CANAL-LLAUBEES LA PUIFICAZINE DEI PEPAATI ENZIMATICI PE L ENLGIA - PAG.1 LA PUIFICAZINE DEI PEPAATI ENZIMATICI PE L ENLGIA - EFFETT SULLA QUALITÀ DEI VINI SSI E BIANCHI ose-marie CANAL-LLAUBÈES Novozymes France, 23, parvis des Chartrons, 33074 Bordeaux Cédex Introduzione I preparati enzimatici prodotti da ceppi di microrganismi non geneticamente modificati contengono numerose attività enzimatiche. Questi funghi filamentosi non patogeni sono isolati dal suolo, della cui microflora fanno parte; hanno il dono dell ubiquità. Lo spettro di attività enzimatiche si spiega con l adattamento del microrganismo al suo ambiente naturale. I ceppi utilizzati per l enologia, Aspergillus niger e Trichoderma harzianum possiedono, oltre alle attività per le quali sono riprodotti (pectinasi per A. niger, ß-1,3-1,6 glucanasi per T. harzianum), altri tipi d attività enzimatiche, quali le cellulasi, ß-glucosidasi, xylanasi, galattanasi e proteasi, per non citare che le più conosciute. Alcuna di queste attività non sono desiderate nelle applicazioni enologiche. È il caso della cinnamil-esterasi (CE), prodotta da A. niger. Di conseguenza, è un esigenza fondata avere dei preparati con dei tenori d attività CE limitati, o addirittura nulli. Le condizioni industriali di fermentazione sono scelte per favorire la produzione di attività che si potrebbe definire come «attività principali». Si tratta delle attività che caratterizzano la preparazione enzimatica. Tuttavia, lo spettro enzimatico di ogni preparato dipende dal ceppo e dalle condizioni di coltura, che sono specifiche per ogni produttore. Per ottenere dei preparati contenenti un solo tipo d attività, è necessario utilizzare Microrganismi che sono Geneticamente Modificati (MGM). Dopo aver presentato l origine, i ceppi e le condizioni di fermentazione, questo articolo passerà in rassegna le attività enzimatiche responsabili della formazione dei fenoli volatili nei vini e l effetto della purificazione sulle attività enzimatiche indesiderate. NB: noi preferiamo riservare il termine enzima ad una proteina avente un potere catalitico ben definito (ad esempio: pectin-esterasi). I preparati enzimatici contengono diversi enzimi o attività enzimatiche. Quali sono i funghi da cui derivano gli enzimi? I ceppi dei funghi comunemente utilizzati nell industria delle biotecnologie per la produzione d enzimi in enologia appartengono alla famiglia degli Ascomiceti (così come i ceppi di lievito Saccharomyces spp.). Sono non patogeni e colonizzano gli ambienti naturali. Aspergillus niger (foto 1) è un fungo microscopico filamentoso. Foto 1: Schema d Aspergillus niger Trichoderma harzianum (foto 2) è isolato dal suolo, dove costituisce parte dell ambiente naturale. Alcuni ceppi sono conosciuti per agire come fungicidi, potendo proteggere le colture da Botrytis o dalla muffa grigia (peronospora). VINIDEANET IVISTA INTENET TECNICA DEL VIN, 2003, N. 7
CANAL-LLAUBEES LA PUIFICAZINE DEI PEPAATI ENZIMATICI PE L ENLGIA - PAG.2 Foto 2: Trichoderma harzianum Aspergillus e Trichoderma sono i due microrganismi utilizzati per la produzione dei preparati enzimatici destinati all enologia (pectinasi, glucanasi). Gli altri preparati sono estratti dal bianco d uovo (lisozima) o da colture di Lactobacillus fermentum (ureasi). L utilizzo dei preparati enzimatici in enologia obbedisce a tre livelli di regolamentazione (Goutel, 1996): comunitario, nazionale ed internazionale, quest ultimo basato sulle risoluzioni dell IV. La produzione dei preparati I preparati enzimatici sono generalmente prodotti per fermentazione. Industrialmente, i ceppi selezionati sono coltivati su dei substrati agricoli come la farina di soia