ALLEGATO: IL PROGETTO DI RICERCA

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1 ALLEGATO: IL PROGETTO DI RICERCA 1

2 INDICE PRIMA PARTE - Proposta di Capitolato Tecnico ) DATI SALIENTI DEL PROGETTO TITOLO Settore/Ambito Sintesi del progetto (Abstract) Sintesi del progetto (Abstract) Descrizione dell'obiettivo generale del progetto ) STATO DELL ARTE ) DESCRIZIONE DELL'OBIETTIVO FINALE ) DURATA (IN MESI) E DATA DI INIZIO DEL PROGETTO: ) LUOGHI DI SVOLGIMENTO DEL PROGETTO ) DESCRIZIONE DELLA COMPAGINE DEI PROPONENTI ) RESPONSABILE DEL PROGETTO ) OBIETTIVI, ATTIVITÀ E TEMPISTICA Struttura del prodotto/processo/servizio Obiettivi realizzativi e Attività Tempistica ) SCHEDA DEI COSTI AMMISSIBILI (Autogenerata dal sistema SIRIO) ) ARTICOLAZIONE DEI COSTI PER LE ATTIVITA PREVISTE ) VERIFICA DELL ESITO DEL PROGETTO DI RICERCA Verifica intermedia Verifica finale SECONDA PARTE ) ELEMENTI PER LA VALUTAZIONE DELL'EFFETTO INCENTIVANTE DELL'INTERVENTO PUBBLICO ) CARATTERISTICHE INNOVATIVE E TECNICO-SCIENTIFICHE ) COPERTURA FINANZIARIA ) VALIDITA' INDUSTRIALE DEL PROGETTO ) ARTICOLAZIONE DEI COSTI ) REQUISITI PER LA CONCESSIONE DI ULTERIORI AGEVOLAZIONI

3 PRIMA PARTE - Proposta di Capitolato Tecnico 1) DATI SALIENTI DEL PROGETTO 1.1 TITOLO Titolo del progetto: Strumenti Innovativi per il Miglioramento della Sicurezza Alimentare: Prevenzione, Controllo, Correzione (S.I.Mi.S.A.) Titolo del progetto in lingua inglese: New Strategies for Improvement of Food Safety: Prevention, Control, Correction (S.I.Mi.S.A.) Soggetto/i Attuatore/i (Soggetto/i Partner coinvolti nel progetto) Soggetto Attuatore: - Distretto Agro-alimentare Regionale D.A.Re. s.c.r.l Soggetti Partner: - Istituto di Biomembrane e Bioenergetica, Consiglio Nazionale delle Ricerche (IBBE- CNR) - Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari, Consiglio Nazionale delle Ricerche (ISPA-CNR) - Università degli Studi di Bari Aldo Moro, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex Dipartimento.di Biologia e Chimica Agro-forestale ed Ambientale DiBCA) - Università degli Studi di Bari Aldo Moro, Dipartimento di Medicina Veterinaria (Ex Dipartimento di Sanità Pubblica e Zootecnia DISPeZ) - Università degli Studi di Foggia, Dipartimento di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex Dipartimento di Scienze degli Alimenti DiSA - Ex Dipartimento di Scienze Agro-ambientali, Chimica e Difesa Vegetale DiSACD - Ex Dipartimento di Scienze delle produzioni e dell innovazione dei sistemi agro-alimentari mediterranei PrIME) - Università del Salento, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali DiSTeBA (Ex Dipartimento di Ingegneria dell Innovazione DII) - Agriplan s.r.l. - Azienda Vinicola Cantele s.r.l. - Azienda Viti-vinicola Incoronata di Scapola Luca - Biotecgen s.r.l. - BonassisaLab s.r.l. - Cantine D Alfonso del Sordo s.r.l. - C.D.P. s.r.l. - Centro Latte Stasi s.r.l. - Ciullo Carni s.r.l. - Coop. Lavorazione Prodotti Agricoli Terra Maiorum - Industrie Fracchiolla s.r.l. - Lab. Instruments s.r.l. - Molini Tandoi Pellegrino S.p.A. 3

4 1.2 Settore/Ambito Il progetto si colloca all interno del Settore Agro-alimentare. 1.3 Sintesi del progetto (Abstract) Il progetto S.I.Mi.S.A si vuole inserire nell ampio scenario della problematica della sicurezza alimentare con un insieme strutturato di interventi di ricerca avanzata, guidata da qualificati attori internazionali, intervenendo in un contesto in cui le problematiche di contaminazione sempre più ricorrenti richiedono sforzi maggiori e comuni per innalzare in generale le soglie di sicurezza dei prodotti alimentari, con un raggio di azione che opera nelle fasi di produzione primaria e di trasformazione di alcuni prodotti pugliesi economicamente rilevanti. L obiettivo generale è quello di intervenire sui principali processi di prevenzione, controllo e correzione al fine di garantire elevati standard di sicurezza degli alimenti contribuendo alla realizzazione di un sistema di sicurezza lungo tutta la filiera. Oggetto della ricerca saranno alcuni tra i key foods pugliesi selezionati in base al rischio di contaminazione da differenti classi di contaminanti, in base alla loro valenza economica e territoriale, considerando il livello di interesse scientifico in termini di applicazione di tecnologie innovative. In particolare saranno considerati uva e vino, frumento e altri cereali e derivati, ed un insieme di prodotti freschi quali molluschi bivalvi, carni bovine, mozzarella e prodotti ortofrutticoli. I risultati attesi in termini di innovazione del processo di controllo nella sicurezza alimentare riguarderanno la messa a punto di nuovi metodi di analisi