RILIEVI ANTROPOMETRICI E GENETICI SU SCHELETRO UMANO A SCOPO IDENTIFICATIVO.

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1 RILIEVI ANTROPOMETRICI E GENETICI SU SCHELETRO UMANO A SCOPO IDENTIFICATIVO. Rosa SANTA CRUZ*, Giacomo A.F. D Agostaro***, Rosalba FLORIS**, Elena GHIANI**, Lucia BARCA*, Antonio CARAI*, Stefano GESSA*, Alessandro ALFONSI* & Giuseppe SANTA CRUZ* Università degli Studi di Cagliari. Dip. di Sanità Pubblica, Sez. di Medicina Legale: Direttore Prof. Dr. G. Santa Cruz* Università degli Studi di Cagliari. Dip. di Biologia Sperimentale, Sez. di Scienze Antropologiche: Direttore Prof. G. Floris** ENEA Casaccia Roma*** INTRODUZIONE E DESCRIZIONE DEL CASO IN DATA VENIVA RINVENUTO UNO SCHELETRO UMANO, A NOI PERVENUTO INCOMPLETO (67 OSSA) IN DATA , PER LA DETERMINAZIONE DEL SESSO E LA RICOSTRUZIONE DELL IDENTITA GENETICA INDIVIDUALE E COMPARATIVA CON DEGLI INDIVIDUI DI RIFERIMENTO. I RESTI SONO RISULTATI APPARTENENTI AD UN INDIVIDUO DI SESSO MASCHILE DELL ETA COMPRESA TRA E DELL ALTEZZA DI CM 163, IDENTIFICATO GENETICAMENTE PRESSO I NS LABORATORI, LA CUI IDENTITA ANAGRAFICA RIMANE AL MOMENTO IGNOTA. Il Laboratorio di Genetica Patologica e Forense Sergio Montaldo Ideato e voluto dal Prof. Giuseppe Santa Cruz è stato dedicato alla Memoria del Prof. Sergio Montaldo già Direttore dell Istituto di Medicina Legale ed Anatomia e Istologia Patologica dell Università di Cagliari nonché fraterno amico. Viene inaugurato nel Giugno 1998 in presenza delle massime autorità locali e di importanti autorità nazionali, ed è il primo in Sardegna specializzato anche in indagini di Biologia Molecolare Forense. Dispone di attrezzature all avanguardia, di personale altamente qualificato e di giovani laureati in via di formazione. Oltre alla consueta attività di ricerca, si effettuano analisi routinarie basate essenzialmente su tecniche di PCR quali: PCR SSP; PCR SSO (dot blot e reverse dot blot); PCR e RSP; analisi di microsatelliti STRs su sequenziatore automatico per test di paternità, identificazione personale ( carta d identità biologica ); analisi di sequenze su sequenziatore automatico; RT-PCR ecc. Il Laboratorio compie l importante requisito della contiguità e della separazione degli ambienti di lavoro. Per informazioni rivolgersi allo 070/

2 FOTO CRANIO 2

3 CARTA D IDENTITA BIOLOGICA DEI RESTI SCHELETRICI UMANI ESAMINATI Sesso: Maschile. Età biologica presunta: 20/25 anni. Statura presunta: 163 cm circa. Caratteri somatici: Viso e naso allungati, mandibola pronunciata (sia agli angoli che al mento), occhi grandi. Dentatura: Al momento della morte aveva tutti i denti, ma alcuni sono andati perduti successivamente. La dentatura in situ è sana, infatti non sono presenti tracce di cure dentarie. Presenza di tessuti molli: Presente solo un disco intervertebrale altamente degenerato aderente ad una vertebra. Segni particolari riscontrati: Deformazione della mandibola e di due coste attribuibile, presumibilmente, alla pressione esercitata da massi o da altri corpi pesanti. Un canino superiore è rotto. Patologie riscontrate: Stato dei resti scheletrici: Segno di infezione gengivale nel vivente (con coinvolgimento alveolare), lieve alterazione a carico della colonna vertebrale. Colorazioni diverse nello stesso osso indicano diversa esposizione alla luce e al sole e lasciano supporre che i resti fossero parzialmente interrati in un suolo con resti vegetali ed inoltre sono stati esposti al fuoco. Presumibilmente la scheletrizzazione non è avvenuta nel luogo del ritrovamento. Cause della morte: Ignote. Comparazione con foto dello scomparso: Possibile. Assenza di alcune parti dello scheletro: Possibilità che i resti scheletrici presenti nel terreno non siano stati recuperati tutti oppure che le parti mancanti siano state asportate da animali, esseri umani o agenti fisico-chimici. 3

