LIBERAZIONE DI POLISACCARIDI DAI LIEVITI E LORO INTERAZIONI CON I POLIFENOLI DEL VINO

Transcript

1 ESCOT EL AL. INTERAZIONI TRA POLISACCARIDI E POLIFENOLI PAG. 1 LIBERAZIONE DI POLISACCARIDI DAI LIEVITI E LORO INTERAZIONI CON I POLIFENOLI DEL VINO S. ESCOT (1), M. FEUILLAT (1), A.JULIEN (2), et C.CHARPENTIER (1) (1) Laboratoire d'œnologie, Institut Universitaire de la Vigne et du Vin, BP Campus Universitaire, 278 Dijon Cedex, France (2) Lallemand S.A, BP 4412, 3145 Toulouse Cedex France sandraescot@yahoo.fr I polisaccaridi rappresentano uno dei principali gruppi di macromolecole del vino. Tra di esse alcune, come le sostanze pectiche ed i polisaccaridi neutri, provengono dall uva. Altre sono invece di origine fungina, come ad esempio i glucani di peso molecolare kda prodotti da Botrytis cinerea quando infetta gli acini d uva. Esiste infine un gruppo importante di polisaccaridi, prodotti o liberati dai lieviti Saccharomyces cerevisie durante la fermentazione alcolica (Llaubères 1988) o l autolisi (Feuillat et al 1989). L effetto delle macromolecole dette «colloidi protettori» sulla stabilità del vino è conosciuto dal 1933 (Ribéreau-Gayon). Tuttavia nel passato questi colloidi venivano eliminati attraverso il collaggio o la filtrazione (Feuillat et al 1987) facendo uso di membrane non adatte. Alle mannoproteine vengono attribuite in enologia proprietà stabilizzanti rispetto alle precipitazioni tartariche (Lubbers et al 1994) e proteiche (Moine-Ledoux et al 1992), una funzione di supporto degli aromi (Lubbers et al 1994), oltre che la capacità di stabilizzare i composti fenolici (Saucier et al 1997). I polifenoli e più specificatamente gli antociani ed i tannini, giocano un ruolo importante per la qualità dei vini rossi essendo responsabili rispettivamente del colore e della struttura in bocca. Le prime osservazione fatte sulle interazioni tra componenti della parete del lievito e composti fenolici risalgono ai lavori di Augustin (1986) che mostrano come l aggiunta di scorze di lievito può portare ad un aumento dell intensità del colore e della tonalità. Il contributo degli antociani liberi al colore rosso viene ridotto e si osserva un aumento della frazione relativa ai complessi tannino-antociano decolorabili con la solforosa. Inoltre i tannini risultano meno reattivi alla gelatina. Tali risultati sono stati confermati la Llaubère nel 1988, che ha mostrato come aggiungendo al vino lieviti secchi attivi o mannoproteine estratte dagli stessi lieviti si ottiene una diminuzione dell indice di gelatina corrispondente ad una specie di collaggio, congiuntamente alla riduzione della reattività dei tannini. Saucier et al (2) hanno mostrato che alcuni polisaccaridi possono controllare o prevenire l instabilità colloidale «avvolgendo» i tannini, e tale fenomeno viene associato al concetto di «buoni» tannini e ad una sensazione organolettiche di corpo e rotondità. Alcune prove di affinamento di vini rossi su fecce fini, nel corso degli ultimi anni, hanno permesso di fare un certo numero di osservazioni sull evoluzione della qualità dei polifenoli, tra cui il fatto che l astringenza non può essere spiegata solamente attraverso la struttura chimica dei tannini, ma è necessario prendere in considerazione l entità delle loro combinazioni con sostanze non polifenoliche come le mannoproteine. La comprensione dell influenza delle mannoproteine sulla stabilità dei composti fenolici passa attraverso una migliore conoscenza della loro composizione fine oltre che dei meccanismi di liberazione ed azione. Per questo motivo le sopracitate osservazioni sono state completate con uno studio approfondito in laboratorio ed alcune verifiche in condizioni reali di cantina.