rapidi ed avanzati, per il monitoraggio e quantificazione di contaminanti chimici in vino (ocratossina, fitofarmaci, fenoli volatili), cereali e derivati (micotossine, fitofarmaci) e prodotti ortofrutticoli (metalli pesanti). Saranno sviluppati nuovi metodi per il rilevamento di microrganismi patogeni nelle carni (Listeria, Salmonella) e nei molluschi bivalvi (Giardia, Cryptosporidium, Toxoplasma) e di microrganismi alteranti nel vino (Brettanomyces) e nella mozzarella (Pseudomonas). Tutte le attività di ricerca saranno realizzate considerando i limiti imposti dalle normative esistenti come pure le esigenze reali delle imprese operanti nel settore di controllare i contaminanti chimici e microbici in situ nelle diverse fasi della filiera, nonché di utilizzare metodi affidabili e soprattutto accessibili ai tecnici preposti al controllo in azienda. I risultati attesi nell ambito dei processi di prevenzione consisteranno nello sviluppo di metodi e strumenti innovativi per la riduzione del rischio di contaminazione da microrganismi indesiderati e micotossine in vino e cereali, e da metalli pesanti in prodotti ortofrutticoli freschi. Parallelamente, in stretta correlazione e talvolta coincidenti con gli stessi strumenti di prevenzione, verranno applicati nuovi processi di correzione efficaci nella fase finale del processo produttivo, e ciò in particolare per la rimozione di microbici indesiderati e di micotossine in vino e frumento. Un approccio metagenomico è previsto per la caratterizzazione di microrganismi tossigeni e alteranti e di enzimi potenzialmente capaci di degradare l ocratossina in mosto e vino, mentre l ozono verrà impiegato a scopi preventivi e correttivi nella filiera cerealicola. Tutti gli output delle attività di ricerca si potranno tradurre in prodotti e servizi reali innovativi per le imprese partecipanti, consentendo di migliorare la propria competitività sui mercati di riferimento regionali e nazionali e di introdurre strategie di differenziazione dei propri prodotti e/o servizi. Come valore aggiunto del progetto, tali imprese potranno disporre di nuovi strumenti che, inseriti direttamente nei loro processi di produzione e controllo, miglioreranno le caratteristiche intrinseche dei prodotti finiti, apportando quel plus di qualità e di affidabilità sempre più richiesto dal mercato. In tal modo, le imprese locali sono supportate da un qualificato pool di esperti riconosciuti a livello internazionale, e quindi accompagnate nel loro percorso di crescita e di innovazione. 1.4 Sintesi del progetto (Abstract) The S.I.Mi.S.A project addresses the wide area of Food Safety, in a context requiring continuous efforts to increase the safety level of food products, by a structured approach of advanced research, led by experts of international standing level, with a focus on economically relevant Apulian products. The overall objective of the project is to improve the food safety system by research activities covering the prevention, control and correction steps to ensure high safety standards throughout the entire food chain. 4

5 The research will addressed key Apulian foods and selected groups of food contaminants in a differentiated way based on the risk of contamination, the economical and territorial impact and the level of scientific interest in terms of novel technologies transferable to the participating SMEs. In particular will be considered grape and wine, cereals (mainly wheat) and cereal products, and a group of fresh products including vegetables, mussels, mozzarella cheese and beef meat. New methods are expected to be developed for monitoring and control food safety by advanced technologies for rapid and/or multianalite detection and determination of chemical contaminants in wine (ochratoxin A, pesticides, volatile phenols), cereals and cereal products (mycotoxins, pesticides), and fresh vegetables (heavy metals), and of pathogenic microorganisms in meat (Listeria, Salmonella) and mussels (Giardia, Cryptosporidium, Toxoplasma), and alterative microorganisms in wine (Brettanomyces) and mozzarella cheese (Pseudomonas). In developing new methods and tools, absolute priority will be given to criteria fulfilling the existing European regulation. The real need of the industry for rapid and reliable methods to control chemical and microbial contaminants in situ through the entire food chain will be taken in due consideration as well as low cost and easy accessibility of the new tools to the industry personnel. With respect to preventative actions, new methods and tools are expected to be developed to reduce the risk of undesirable microorganisms and mycotoxins in