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5 STUDIO DEL CROMOSOMA Y Il cromosoma Y è trasmesso dal padre esclusivamente ai discendenti del sesso maschile. Nella popolazione umana questo cromosoma si caratterizza per un alta variabilità, quindi attraverso l analisi dei frammenti del cromosoma Y provenienti da due o più individui di sesso maschile, è possibile determinare se hanno lo stesso ascendente nella linea maschile, quale sia il grado di parentela e se tutti sono membri della stessa famiglia. Il maggior vantaggio dell analisi dei loci polimorfici della parte non ricombinante del cromosoma Y (NPRY), sta nel fatto che la costruzione dei suoi aplotipi caratterizza in dettaglio ogni distinta linea maschile. Questo genere di analisi è spesso utilizzato in medicina forense, nelle indagini parentali e in genetica di popolazione umana. Per l analisi del cromosoma Y vengono utilizzati una serie di STRs che hanno un alto potere risolutivo nell attribuzione di paternità. Marcatori molecolari analizzati. Sono stati analizzati 10 marcatori sul cromosoma Y: DYS19, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, e sono stati messi a confronto e confermati i risultati ottenuti. Marcatori Molecol. Cromos Y DY19 DY389 I DYS389.II DY390 DY391 DY392 DY393 DYS437 DYS438 DYS439 n.d n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 5

6 FOTO CASSETTA DI ZINCO 6

7 DETERMINAZIONE DELL ETA PRESUNTA (NEL VIVENTE) (Sezione di Scienze Antropologiche) Per la diagnosi di età bisogna specificare che quella che viene determinata é l età biologica dell individuo al momento della morte. A questo scopo vengono valutati tutti gli indicatori scheletrici disponibili, in base ad un metodo combinato. Nel nostro caso si ha un quadro ben preciso: la dentatura completa a 32 denti indica che il soggetto aveva tra i 18 e i 25 anni (terzo molare erotto) e l usura dei denti, praticamente nulla, conferma questa età; la superficie della sinfisi pubica è molto rugosa (Fase I secondo Suchy-Brooks) e indica un età al di sotto dei 25 anni. La stessa indicazione è fornita dall ossificazione incompleta della scapola, delle ossa dell anca, delle vertebre e degli omeri. Inoltre le suture craniche sono aperte. DETERMINAZIONE DEL SESSO SECONDO CRITERI ANTROPOMETRICI Il calcolo della statura di un individuo di cui si disponga dello scheletro si basa sul rilevamento delle lunghezze massime o fisiologiche delle ossa lunghe degli arti. Le misure ottenute vengono confrontate con tabelle di riferimento o elaborate con specifiche formule che consentono di risalire alla statura del cadavere e del vivente. L osso maggiormente indicativo è il femore. Nel nostro caso disponiamo di ambedue i femori in buone condizioni e, elaborando la loro lunghezza fisiologica con il metodo di Manouvrier, si ottiene la statura sul vivente di 163 cm. DETERMINAZIONE DEL SESSO SECONDO CRITERI GENETICI (Laboratorio di Genetica Patologica e Forense Sergio Montaldo ) La determinazione del sesso secondo criteri genetici è basata sull analisi del marcatore molecolare Amelogenina. L'analisi del gene Amelogenina locato sulle braccia corte del cromosoma X e del cromosoma Y è in grado di distinguere la presenza dei due cromosomi sessuali (il gene dell amelogenina è situato nella regione p22 del cromosoma X, mentre sul cromosoma Y presenta una inserzione di 6 bp). Talvolta nello studio del DNA antico (proveniente soprattutto da reperti ossei) è possibile il verificarsi di una perdita allelica, che può tradursi in una perdita di eterozigosità ( loss of eterozigosity ), la quale può indurre a false diagnosi, ben note agli addetti al settore. Per ovviare a questa possibilità, generalmente quando si ottiene un genotipo femminile (X-X) le analisi vengono ripetute in passaggi successivi, di natura confermatoria o di esclusione, dei risultati ottenuti. Viceversa nel caso di un genotipo maschile si devono ovviare possibili contaminazioni esterne (soprattutto se chi ha processato i reperti è un operatore di sesso maschile). 7