o l amido di patata. Il metodo normalmente più impiegato è la coltura in mezzo sommerso. Canal-Llaubères (2002) descrive le differenti tappe di produzione dalla fermentazione fino alla tappa finale di formulazione. Il risultato della fermentazione è una preparazione enzimatica contenente molteplici attività. Questa è priva del microrganismo produttore. Il gel di elettroforesi di una preparazione di pectinasi (foto 3), mostra le differenti bande che compongono la preparazione. gni banda corrisponde ad un'attività enzimatica (da sinistra a destra: corsa 1, pectinasi prodotta da un ceppo di Aspergillus niger; corse 2 e 3, pectinasi prodotta da un altro ceppo di A. niger; corsa 4, pectin-liasi A prodotta da un Microrganismo Geneticamente Modificato; corsa 5, indicatori dei pesi molecolari). Foto 3: Gel di elettroforesi (SDS PAGE) di preparati di pectinasi prodotti a partire da Aspergillus niger (a destra: corsa 5, indicatori dei pesi molecolari). Questa foto permette di visualizzare la complessità dei preparati enzimatici ottenuti a partire da un microrganismo non geneticamente modificato (ceppi non MGM) in confronto a una preparazione enzimatica mono componente - o enzima - prodotta a partire da un MGM. È importante notare che l enzima non è modificato. È il VINIDEANET IVISTA INTENET TECNICA DEL VIN, 2003, N. 7
CANAL-LLAUBEES LA PUIFICAZINE DEI PEPAATI ENZIMATICI PE L ENLGIA - PAG.3 microrganismo produttore che è modificato da mutazione genetica per indurre la sintesi del tipo d attività enzimatica desiderato. icordiamo che l enzima è un catalizzatore di natura proteica, prodotto da tutte le cellule viventi. Come tutte le altre proteine, gli enzimi sono biodegradabili. Le attività enzimatiche indesiderate Tra le attività enzimatiche conosciute, ne sono state identificate alcune che potenzialmente possono causare delle deviazioni organolettiche (perdita di freschezza nei vini bianchi, comparsa di un carattere fenolico più o meno pronunciato nei vini bianchi e rossi). È il caso dell attività cinnamil-esterasi, presente nei preparati di pectinasi prodotti a partire da ceppi di Aspergillus niger. I preparati enzimatici prodotti da Trichoderma harzianum sono naturalmente esenti dall attività CE. Il livello d attività dipende dal ceppo del microrganismo, ma anche dalle condizioni di fermentazione. Purificazione e caratterizzazione dell attività cinnamil-esterasi Dall introduzione delle pectinasi in enologia per la decantazione dei mosti, a metà degli anni 70, Burkhardt (1976) nota che il loro impiego conduce alla rapida perdita del bouquet dei vini bianchi tedeschi. Egli attribuisce questi difetti organolettici alla presenza di un attività enzimatica «depsidasi» prodotta da Aspergillus niger e contenuta nel preparato enzimatico utilizzato. Questa attività sarebbe in grado di idrolizzare i composti idrossi-cinnamil tartarici dei mosti bianchi. Maurer (1987) chiama questa attività «clorogenasi», ma la definisce in maniera identica. Numerosi autori si sono impegnati su questo problema, senza mai portare delle risposte sull identificazione delle sostanze volatili responsabili della perdita della tipicità di questi vini. I lavori di Chatonnet et al. (1992) hanno permesso di mettere in evidenza il ruolo dei preparati di pectinasi sul tenore in fenoli volatili dei vini. Prima ancora, Chatonnet et al. (1989) avevano dimostrato il ruolo del lievito Saccharomyces cerevisiae nella formazione di questi composti. Barbe (1995) purifica e caratterizza l attività cinnamil-esterasica. Si tratta di una glicoproteina di peso molecolare stimato di 240 000 Da, formata da due sub unità di 120 000 Da. La formazione dei fenoli volatili I fenoli volatili, vinil- ed etil-, contribuiscono all aroma dei vini bianchi e rossi. A partire da una certa soglia, questi composti possono apportare della pesantezza mascherando il carattere fruttato, o perfino deprezzare i vini sviluppando delle note medicinali, d inchiostro, di tempera o di chiodo di garofano (vinil-4-fenolo, vinil-4- guaiacolo) e note di stalla o di sudore (etil-4-fenolo, etil-4-guaiacolo). Questi composti derivano dal metabolismo degli acidi fenolici, per azione dei microrganismi durante la fermentazione. 