wine and cereals as well as of heavy metals in fresh vegetables. Relevance is given to the development of new corrective actions focusing, in particular, to removing undesirable microorganisms and relevant toxic metabolites in wine and cereal products. A metagenomic approach will be used for charactering toxigenic or alterative microorganisms and enzymes involved in ochratoxin degradation in the wine chain. Ozone treatments will be used as preventative and corrective actions in the cereal chain. The research outputs will be made available to the SMEs involved in the project as new products and services allowing to improve their business competitiveness on national and international markets and to implement strategies for differentiating their products and/or services. The added value of the project for the participating SMEs consists in the new food safety tools that will be directly inserted in the production and control chain improving the intrinsic characteristics of the final products, with that plus of quality and reliability continuously demanded by the market. In such a way the local SMEs are supported by a qualified pool of experts accompanying them to growth with innovation Descrizione dell'obiettivo generale del progetto Il progetto S.I.Mi.S.A si vuole inserire nell ampio scenario della problematica della sicurezza alimentare con un insieme strutturato di interventi di ricerca avanzata, guidata da qualificati attori internazionali, intervenendo in un contesto in cui le problematiche di contaminazione sempre più ricorrenti richiedono sforzi maggiori e comuni per innalzare in generale le soglie di sicurezza dei prodotti alimentari, con un raggio di azione che opera nelle fasi di produzione primaria e di trasformazione di alcuni prodotti pugliesi economicamente rilevanti. Nel contesto attuale e futuro, la sfida è quella di trovare e sviluppare soluzioni valide e controllate che permettano di garantire cibi sani e sicuri lungo tutta la filiera produttiva, nel rispetto di determinati requisiti in genere definiti dalla normativa - per i prodotti alimentari e per la salute e il benessere degli animali e delle piante, prodotti all'interno dell'ue o importati. Questa impostazione consolidata di carattere internazionale si traduce anche a livello locale nello sviluppo di avanzati metodi scientifici, processi di trasformazione, sistemi di controllo, prevenzione e correzione, che rientrano in questo più ampio sistema avendo ad oggetto principale i prodotti localmente e destinati al consumo finale. Il concetto di glocal così si afferma anche nel settore alimentare attraverso la valorizzazione delle produzioni tipiche o locali in una visione globale, intesa sia in termini di capacità del prodotto locale di soddisfare bisogni globali (internazionalizzazione dei prodotti finiti/semitrasformati) sia in termini di rispetto di normative o regole di mercato internazionali (regolamenti comunitari, soglie di sicurezza accettate dal mercato). Il sistema alimentare della Regione Puglia si affaccia a pieno titolo nel mercato alimentare con un paniere di prodotti, non solo tipici, apprezzati dai mercati anche internazionali e con un insieme di materie prime, grano in primis, destinate alla trasformazione industriale, tutti interessati dalla sicurezza alimentare. Con questo progetto si intende avviare un cammino integrato verso la sicurezza alimentare con un approccio congiunto ma diversificato su alcune filiere e produzioni tipicamente pugliesi, attraverso azioni focalizzate su alcune problematiche di sicurezza riconosciute ed emergenti che scientificamente possono essere affrontate con interventi all avanguardia basati su tecnologie innovative, al fine di migliorare la sicurezza di materie prime e prodotti trasformati e quindi rafforzare la competitività delle imprese pugliesi 5

6 sui mercati di riferimento. Il progetto coinvolge gruppi di ricerca consolidati operanti a livello nazionale ed internazionale che hanno maturato significative competenze nel campo della sicurezza alimentare, attraverso esperienze differenziate e a volte complementari che potranno garantire un approccio multidisciplinare nello svolgimento delle attività proposte. L obiettivo generale è quello di intervenire sui principali processi di prevenzione, controllo e correzione al fine di garantire elevati standard di sicurezza degli alimenti contribuendo alla realizzazione di un sistema integrato di sicurezza lungo tutta la filiera. Oggetto della ricerca saranno alcuni tra i key foods pugliesi selezionati in base al rischio di contaminazione da differenti classi di contaminanti, in base alla loro valenza economica e