2 ESCOT EL AL. INTERAZIONI TRA POLISACCARIDI E POLIFENOLI PAG Liberazione di mannoproteine, loro composizione ed influenza del ceppo di lievito Uno studio compiuto su 27 ceppi di lievito vinario (Rosi et al 1998) ha mostrato che la liberazione di polisaccaridi da parte delle cellule durante la fermentazione di uno stesso mosto varia da un ceppo all'altro. Nelle condizioni sperimentali descritte la quantità di mannoproteine liberate variava tra e 144 mg/l con il 48% dei ceppi che liberavano da 51 a 8 mg/l e solamente il 4% che ne rilasciavano più di 121 mg/l. In seguito a questa osservazione, sono stati condotti lavori finalizzati ad una migliore comprensione dei meccanismi che causano questo «effetto lievito» sulla liberazione dei polisaccaridi durante la fermentazione alcolica. Sono state quindi condotte fermentazioni in mosto sintetico inizialmente povero in colloidi facendo uso di due ceppi diversi di lievito: uno in grado di liberare basse quantità di mannoproteine (LSA1) ed un altro che rilascia forti quantità (). Alla fine della fermentazione alcolica, i lieviti sono stati lasciati nel mezzo per giorni, simulando un inizio di affinamento «sur lies». Le mannoproteine sono state raccolte in diverse fasi della fermentazione (fase esponenziale, fine fermentazione e dopo giorni d autolisi) tramite precipitazione con etanolo, e quantificate per HPLC. L area dei picchi è stata misurata e comparata con quella ottenuta con iniezione di preparati commerciali di mannoproteine purificate. I risultati sono espressi in mg/l. Polys./g de biomasse p, expo Fin FA Autolyse Temps (heures) Figura 1 : Liberazione di mannoproteine da parte di 2 ceppi di lievito industriali : LSA1 e. Misure effettuate con HPLC. Si può constatare che il mezzo di fermentazione si arricchisce di mannoproteine e che tale arricchimento continua durante la conservazione del mezzo sulla biomassa al termine della fermentazione. L aumento del contenuto in mannoproteine risulta significativo fin dall inizio della fermentazione per il ceppo, mentre si verifica più tardivamente con il ceppo LSA1. In effetti, dopo 8 ore di fermentazione, il ceppo libera il 76% di mannoproteine in più rispetto al ceppo LSA1. Dopo due settimane d autolisi, la differenza tra i ceppi si è ridotta al %, anche se sempre in favore del ceppo. È stata determinata la composizione chimica di queste macromolecole, che sono risultate contenere un 8-9% di polisaccaridi ed un -2% di proteine, confermando quindi la loro origine parietale. Gli zuccheri principali della frazione polisaccaridica sono il mannosio ed il glucosio. Le glicoproteine liberate dal ceppo LSA1 sono costituite per l 8% da mannosio e per il 2% da glucosio, quale che sia la fase di fermentazione, mentre le glicoproteine parietali prodotte dal ceppo hanno un rapporto mannosio/glucosio vicino ad 1.

3 ESCOT EL AL. INTERAZIONI TRA POLISACCARIDI E POLIFENOLI PAG. 3 Le mannoproteine sono legate nella parete sia al β 1-3 o al β 1-6 glucano che alla chitina mediante il β 1-3 glucano. Sono state prese in esame la composizione della parete dei due ceppi e la rispettiva sensibilità al quantazyme, per capire se il fenomeno di liberazione era legato a delle differenze della parete cellulare. Il quantazyme è una β 1-3 glucanasi ad elevato grado di purezza (Quantum Biotechnologie). La sua applicazione sulla parete dei lieviti permette di caratterizzare i cambiamenti strutturali della parete stessa. L esperimento è stato realizzato in doppio su lieviti in fase esponenziale di crescita. Solamente il ceppo è risultato sensibile all enzima (figura 2). In questa fase di fermentazione, questo ceppo ha già liberato la maggior parte delle macromolecole (16.3 g/ g di biomassa in peso secco, rispetto ai 3.6 g del ceppo LSA1) : di conseguenza, la minor presenza di proteine intorno alla parete la rende maggiormente accessibile all azione dell enzima. I risultati di frazionamento delle proteine della parete del ceppo in questa fase della fermentazione mostra un tenore in proteine che si libera con la laminarinasi (β 1-3 glucanasi con attività β 1-6 glucanasi) di 2 volte inferiore a quello della parete del ceppo LSA1. Questo può significare che le macromolecole liberate sono mannoproteine legate a β 1-6 glucani. Infine, è interessante notare che il contenuto in chitina della parete del ceppo è 2 volte maggiore di quello del ceppo LSA1. Sensibilité à la quantazyme des souches LSA1 et % Abs. 6nm Temps (heures) LSA1 Figura 2 : Sensibilità a quantazyme dei ceppi LSA1 e in fase esponenziale di crescita cellulare. 2- Interazione tra le mannoproteine ed i composti fenolici Le differenza sopra descritte in termini di qualità delle mannoproteine liberate ci hanno portato a studiare le interazioni di queste macromolecole con alcuni costituenti del vino ed in particolare con i polifenoli. Il ceppo nella pratica di vinificazione viene considerato in grado di dare vini rotondi e con colore più stabile nel tempo. I tannini giocano un ruolo primordiale sulla qualità organolettica dei vini rossi, oltre che sulla loro attitudine all invecchiamento. Essi rinforzano il colore associandosi agli antociani (Ribereau-Gayon 1973). I tannini posso anche interagire con le macromolecole come le mannoproteine ed avere un effetto sull astringenza, la stabilità chimica e colloidale del vino. Durante l invecchiamento, sembra aumentino i legami tra i tannini ed i polisaccaridi (Glories, 1978), impedendo la reazione dei tannini stessi con le proteine salivari. Saucier (1997) mostra che a partire da una certa concentrazione si avrà stabilizzazione colloidale grazie all adsorbimento dei polisaccaridi attorno alle particelle colloidali di alcuni tannini (procianidine).