8 Profilo genetico dei reperti. Marcatori molecolari STRs Profilo genetico dei resti scheletrici D8S D21S D7S CSF1PO Amelogenina X-Y D5S FGA n.d. D3S TH D13S D16S D2S D19S vwa TPOX 8-11 D18S51 n.d. 8

9 Il DNA mitocondriale. Il DNA mitocondriale umano é una molecola circolare covalentemente chiusa la cui sequenza nucleotidica é nota (numero di accessione GenBank NC_001807) (Fig. 15) [Anderson et al., 1991; Andrews et al., 1999]. All interno della regione controllo o D-Loop che contiene l origine di replicazione, sono state identificate due regioni la cui sequenza nucleotidica é altamente variabile fra individui diversi all interno di popolazioni umane distinte. Queste regioni polimorfiche sono state denominate HV1 (HyperVariable 1; posizioni ) ed HV2 (posizioni ). La variabilità della sequenza nucleotidica delle regione HV1 ed HV2 del DNA mitocondriale in un piccolo campione (83 individui) della popolazione dell Italia centrale è risultata simile a quella di altre popolazioni caucasiche [Tagliabracci et al., 2001]. Nell uomo, sia maschio che femmina, il DNA mitocondriale é trasmesso strettamente attraverso la discendenza materna [Case & Wallace, 1980; Gill et al., 1981; Nishimura et al., 2006]. Pertanto, le sequenze nucleotidiche del DNA mitocondriale di individui che hanno in comune la discendenza materna sono identiche a meno dell occorrenza di mutazioni. Lo studio del DNA mitocondriale si effettua prevalentemente in casi in cui il DNA gnomico sia oltremodo danneggiato od insufficiente ed inoltre per stabilire e/o confermare/escludere la discendenza per via materna. Amplificazione di Regioni Polimorfiche del DNA Mitocondriale Umano: Regioni polimorfiche del DNA mitocondriale umano sono state amplificate mediante PCR, utilizzando oligonucleotidi sintetici come inneschi delle reazioni di amplificazione. 9

10 RESTAURO Le indagini genetiche, per le procedure ad esse correlate, determinano spesso un deterioramento dei reperti, a volte irrimediabile. Durante questo studio sono state compromesse irreparabilmente alcune zone del femore e dell omero omolaterali destri, mentre i due denti implicati nello studio sono stati perfettamente ricostruiti e riportati alle condizioni iniziali. Cenni Bibliografici Applied Biosystems. (2001). AmpFlSTR Identifiler PCR amplification kit User s Manual (Foster City, CA, USA). Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MH, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC,Nierlich DP, Roe BA, Sanger F, Schreier PH, Smith AJ, Staden R, Young IG. (1981). Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature, 290: Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, Lightowlers RN, Turnbull DM, Howell N. (1999). Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nat Genet., 23:147. Case JT and Wallace DC. (1981). Maternal inheritance of mitocondrial DNA polymorphysm in cultured human fibroblasts. 10