territoriale, considerando il livello di interesse scientifico in termini di applicazione di tecnologie innovative. In particolare saranno considerati uva e vino, frumento e altri cereali e derivati, ed un insieme di prodotti freschi quali molluschi bivalvi, carni bovine, mozzarella e prodotti ortofrutticoli. In particolare, saranno messe a punto soluzioni ed interventi tecnologici ad hoc che consentiranno di rispondere in modo innovativo, ed al contempo economicamente sostenibile, alla richiesta di disporre di strumenti innovativi ed affidabili per - prevenire il rischio di contaminazione da micotossine e metalli pesanti, microrganismi patogeni ed alteranti nel vino, frumento e prodotti freschi (mozzarelle e prodotti ortofrutticoli), - migliorare il controllo di contaminanti (metalli pesanti, micotossine, fitofarmaci, allergeni) e microrganismi patogeni nell uva/vino, cereali e derivati e prodotti freschi (prodotti ortofrutticoli, carni bovine, molluschi bivalvi), - rimuovere metaboliti microbici indesiderati (ocratossina A) nel mosto/vino e microrganismi indesiderati e loro metaboliti tossici e insetti nel frumento. I risultati attesi in termini di innovazione del processo di controllo nella sicurezza alimentare riguarderanno la messa a punto di nuovi metodi di analisi rapidi ed avanzati, per il monitoraggio e quantificazione di contaminanti chimici in vino (ocratossina, fitofarmaci, fenoli volatili), cereali e derivati (micotossine, fitofarmaci) e prodotti ortofrutticoli (metalli pesanti). Saranno sviluppati nuovi metodi per il rilevamento di microrganismi patogeni nelle carni (Listeria, Salmonella) e nei molluschi bivalvi (Giardia, Cryptosporidium, Toxoplasma), e di microrganismi alteranti nel vino (Brettanomyces) e nella mozzarella (Pseudomonas). Tutte le attività di ricerca saranno realizzate considerando i limiti imposti dalle normative esistenti come pure le esigenze reali delle imprese operanti nel settore di controllare i contaminanti chimici e microbici in situ nelle diverse fasi della filiera, nonché di utilizzare metodi affidabili e soprattutto accessibili ai tecnici preposti al controllo in azienda. I risultati attesi nell ambito dei processi di prevenzione consisteranno nello sviluppo di metodi e strumenti innovativi per la riduzione del rischio di contaminazione da microrganismi indesiderati e micotossine in vino e cereali, e da metalli pesanti in prodotti ortofrutticoli freschi. Parallelamente, in stretta correlazione e talvolta coincidenti con gli stessi strumenti di prevenzione, verranno applicati nuovi processi di correzione efficaci nella fase finale del processo produttivo, e ciò in particolare per la rimozione di microbici indesiderati e di micotossine in vino e frumento. Un approccio metagenomico è previsto per la caratterizzazione di microrganismi tossigeni e alteranti e di enzimi potenzialmente capaci di degradare l ocratossina in mosto e vino, mentre l ozono verrà impiegato a scopi preventivi e correttivi nella filiera ceralicola. Tutti gli output delle attività di ricerca si potranno tradurre in prodotti e servizi reali innovativi per le imprese partecipanti, consentendo di migliorare la propria competitività sui mercati di riferimento regionali e nazionali e di introdurre strategie di differenziazione dei propri prodotti e/o servizi. Come valore aggiunto del progetto, tali imprese potranno disporre di nuovi strumenti che, inseriti direttamente nei loro processi di produzione e controllo, miglioreranno le caratteristiche intrinseche dei prodotti finiti, apportando quel plus di qualità e di affidabilità sempre più richiesto dal mercato. In tal modo, le imprese locali sono supportate da un qualificato pool di esperti riconosciuti a livello internazionale, e quindi accompagnate nel loro percorso di crescita e di innovazione. Infatti, molti ricercatori partecipanti al S.I.Mi.S.A., insieme ad alcune imprese collegate, sono direttamente coinvolti in progetti collaborativi del 7 Programma Quadro dell Unione Europea (MycoRed, CONffIDENCE, BiAMFOOD) e in un Network di Eccellenza del 6 Programma Quadro (MoniQA) nell ambito della sicurezza alimentare e potranno dunque mettere a disposizione e trasferire le loro esperienze e relazioni internazionali a tutti gli altri partner 6