4 ESCOT EL AL. INTERAZIONI TRA POLISACCARIDI E POLIFENOLI PAG. 4 In un primo tempo, lo studio delle interazioni polifenoli / polisaccaridi è stato condotto in laboratorio aggiungendo mannoproteine purificate estratte dai due ceppi di lievito, in concentrazione di mg/l ad un vino giovane Pinot nero. Dopo giorni di contatto, sono state effettuate le misure dei diversi indici che danno informazioni sulla struttura ed i tannini e sul loro grado di combinazione con gli antociani (tabella 1). Ceppo di lievito Indice di gelatina (%) Indice di PVPP (%) Indice Etanolo (%) Testimone mg/l di mannoproteine liberate durante la fermentazione alcolica ,8 + 2 mg/l di mannoproteine liberate durante la fermentazione alcolica mg/l di mannoproteine liberate durante l autolisi 29,5 29, ,1 8,5 + 2 mg/l di mannoproteine liberate durante l autolisi 27, ,2 Tabella1 : influenza delle mannoproteine liberate dai due ceppi di lievito sulle proprietà dei composti fenolici I risultati ottenuti mettono in evidenza una reazione positiva di certe mannoproteine purificate sui composti fenolici. Le mannoproteine liberate durante la fermentazione alcolica dal ceppo sono molto reattive verso i composti fenolici. Si constata una riduzione dell indice di gelatina (che rappresenta l astringenza dei tannini) del 3% ed un aumento dei complessi mannoproteine / tannini (indice etanolo) e degli antociani combinati (indice PVPP). Questo fenomeno non si osserva con le mannoproteine liberate dal ceppo LSA1. Le mannoproteine liberate durante l autolisi risultano meno diverse da un ceppo all altro per quanto riguarda la reattività con i tannini, ed inoltre, indipendentemente dal ceppo di origine, non mostrano effetti sulle combinazioni con i tannini e sul grado di polimerizzazione degli antociani. 3- Prove di cantina Per confermare questi risultati, sono stati messi in opera numerose prove durante la vendemmia 2, per valutare gli effetti dell uso dei ceppi LSA1 e sul colore dei vini ottenuti e sulla loro sensazione di volume in bocca. Le prove sono state seguite da studenti del diploma di Enologia presso diverse aziende in Bourgogne, Beaujolais e Madiran. In tutti questi siti, le vasche dono state riempite in modo omogeneo, è stato seguito l andamento della fermentazione ed è stata verificata la dominanza del ceppo inoculato. Inoltre, in momenti differenti della fermentazione e dell affinamento, sono stati determinati altri parametri (colore, evoluzione dei composti fenolici).

5 ESCOT EL AL. INTERAZIONI TRA POLISACCARIDI E POLIFENOLI PAG. 5 In tutte le sedi sperimentali sono state osservate le stesse tendenze nei profili analitici e sensoriali, con una preferenza a favore del ceppo dall inizio della macerazione fino a 6 mesi di affinamento, dovuta a tannini più rotondi ed ad un colore più stabile. Viene riportato qui l esempio del Madiran, dove i vini sono più tannici e le differenze più evidenti. Le analisi sono state effettuate alla fine della fermentazione alcolica, alla fine della fermentazione malolattica ed dopo 6, e mesi di affinamento. Dalla fine della macerazione a 6 mesi di affinamento i risultati dei vari indici sono a favore del ceppo, con un colore più stabile (intensità colorante ed indice PVPP più elevati) e tannini più rotondi (indice etanolo ed indice di ionizzazione maggiori, indice di potere tannico inferiore) (figure 3 e 4). Si constata, tuttavia, che con il tempo certe differenze tendono a ridursi. Questo è coerente con quanto osservato in laboratorio, dove il ceppo LSA1 mostrava una liberazione di certe mannoproteine più tardi durante l autolisi. Ciò nonostante, come in laboratorio, si vede che la reattività verso i polifenoli di queste mannoproteine liberate durante l autolisi è meno importante. Indice d'éthanol Indice 3 2 LSA1 FIN FA FIN FML 6 Fermentation Figura 3 : Andamento dell indice Etanolo durante l affinamento dei 2 vini ottenuti con i ceppi LSA1 e Indice du pouvoir tannant Indice 5 LSA1 FIN FA FIN FML 6 Elevage Figura 4 : Andamento del potere tannico (indice di gelatina) durante l affinamento dei 2 vini ottenuti con i ceppi LSA1 e I risultati dell analisi sensoriale vanno nella stessa direzione : 8 degustatori su 12 (test significativo al 5%) trovano i vini ottenuti con il ceppo più morbidi di quelli derivanti dall impiego del ceppo LSA1. 9 giudici su 12 trovano inoltre nei vini più volume ed una minore intensità tannica (11 su 12) rispetto ai vini LSA1.