1. Formazione dei vinil-fenoli Barbe (1995) ha dimostrato l evoluzione del tenore in vinil-4-fenolo e in vinil-4- guaiacolo nel corso della fermentazione alcolica, con e senza utilizzo di preparati pectolitici. La presenza dei vinil-fenoli è osservata unicamente nei vini bianchi. La loro formazione dipende da reazioni enzimatiche che fanno intervenire la cinnamato-decarbossilasi (CD) del lievito (Albagnac, 1975). Il gene PF1 (phenolic off-flavour), che codifica la sintesi di questa proteina, è stato clonato da Meaden e Taylor (1991). L attività CD è comunemente presente in Saccharomyces e nella maggior parte dei ceppi di lieviti secchi attivi per l enologia (Grando et al., 1993). Così, dei ceppi privati dell attività cinnamato-decarbossilasi (cosiddetti PF -) sono stati selezionati per evitare la formazione dei vinil-fenoli. Nei vini rossi, questa attività è inibita dai composti fenolici delle uve rosse (Chatonnet et al., 1989). Il tenore in vinil-fenoli è più importante nei vini bianchi ottenuti con un trattamento enzimatico a partire da pectinasi che possiedono una attività CE; il tasso di aumento VINIDEANET IVISTA INTENET TECNICA DEL VIN, 2003, N. 7
CANAL-LLAUBEES LA PUIFICAZINE DEI PEPAATI ENZIMATICI PE L ENLGIA - PAG.4 rispetto a un vino testimone può essere del 50% (figura 3). I preparati enzimatici non contengono attività cinnamato-decarbossilasi. La figura 1 mostra l idrolisi degli esteri tartarici degli acidi cinnamici del mosto, sotto l azione di una attività secondaria di tipo esterasi, presente nei preparati enzimatici. In uve mature, la concentrazione in precursori è da 2 a 5 volte più elevata che quella degli acidi fenolici liberi. H CH CH C 1 Cinnamil-esterasi precursori Acide tartrique H CH CH C Acidi-fenolici liberi H Figura 1. Formazione dei vinil-fenoli nel vino bianco. Tappa 1: idrolisi dei derivati idrossi-cinnamil-tartarici da parte dell attività CE (preparazione di pectinasi, Botrytis cinerea). La comparsa dei vinil-fenoli nei vini è descritta nella figura 2. Questi composti sono formati a partire dalla decarbossilazione degli acidi cinnamici liberi del mosto e da quella degli acidi cinnamici derivati dall idrolisi degli esteri tartarici per mezzo di una esterasi presente nei preparati pectolitici, sotto l azione della cinnamatodecarbossilasi di Saccharomyces cerevisiae. 2 Cinnamato-decarbossilasi H CH CH C H Saccharomyces H CH CH 2 C 2 Vinil-fenolo Figura 2. Formazione dei vinil-fenoli nel vino bianco. Tappa 2: idrolisi degli acidi cinnamici da parte dell attività CD (Saccharomyces cerevisiae) La messa a punto di preparati pectolitici con ridotta attività CE ha permesso di limitare la formazione dei vinil-fenoli nei vini bianchi. I risultati ottenuti su Sauvignon bianco sono presentati nella figura 3. L utilizzo di preparati pectolitici classici (non purificati dall attività CE) per chiarificare i mosti comporta nei vini dei tenori da 2 a 4 volte più elevati in vinil-4-fenolo, rispetto a quelli dei vini testimoni. L utilizzo di preparati a bassa attività CE limita, al di sotto della soglia di percezione (770 µg/l), il VINIDEANET IVISTA INTENET TECNICA DEL VIN, 2003, N. 7