7 rafforzando la condivisione dell approccio scientifico comunitario e il processo di internazionalizzazione delle imprese. In tal modo, tutto il Distretto potrà beneficiare di questa fortunata integrazione tra industria e ricerca, generando processi virtuosi di innalzamento delle competenze, di apprendimento collettivo e di sviluppo economico che valorizza il territorio pugliese creando sistema. 1.6 Descrizione degli elementi di coerenza del progetto con il Piano di cui all art.5 dell Avviso MIUR prot.n.713/ric. del 29 ottobre 2010, con le strategie del PON R&C, d integrazione con le politiche regionali in materia di ricerca e innovazione, di rispetto dei principi orizzontali Il Progetto discende dalla più ampia strategia del Distretto Tecnologico ed è con essa intimamente connesso. Il Distretto ad Alta Tecnologia Agroalimentare Regionale (D.A.Re), infatti, pone come uno dei sui obiettivi strategici quello di elevare la base scientifica e tecnologica del sistema della ricerca della Regione Puglia promuovendo le attività di ricerca in tecnologie chiave, incidendo sui dottorati di ricerca e sulla formazione di tecnici qualificati, potenziando le infrastrutture di ricerca delle Università e dei Centri di ricerca pubblici e privati. L azione strategica risulta indispensabile per poter affrontare alcuni dei principali ostacoli ad una sempre più spinta innovazione del sistema regionale, ovvero la limitata quota di finanziamenti privati destinati alla ricerca e, più in generale, la limitata attività di ricerca e sviluppo nelle PMI regionali, la ridotta partecipazione ai principali programmi di ricerca nazionali ed internazionali, la domanda di professionalità tecniche e scientifiche non sempre efficacemente corrisposta, la tendenza alla fuga dei talenti. Pertanto, all interno dell Asse Strategico I del Piano di Distretto sono individuate specifiche attività che in modo diretto richiamano i contenuti della presente proposta progettuale: I Promozione di attività di RST su tecnologie chiave per lo sviluppo delle imprese I Rafforzamento delle Scuole di Dottorato I Formazione di tecnici sulle tecnologie chiave Per quel che concerne la ricerca scientifica, l orientamento strategico del Distretto è di focalizzarsi su un numero definito e limitato di aree scientifico-tecnologiche strategiche tali da rispondere alle principali agende strategiche internazionali e nazionali e di valorizzare a pieno le competenze scientifiche presenti nel territorio. Il progetto S.I.Mi.S.A risponde esattamente ai due criteri appena enunciati ed è stato inserito nella proposta in quanto (a) propone un ambito tecnologico distintivo che emerge direttamente da esigenze delle imprese locali ed è perciò idoneo a sviluppare e consolidare la competitività del territorio, (b) è pienamente coerente con le agende strategiche di riferimento, (c) presta particolare attenzione alla connessione con tecnologie trasversali ed abilitanti in modo da favorire il complessivo adattamento del sistema ed aumentare la complessiva absorptive capacity del Distretto. Rimandando ad una più ampia lettura del Piano Strategico per individuare gli elementi di connessione del progetto con la domanda locale di innovazione, in questa fase ci si limita a presentare brevemente gli elementi di coerenza con le politiche in materia di innovazione e di rispetto dei principi orizzontali. La proposta progettuale si pone in assoluta coerenza con gli obiettivi generali della programmazione nazionale e comunitaria. Infatti, la sicurezza dei prodotti è diventata un fattore chiave della politica agroalimentare europea, portando l UE a lanciare una strategia a tutto tondo, investendo tutta la filiera, con l intento di rafforzare la fiducia dei consumatori relativamente agli alimenti che consumano. Così sia la normativa europea adottata sull uso dei pesticidi nella produzione di alimenti e sulla presenza negli alimenti e materie prime di microrganismi patogeni, micotossine, allergeni e metalli pesanti, sia la strategia di ricerca perseguita a livello comunitario costituiscono lo scenario con cui il progetto si dimostra coerente. Nel complesso questa strategia, che poggia sulla combinazione di standard per la produzione e trasformazione degli alimenti, salute e benessere degli animali e salute delle piante, ha portato a individuare quattro importanti elementi: regole per la sicurezza degli alimenti e dei mangimi animali; sistemi di controllo e valutazione scientifica indipendenti e pubblici; azioni per rafforzare le regole di controllo dei processi; garanzie perché la scelta dei consumatori sia basata su una completa informazione sulle proprietà degli alimenti, gli ingredienti contenuti e la loro provenienza. 7