6 ESCOT EL AL. INTERAZIONI TRA POLISACCARIDI E POLIFENOLI PAG. 6 Conclusioni Sulla base di queste esperienze, si può affermare che i lieviti hanno la capacità di liberare quantità variabili di mannoproteine durante la fermentazione e durante l autolisi. La composizione di queste macromolecole varia in dipendenza della fase di liberazione e del ceppo di lievito. Il lavoro mostra inoltre che le mannoproteine hanno un effetto positivo sulle caratteristiche organolettiche dei vini rossi. In effetti alcune mannoproteine hanno una reattività positiva con i composti fenolici. Si possono distinguere due famiglie di mannoproteine: quelle liberate durante la fermentazione alcolica e quelle liberate durante l autolisi. Alcuni ceppi di lievito liberano durante la fermentazione alcolica quantità importanti di mannoproteine dotate di una buona reattività con i polifenoli e tale proprietà influenza l astringenza del vino finale e la stabilità del suo colore. Attualmente sono in corso studi di frazionamento delle diverse mannoproteine liberate durante la fermentazione o l autolisi, per meglio spiegare questi meccanismi. Le prove di cantina confermano ceppi diversi di lievito provocano differenze nella composizione dei vini, dovute certamente alla diversa presenza di mannoproteine ed agli effetti benefici di queste sull equilibrio organolettico dei vini (rotondità, volume in bocca). Il ceppo dà vini con tannini più morbidi, quale che sia la varietà e la tecnica di vinificazione. Questo ceppo si rivela essere adatto alla produzione di vini da bere giovani o prodotti con periodi di affinamento brevi.

7 ESCOT EL AL. INTERAZIONI TRA POLISACCARIDI E POLIFENOLI PAG. 7 Bibliografia AUGUSTIN M., (1986) : Etude de l influence de certains facteurs sur les composés phénoliques du raisin et du vin. Thèse de doctorat d université. Université de Bordeaux II. FEUILLAT M., (1987) : Stabilisation et clarification des vins : aspects colloïdaux. Revue des œnologues, 45, FEUILLAT M., FREYSSINET M., CHARPENTIER C., : L élevage sur lies des vins blancs de Bourgogne. Evolution des macromolécules : polysaccharides et protéines. Vitis, 28, GLORIES, Y. (1978) : Recherche sur la matière colorante des vins rouges. Thesis, University of Bordeaux. LLAUBERES, R.M. (1988) : Les polysaccharides sécrétés dans les vins par Saccharomyces cerevisiae et Pediococcus sp. Nouvelle thèse d'université. Université Bordeaux II. LUBBERS, S., CHARPENTIER, C., FEUILLAT, M. AND VOILLEY, A. (1994) : Influence of yeast walls on the behavior of aroma compounds in a model wine. American Journal of Enology and Viticulture, 45, MOINE LEDOUX, V., DULAU, L., DUBOURDIEU, D., (1992) : Interprétation de l'amélioration de la stabilité protéique des vins au cours de l'élevage sur lies. Journal International Scientifique Vigne Vin, 26, RIBEREAU-GAYON P. 1973: Interprétation chimique de la couleur des vins rouges. Vitis,12: RIBEREAU-GAYON J., (1933) : Vin et colloïdes protecteurs. Bull. Soc. Chimi. France 53, PV Soc. Phys. Bordeaux. ROSI, I., GHERI, A., et al. (1998): Effet des levures produisant des polysaccharides pariétaux sur certaines caractéristiques des vins rouges pendant la fermentation. Rev. Fr. Œnol.,172, SAUCIER, C. (1997): Les tanins du vin : Etude de leur stabilité colloïdale. Thèse de doctorat de l'université de Bordeaux. SAUCIER, C., GLORIES Y., ROUX, D., (2) : Interaction Tannins-colloïdes : nouvelles avancées concernant la notion de "bons" et de "mauvais" tanin. Revue des oenologues 94, 9-.