CANAL-LLAUBEES LA PUIFICAZINE DEI PEPAATI ENZIMATICI PE L ENLGIA - PAG.5 tenore in vinil-4-fenolo del vino. Questi risultati sono stati confermati su altri vitigni (Moscato). 2000 Vinil-4-fenolo (µg/l) 1500 1000 soglia di percezione 500 0 testimone preparato purificato (FCE ) preparato standard P. Chatonnet & C. Barbe, 1992 Figura 3. effetto dei preparati enzimatici sul tenore in vinil-fenoli nei vini Sauvignon (macerazione pellicolare di 12 ore a 15 C sotto C 2, chiarifica con pectinasi a 1 g/hl, 100 NTU, inoculo con LSA PF + a 10 g/hl) 2. Formazione degli etil-fenoli Nella vinificazione in rosso, capita di trovare dei vini che presentano un carattere fenolico. Il lievito Saccharomyces non è responsabile della formazione dei fenoli volatili, dal momento che l attività CD é inibita dai composti fenolici (Chatonnet et al., 1997). Nei vini rossi, è però possibile la contaminazione del lievito Brettanomyces, che è responsabile della formazione di fenoli volatili, sviluppando delle note di cuoio e, al di là di una certa soglia, note di scuderia o di sudore. Così secondo Chatonnet, circa 1/3 dei vini rossi di Bordeaux analizzati presenta questo carattere fenolico. Anche Gerbaux segnala che i vini di Pinot nero sono particolarmente sensibili alla contaminazione da Brettanomyces: il 50% dei vini in affinamento e il 25% di quelli in bottiglia sono contaminati. Questo lievito è capace di decarbossilare gli acidi fenolici liberi del mosto e quelli liberati in seguito all utilizzo delle pectinasi (figura 1). Contrariamente a Saccharomyces, la cinnamato-decarbossilasi di Brettanomyces non è inibita dai polifenoli. La sua azione permette la formazione dei vinil-fenoli, che sono successivamente ridotti a etil-fenoli dall intervento di una vinil-fenolo reduttasi (VP) (figura 4). I lavori recenti di Gerbaux et al. (2002) mostrano che alcune pratiche come la macerazione finale a caldo e l utilizzo di pectinasi sul vitigno Pinot nero possono aumentare i rischi di formazione di questi composti in presenza di lieviti di contaminazione, e oltrepassare la soglia di percezione (400 µg/l con un rapporto etil- 4-fenolo/etil-4-guaiacolo di 10:1). Gli autori mostrano che l utilizzo di pectinasi non purificate dall attività CE aumentano il tenore in etil-fenolo nei vini ed in particolare quello di etil-4-fenolo, con conseguenze negative sulla qualità dei vini. I preparati di pectinasi FCE non determinano modifiche di queste sostanze in confronto al testimone. Pertanto l utilizzo di preparati pectolitici a bassa attività CE si giustifica anche per la vinificazione in rosso. VINIDEANET IVISTA INTENET TECNICA DEL VIN, 2003, N. 7
CANAL-LLAUBEES LA PUIFICAZINE DEI PEPAATI ENZIMATICI PE L ENLGIA - PAG.6 2 Cinnamato-decarbossilasi H CH CH C H Brettanomyces C 2 H CH CH 2 3 Vinil-fenolo reduttasi H CH CH 2 Etil-fenolo Figura 4. Formazione degli etil-fenoli nei vini rossi. Tappa 2: idrolisi degli acidi cinnamici da parte dell attività CD (Brettanomyces) e formazione dei vinil-fenoli. Tappa 3: riduzione dei vinil in etil-fenoli da parte dell attività VP (Brettanomyces). Il controllo dell attività CE La letteratura riporta numerose attività esterasiche in Aspergillus spp. D altro canto, si riscontra una grossa confusione nella denominazione delle attività esterasiche fungine (tannasi, depsidasi, clorogenasi, idrolasi degli esteri dell acido idrossicinnamico) e sono riportate valutazioni diverse sulla loro incidenza qualitativa. Dopo l identificazione e la caratterizzazione dell attività responsabile dell idrolisi degli esteri tartarici degli acidi cinnamici, alcuni studi hanno dimostrato che è possibile eliminare parzialmente