8 Il 7 Programma Quadro Europeo per la ricerca, infatti, tra le aree tematiche del programma di lavoro in campo agroalimentare (KBBE, Knowledge Based Bio-Economy) privilegia attività di ricerca focalizzate sui nuovi processi produttivi e di controllo a garanzia della sicurezza di alimenti sia freschi che trasformati attraverso innovativi sistemi di tracciabilità, valutazione del rischio, sicurezza microbiologica. In questo contesto il progetto recepisce puntualmente i principi definiti nella linea di ricerca Food, Agriculture and Fisheries, and Biotechnology del KBBE applicandoli in un ambito territoriale che rappresenta un substrato ideale in termini di i) capacità tecnologica, ii) know-how scientifico, iii) strumentazione avanzata, iv) bacino di produzione di materie prime, v) pool di PMI aperte all innovazione DARe). Inoltre i ricercatori partecipanti al S.I.Mi.S.A., ed alcune imprese ad essi collegate, sono direttamente coinvolti in almeno 3 progetti collaborativi del 7 Programma Quadro (MYCORED, CONffIDENCE, BiAMFOOD) e in un Network di Eccellenza del 6 P.Q. (MoniQA) ancora attivo nell ambito della sicurezza alimentare, e potranno mettere a disposizione e trasferire le loro esperienze e relazioni internazionali a tutti gli altri partner favorendo la condivisione dell approccio scientifico comunitario e il processo di internazionalizzazione delle imprese. Inoltre, la Piattaforma Tecnologica Europa Food for Life, lanciata nel 2005 con l intento di facilitare l innovazione, il trasferimento tecnologico e l aumento della competitività, sta contribuendo incisivamente a rafforzare le relazioni e collaborazioni tra ricercatori e imprenditori proprio per definire linee di ricerca e innovazione maggiormente rispondenti ai bisogni dei consumatori. Tale impegno è stato fatto proprio nell Agenda Strategica di Ricerca della stessa Piattaforma che individua le principali traiettorie scientifiche e tecnologiche che devono orientare le autorità nazionali e comunitarie nella definizione di bandi per la ricerca e nel settore alimentare. Il progetto S.I.Mi.S.A., coerentemente con gli obiettivi fondamentali della Piattaforma Tecnologica Food for Life, risponde al Key Thrust 2 dell Action Plan (in fase di definitiva approvazione) ovvero Rafforzare la fiducia del consumatore verso la filiera alimentare, inserendosi a pieno titolo nell area di ricerca prioritaria Sicurezza Alimentare con argomenti che riguardano lo sviluppo di strumenti innovati ed appropriati per il rilevamento e lo studio di contaminanti noti ed emergenti, di metodi analitici sensibili ed accurati, e il comportamento dei contaminanti chimici e biologici nella filiera agroalimentare. I fondamentali indirizzi dell Unione Europea sono confermati nella programmazione nazionale in materia di ricerca ed innovazione così come attestano ampiamente il Quadro Strategico Nazionale (QSN) per la politica regionale di sviluppo e il Piano Nazionale della Ricerca, attualmente in fase di condivisione. In particolare, nella piena integrazione tra strategia europea, nazionale e regionale, il progetto proposto tende a sostenere un nuovo modello di sviluppo dell economia pugliese basato sulla conoscenza e l uso sostenibile delle risorse. Esso si innesta, peraltro, su una tematica che risulta di particolare rilevanza non solo per i potenziali benefici economici per le imprese coinvolte ma anche per le ricadute sul benessere dei cittadini. Infatti, la possibile industrializzazione dei prototipi innovativi nel campo della qualità e sicurezza alimentare, oltre a costituire una fonte di vantaggio competitivo per le aziende coinvolte, rappresenterebbe anche un indubbio elemento di valorizzazione dei prodotti agricoli locali e un beneficio enorme per i consumatori. La coerenza con la strategia regionale inoltre è altrettanto evidente nell impostazione che si è data alla proposta progettuale. Innanzitutto, la Regione Puglia nel sottoscrivere l Accordo di Programma Quadro con il Miur ha indicato chiaramente la presenza di competenze forti in campo agroalimentare nell ambito degli organismi di ricerca partecipanti al progetto. Nello stesso documento, la Regione riconosce l importante ruolo nell ambito del proprio sistema produttivo delle iniziative tese a promuovere la salubrità e la qualità dei prodotti agro-alimentari. Come ultimo elemento, il progetto risulta rispettoso dei vincoli di coerenza con i principi orizzontali della programmazione comunitaria. In particolare, il partenariato è implementato in maniera evidente attraverso la partecipazione al progetto di un nutrito numero di soggetti che, pur essendo in alcuni casi potenziali concorrenti, hanno deciso di collaborare per raggiungere sinergie e massa critica tali da consentire risultati ottimali. Peraltro, al progetto partecipa, come soggetto garante dell efficace implementazione del partenariato pubblico-privato il Distretto Tecnologico promosso dal Miur e dalla Regione Puglia. Un dato evidente è la partecipazione femminile la cui ampia partecipazione al progetto è assicurata dal fatto che essa è già oggi particolarmente significativa all interno dei laboratori di ricerca dei soci del Distretto Tecnologico. Chiaramente, sussiste l impegno di ciascun partner a non utilizzare alcuna forma di discriminazione verso 8

