L esperienza del Laboratorio di Prevenzione di Lecco Rosangela Donghi LP ASL Lecco 5 giugno 2014
SCOPO: Implementare le prestazioni del laboratorio (Reg. 209/2013 - germogli) Validazione di un metodo per la ricerca di STEC negli alimenti (ISO/TS 13136:2012) Fornire dati analitici il più possibile utilizzabili da chi gestisce i campionamenti e i risultati successo nell isolamento colturale esito Presenza presuntiva
Validazione di un metodo per la ricerca di STEC negli alimenti Adozione ISO/TS 13136:2012 Collaborazione tra microbiologia e biologia molecolare Microbiologia Biologia molecolare
Fasi del lavoro: Validazione dei metodi di PCR Real Time su DNA estratti dai ceppi di STEC (verifica della capacità di evidenziare il DNA dei germi presenti) Validazione della parte colturale, partendo da alimenti negativi contaminati artificialmente in laboratorio (verifica della capacità di evidenziare i germi presenti) FASE PIU CRITICA: isolamento colturale del germe target, soprattutto in alimenti altamente contaminati da flora propria (es. germogli)
Validazione metodi PCR Real Time 8 geni: stx1, stx2, eae, rfbe (O157), wbdl (O111), wzx (O26), wzx (O103), ihp1 (O145) (+aggr, aaic, wzx (O104), flich4) LOD Specificità Sensibilità
LIMITE DI RIVELAZIONE - LOD (nelle caselle con fondo colorato inserire i CT medi delle repliche e la deviazione standard) Livello N.copie target / reaz. PCR N repliche stx1 stx2 eae wbdl (O111) wzx (O103) rfbe (O157) wzx (O26) ihp1 (O145) target 9 target 10 A 40 33.17 (0.39) 32.28 (0.46) 30.74 (0.15) 32.25 (0.28) 37.59 (0.49) 29.85 (0.09) 34.15 (1.64) 31.34 (0.37) B 20 34.38 (0.50) 33.51 (0.23) 31.82 (0.19) 33.31 (0.24) 38.65 (0.47) 31.04 (0.10) 36.51 (2.33) 32.75 (0.30) C 10 35.37 (0.44) 34.23 (0.62) 32.83 (0.14) 34.47 (0.61) 40.10 (0.30) 32.33 (0.09) 35.64 (1.64) 35.34 (0.70) D 5 36.58 (0.99) 35.28 (0.63) 33.91 (0.22) 35.76 (0.69) 42.00 (0.83) 33.80 (0.37) 39.00 (2.27) 36.82 (0.71) E 2,5 38.00 (1.52) 38.19 (1.56) 35.24 (0.42) 36.63 (0.65) 42.97 (0.75) 35.11 (0.35) 39.06 (2.04) 37.70 (0.68) F 0,25 UND UND 40.05 (1.30) 41.00 (0.82) UND 39.09 (0.80) 40.37 (1.51) 40.60 (1.19) Data PCR 22/01/2014 22/01/2014 17/12/2013 08/01/2014 28/01/2014 15/01/2014 28/01/2014 29/01/2014 LOD 5 5 5 5 10 5 10 5 ACCETTABILITA': 10 10 10 10 10 10 10 10 Firma RA: Preparazione diluizioni target: Fattore diluizione Livello N.copie target / reazione A* = A* 40 x2 B 20 x2 C 10 x2 D 5 x2 E 2,5 x10 F 0,25
SENSIBILITA' E SPECIFICITA' (compilare le caselle con fondo colorato) METODO: IO MdP 51 TARGET:stx1 METODO: IO MdP 51 TARGET:stx2 METODO: IO MdP 51 TARGET:eae PCR Positiva PCR Negativa PCR Positiva PCR Negativa PCR Positiva PCR Negativa 107 107 0 115 115 0 123 123 0 30 0 30 12 0 12 22 0 22 ACCETTABILITA' ACCETTABILITA' ACCETTABILITA' >95% >95% >95% SPECIFICITA' 100 SPECIFICITA' 100 SPECIFICITA' 100 SENSIBILITA' 100 SENSIBILITA' 100 SENSIBILITA' 100 Firma RA: Firma RA: Firma RA: Data: Data: Data: METODO: IO MdP 51 TARGET:rfbE (O157) METODO: IO MdP 51 TARGET:wbdl (O111) METODO: IO MdP 51 TARGET:wzx (O26) PCR Positiva PCR Negativa PCR Positiva PCR Negativa PCR Positiva PCR Negativa 108 108 0 112 112 0 103 103 0 12 0 12 10 0 10 14 0 14 ACCETTABILITA' ACCETTABILITA' ACCETTABILITA' >95% >95% >95% SPECIFICITA' 100 SPECIFICITA' 100 SPECIFICITA' 100 SENSIBILITA' 100 SENSIBILITA' 100 SENSIBILITA' 100 Firma RA: Firma RA: Firma RA: Data: Data: Data:
Contaminazione artificiale di alimenti Contaminazione artificiale alimento con x UFC/g x: 0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 100 UFC tot./camp. 1x104 1x106
Prove secondo ISO/TS 13136:2012 e modifiche secondo noi Abbiamo sperimentato : 1. Diverse modalità di arricchimento ( brodi diversi) 2. Diverse temperature di incubazione del brodo di arricchimento 3. Diversi terreni solidi per la semina in piastra dei brodi di arricchimento (terreni cromogeni) 4. Diverse temperature di incubazione delle piastre
Prove secondo ISO/TS 13136:2012 e modifiche secondo noi Arricchimento in brodo ; ISO: buffered peptone water(bpw) o Modified Tryptic Soy Broth (mtsb): BPW mtsb senza supplemento mtsb con supplemento (novobiocina 16 mg/l) La flora concomitante prevale durante la fase di arricchimanto se effettuata a 37 C Incubazione del brodo di arricchimento (ISO : 37 C o.n.): 37 C 6 ore + 44 C o.n. 42 C o.n. 44 C o.n.
Prove secondo ISO/TS 13136:2012 e modifiche secondo noi Estrazione del DNA dal brodo di arricchimento PCR RT per geni stx1, stx2, eae Semina per striscio (10 µl) su: (ISO: solid medium ): Mac Conkey Chromogenic E.coli O157 Agar CHROMagar STEC
Prove secondo ISO/TS 13136:2012 e modifiche secondo noi Incubazione delle piastre di cromogeni a 37 37 C o 44 44 C: 100 UFC tot. - 37 C 100 UFC tot. - 44 C
Prove secondo ISO/TS 13136:2012 e modifiche secondo noi Incubazione delle piastre di cromogeni a 37 37 C o 44 44 C: Isolamento di colonie positive: estrazione del DNA da pool di colonie (frequentemente si distinguono colonie singole);.identificazione delle colonie positive
Conclusioni PCR: non è un passaggio problematico; sensibilità Incubazione brodo di arricchimento: passaggio fondamentale Terreno cromogeno: grosso aiuto
Microbiologia Biologia molecolare
Franca ed Eleonora Laboratorio di Prevenzione della ASL di Lecco