l attività cinnamil-esterasica dai preparati pectolitici per ultrafiltrazione su membrane con cut off di 100 000 Da. La maggior parte dell attività CE si ritrova nel retentato, mentre il permeato é povero in attività CE. In produzione, il metodo più comunemente impiegato è basato su un intervento sul ph della preparazione prima della sua formulazione, per denaturare l attività CE. Questo procedimento ha ugualmente un incidenza sulle altre attività enzimatiche, e le rese si riducono. I lavori di Barbe (1995) hanno permesso di validare questo processo di purificazione, determinando un valore limite minimo in CE, in conseguenza del quale la produzione di vinil-fenoli rimane al di sotto della loro soglia di percezione. Conclusioni I preparati enzimatici per l enologia, e in particolare le pectinasi, possono contenere delle attività indesiderate come la cinnamil-esterasi di Aspergillus niger. La sua presenza può, in alcuni casi, nuocere alla qualità dei vini bianchi e rossi, facendo loro perdere la freschezza aromatica o esasperando il carattere fenolico fino a raggiungere delle note sgradevoli. Il principio di precauzione ha guidato i fabbricanti a purificare i loro prodotti da questa attività ed a proporre dei preparati pectolitici a bassa attività cinnamil-esterasica (FCE). Il loro utilizzo sulle uve (macerazione) o sul mosto (chiarifica) permette di limitare l idrolisi degli esteri tartarici degli acidi fenolici. Così la composizione iniziale dei mosti rossi e bianchi non è modificata, quando il vinificatore utilizza questi preparati enzimatici. VINIDEANET IVISTA INTENET TECNICA DEL VIN, 2003, N. 7
CANAL-LLAUBEES LA PUIFICAZINE DEI PEPAATI ENZIMATICI PE L ENLGIA - PAG.7 Bibliografia Albagnac G., 1975. La décarboxylation des acides cinnamiques substitués par les levures. Ann. Techn. Agric., 24,2, 133-141. Barbe C., 1995. echerches sur les activités estérases contaminantes des préparations pectolytiques. Applications technologiques. Thèse de doctorat de l université de Bordeaux II, n 348. Burkhardt V.., 1976. Depsidspaltende Nebenwirkung von Enzympräparaten für die Be-und Verarbeitung von Lebensmitteln beobachtet bei der Aufbereitung von bst-und Traubenmaischen. Dtsch. Lebensmittel-dsch. Canal-Llaubères.M, 2002. Le procéde de production des préparations enzymatiques. Applications à l œnologie. evue des Œnologues, 104, 35-37. Chatonnet P., Barbe C., Canal-Llaubères.M., Dubourdieu D. et Boidron J.N., 1992. Incidence de certaines préparations pectolytiques sur la teneur en phénols volatils des vins blancs. J. Internat. Sci. Vigne Vin, 26, 4, 253-269. Chatonnet P., Dubourdieu D., Boidron J.N., 1989. Incidence de certains facteurs sur la décarboxylation des acides phénols par la levure. Conn. Vigne Vin, 23, 1, 59-62. Chatonnet P., Viala C. and Dubourdieu D., 1997. Influence of polyphenolic components of red wines on the microbial synthesis of volatile phenols. Am. J. Enol. Vitic., 48, 4, 443-448. Gerbaux V., Vincent B. and Bertrand A., 2002. Influence of maceration temperature and enzymes on the content of volatile phenols in Pinot noir wines. Am. J. Enol. Vit., 53, 2,131-137. Goutel A.M., 1996. églementation de l utilisation des enzymes en œnologie. ev. Française d œnologie, 157, 25-27. Grando M.S., Versini G.; Nicolini G. and Mattivi F., 1993. Selective use of wine yeast strains having different volatile phenols production, Vitis, 32, 43-50. Maurer., 1987. Pektin und Pektinabbau bei der Weinbereitung. ebe-wein, (2), 370-374. Meaden P.G. and Taylor N.., 1991. Cloning of yeast gene which cause phenolic off-flavors in beer. J. Inst. Brew., 97, 5, 353-357. VINIDEANET IVISTA INTENET TECNICA DEL VIN, 2003, N. 7