9 alcuno così come comune è la responsabilità a garantire la sostenibilità ambientale del progetto attraverso un oculato utilizzo di ogni risorsa e di ciascun output del progetto. 2) STATO DELL ARTE Lo stato dell arte viene presentato attraverso l approfondimento delle principali conoscenze disponibili relative alla sicurezza alimentare che riguardano metodologie e sistemi di prevenzione, controllo e correzione utilizzati o in via di utilizzazione nello scenario della ricerca scientifica nazionale ed internazionale, considerando anche le potenzialità di applicazione nel mondo industriale. Nella fattispecie, sono considerate alcune problematiche tecnico-scientifiche relative alla sicurezza alimentare di importanti filiere agroalimentari pugliesi; in particolare quelle considerate nel presente progetto sono: a) uva e vino, b) cereali (soprattutto frumento) e derivati, c) prodotti freschi quali prodotti ortofrutticoli (pomodoro, lattuga), mozzarella, molluschi bivalvi (cozze tarantine) e carni bovine. a) Strumenti innovativi per il monitoraggio di contaminanti ed allergeni, per la riduzione del rischio di microrganismi alteranti e la rimozione/degradazione dell ocratossina A nella filiera vitivinicola. Le attuali attività di ricerca per migliorare la sicurezza della filiera viti-vinicola affrontano problematiche legate alla contaminazione dell ocratossina A (OTA), una micotossina cancerogena, nefrotossica, neurotossica, epatotossica ed immunotossica; all alterazione dei vini a causa del lievito Brettanomyces bruxellensis, produttori di fenoli volatili maleodoranti, intervenendo con misure preventive, correttive e di controllo, e si propongono di sviluppare metodi avanzati per il rilevamento di fitofarmaci ed allergeni nei vini. Una delle principali cause di alterazione del vino in tutto il mondo è dovuta al lievito emiascomiceto Brettanomyces bruxellensis, microrganismo anaerobio facoltativo altamente tollerante all etanolo (1) che rappresenta una problematica microbiologica di difficile gestione da parte degli operatori (2). B. bruxellensis possiede infatti nel corredo metabolico enzimi che trasformano gli acidi idrossicinnamici in etil-derivati, ovvero fenoli volatili, quali 4-etilfenolo ed 4-etilguaiacolo. La soglia sensoriale umana per gli etil-derivati prodotti da B. bruxellensis è molto bassa (3), per cui anche in quantità minime essi possono compromettere la qualità olfattiva dei vini. Infatti, descrittori olfattivi come "fenolico", "animale", "sudore di cavallo" e "stalla" vengono spesso usati per descrivere la loro presenza (4-6). L'additivo più comunemente usato per controllare la crescita di microrganismi nei vini è l anidride solforosa (SO 2 ), che tuttavia non risulta essere esaustivo della risoluzione del problema. Altre metodiche applicabili per la risoluzione di questa problematica in vino sono: utilizzo delle pareti cellulari di lieviti nell assorbimento di etilfenoli (7, 8), ottimizzazione dei parametri chimico-fisici di produzione del vino per limitare l attività degli enzimi coinvolti nella biosintesi degli etilfenoli (9), minimizzazione dei precursori mediante lieviti produttori di piranoantocianine (10), controllo della popolazione di B. bruxellensis mediante lieviti produttori di tossine killer (11-13), uso di antimicrobici come chitosano (14), acido sorbico (15), dimetil-dicarbonato (16), campi elettrici pulsati (17), inattivazione termica (18). L impiego di specifici starter microbici per l inibizione ed il controllo di B. bruxellensis, specie dopo la fine della fermentazione alcolica e durante quella malolattica, è stato recentemente proposto a livello commerciale (19). I vini rossi pugliesi sono costantemente minacciati dalla contaminazione da ocratossina A (OTA), prodotta sull uva (prevalentemente uva da vino) prima della raccolta dal fungo Aspergillus carbonarius. L elevata tossicità a basse concentrazioni e la lunga persistenza nei fluidi biologici (emivita di circa 35 gg nell uomo) rendono l OTA un rischio di sicurezza alimentare concreto ed insidioso (20, 21). Inoltre i dati europei sulla presenza di questa micotossina nei prodotti agroalimentari dimostrano che in Italia il vino rappresenta la principale fonte di assunzione dell OTA (22). Il regolamento n. 1881/2006 della Commissione Europea fissa a 2,0 µg/kg il tenore massimo ammissibile di