Metodo di separazione che si basa sulla distribuzione degli analiti tra una fase mobile e una fase stazionaria. TIPI di CROMATOGRAFIA Eluizione degli analiti può avvenire: Capillarità Gravità Pressione Potenziale Elettrico CROMATOGRAFIA COLONNA PLANARE GC Scambio ionico CCE LC Adsorbimento SFC TLC Esclusione Ripartizione Carta Elettroforesi Fase Normale (fase stazionaria polare fase mobile non-polare) Fase inversa (fase stazionaria non-polare fase mobile polare)
CROMATOGRAFIA - Teoria Distribuzione degli analiti tra le due fasi Può essere descritta in modo semplice considerando il seguente equilibrio: A mobile A stazionaria La costante d equilibrio, K, è detta coefficiente di ripartizione ed è data da: K =[A] mobile /[A] stazionaria Il tempo che intercorre tra l iniezione del campione e l uscita dell analita dalla colonna per raggiungere il rivelatore è detto tempo di ritenzione (t R ). Ciascun analita nel campione avrà differenti tempi di ritenzione. Il tempo che impiega la fase mobile ad attraversare la colonna è detto tempo morto (t M ). Il termine definito fattore di ritenzione, k', è spesso utilizzato per descrivere la velocità di migrazione dell analita nella colonna. Viene spesso definito anche fattore di capacità. Per l analita A il fattore di ritenzione è dato da: k' A = (t R - t M )/ t M t R e t M si ottengono direttamente dal cromatogramma. Quando il fattore di ritenzione è < 1, l eluizione è talmente veloce che è praticamente impossibile determinare accuratamente il tempo di ritenzione. Fattori di ritenzione elevati (> 20) sono indice di lunghe eluizioni. I fattori di ritenzione ideali sono compresi tra 1 e 5.
Per descrivere la separazione di 2 specie A e B in colonna è utile definire il fattore di selettività (α): α = k ' B / k ' A Nel rapporto si pone al denominatore la specie che eluisce più velocemente in modo tale che sia sempre α >1. Maggiore è questo rapporto e migliore sarà al separazione. Per ottenere delle ottime separazioni è necessario che i picchi siano stretti e simmetrici, è quindi necessario fare in modo che non si verifichino allargamenti di banda, scegliendo opportunamente le condizioni operative (eluente e fase stazionaria) e valutando anche l efficienza della colonna.
CROMATOGRAFIA Efficienza della separazione Due fattori contribuiscono a determinare la qualità della separazione di 2 componenti: Differenza fra i tempi di eluizione dei picchi (più sono distanti, migliore è la separazione) Larghezza dei picchi (più sono larghi, peggiore è la separazione) Un soluto che si muove attraverso la colonna cromatografica tende ad espandersi in forma approssimativamente gaussiana con deviazione standard σ. Maggiore è il tempo impiegato dal soluto per attraversare la colonna e più larga sarà la banda. Le comuni misure della larghezza sono: w 1/2 =larghezzaametàaltezza ew = larghezza all intersezione della linea di base con le tangenti tracciate lungo le parti più ripide del picco L equazione che descrive un picco gaussiano è: y = σ 1 2 ( x μ) 2 2 σ e 2π Da cui si può dimostrare che w 1/2 = 2.35 σ e w = 4 σ
Eluizione isocratica e a gradiente Con 1 solo solvente o con una miscela di solventi di composizione costante. Variazione continua della composizione del solvente per aumentare la forza eluente. Una forza eluente crescente è necessaria per eluire i soluti più fortemente trattenuti e per migliorare le separazioni.
Cromatografia di scambio ionico Scambio anionico A ph maggiore del pi (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la colonna a scambio anionico. L eluizione avviene con [Cl - ] crescente o abbassando il ph (più difficile da controllare). Scambio cationico A ph minore del pi (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e lega la colonna a scambio cationico. L eluizione avviene con [Na + ] crescente o alzando il ph.
Cromatografia di scambio ionico
Cromatografia di scambio ionico VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI Proteine allo stesso ph e concentrazioni di sali della colonna. Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.
Gel filtrazione L interazione avviene tra la proteina e la matrice polimerica. La matrice polimerica è fatta di microsfere con porosità controllata. Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengono trattenute in base alla loro dimensione. Se una proteina, molto grande, non interagisce con la matrice esce con un volume di eluente pari al Void Volume (volume vuoto).
Gel filtrazione
Gel filtrazione Vantaggi Semplice Prevedibile Svantaggi Bassa capacità (piccoli volumi) Soluzioni non viscose
Determinazione peso molecolare
Sepharose 4B Gluatatione S-transferasi proteina Proteine contaminanti di E.coli
Sepharose Gluatatione Gluatatione S-transferasi proteina
Cromatografia a fase normale - Fase stazionaria polare, solvente meno polare -Solventipiù polari hanno maggiore forza eluente Cromatografia a fase inversa - Fase stazionaria apolare, solvente più polare -Solventi meno polari hanno maggiore forza eluente La cromatografia in fase inversa elimina la codatura dei picchi poiché la fase stazionaria ha pochi siti che possono adsorbire fortemente il soluto. È anche meno sensibile alle impurezze polari (come l acqua) nel solvente.