fiamma, etc. Verranno tra<ate successivamente. in internet: h<p://www.uniroma2.it/didatca/metodibiotec/deposito/lez.4 Cromatografia_09.pdf h<p://www.chem.uniroma1.it/canepari/ metodi_chimici_per_il_monitoraggio_ambientale/9%20cromatografia%20generale.pdf h<p://www2.unibas.it/armentano/linked/lezione%204%20(ele<roforesi- ief).pdf 23