OTA nel vino, mosto e succo d uva, e diverse aziende vitivinicole si impongono limiti decisamente più bassi per le loro produzioni di qualità. Le misure di prevenzione in campo nelle fasi fenologiche che seguono l invaiatura sino alla raccolta rappresentano sicuramente la migliore strategia per evitare la contaminazione da OTA sebbene queste misure possono risultare inefficaci soprattutto nelle annate particolarmente sfavorevoli per cui spesso ci si ritrova in cantina con partite di mosto altamente contaminate. Le principali strategie di prevenzione per il controllo e la riduzione della contaminazione da OTA in campo comprendono sia una equilibrata gestione del vigneto, sia l uso di fungicidi contro A. carbonarius, sia trattamenti con insetticidi contro la Lobesia botrana, un insetto che favorisce l infezione da A. carbonarius (23). La misura più efficace per la riduzione dell OTA nei 9

10 mosti/vini in cantina si basa sull uso del carbone enologico, da solo o in miscela con altri chiarificanti, che adsorbe in modo aspecifico la tossina e viene allontanato tramite travaso/filtrazione. Purtroppo il carbone produce effetti devastanti sulle caratteristiche organolettiche dei vini trattati riducendone drasticamente il corpo, l indice di colore e le concentrazioni di polifenoli (24). Altre metodiche applicabili per la riduzione dell OTA fanno uso di lieviti o di pareti cellulari di lieviti (25-27), Oenococcus o Lactobacillus (28) o trucioli di quercia (29). Ricerche condotte dall ISPA hanno dimostrato che durante la vinificazione il 95% dell OTA originariamente presente nell uva rimane adesa alle vinacce mentre solo il 4% si scioglie nel mosto/vino e l 1% rimane adeso alle fecce (30, 31). Durante la macerazione l OTA si distribuisce omogeneamente tra parte solida e liquida con un equilibrio dinamico che viene raggiunto in un tempo proporzionale alla concentrazione di OTA nelle uve. L elevata attitudine delle vinacce ad adsorbire l OTA suggerisce il possibile uso delle vinacce incontaminate o di suoi componenti per rimuovere la tossina dai mosti/vini contaminati (31). Un altro approccio, molto studiato e in continua evoluzione, per la degradazione dell OTA nei mosti/vini è quello biologico, che utilizza microrganismi o i loro enzimi (peptidasi, lipasi, proteasi acide) (32-34). Allo stato attuale non è stato realizzato nessuno studio che prevede l analisi funzionale dell intero microbioma presente nelle diverse fasi della fermentazione vinaria con la possibilità di individuare potenziali attività enzimatiche di microrganismi autoctoni in grado di detossificare/degradare l OTA. La necessità di disporre di un metodo di analisi rapido e validato per la determinazione dell OTA, ma anche del glucosio e dell etanolo, è molto sentita dalle aziende vinicole per garantire un monitoraggio costante sia delle materie in entrata in cantina, sia del prodotto finito a costi ridotti. Attualmente sono disponibili numerosi metodi analitici per la determinazione di OTA in diverse matrici alimentari e nelle bevande, di cui alcuni validati con studi interlaboratorio e adottati come metodi ufficiali dall AOAC International e/o dal CEN (European Committee for Standardization) (35-37). Mentre le tecniche cromatografiche di analisi sono ormai consolidate, le tecniche di estrazione e purificazione alternative e rapide sono in continua evoluzione come, per esempio, l MEPS (Micro Extraction by Packed Sorbent) che, accoppiata con l HPLC, permette di eseguire in automatico preconcentrazione, estrazione, purificazione e quantificazione della tossina (38-39). I biosensori amperometrici offrono invece la possibilità di monitorare simultaneamente glucosio ed etanolo in mosti e vini (40-43). Queste tecniche devono comunque essere validate secondo le recenti normative europee che richiedono criteri di prestazione molto stringenti (44, 45). I regolamenti comunitari, oltre all OTA, impongono anche il monitoraggio di pesticidi e fitofarmaci (Reg. CE/396/2005 e Reg. CE/839/2008). L uso delle metodiche analitiche tradizionali, quali GC-MS e LC-MS, per la determinazione dei fitofarmaci soddisfa i requisiti analitici soprattutto in ambito targeted, dedicato ai fitofarmaci posti sotto regulatory acts ed untargeted, volti alla indagine sulla presenza di fitofarmaci, metaboliti e prodotti di degradazione. Il crescente sviluppo di strumentazioni nel campo della spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) permette di sviluppare metodiche che soddisfino le suddette richieste (46). L alta sensibilità raggiungibile e la possibilità di effettuare uno screening su un elevato numero di analiti introduce nuovi aspetti diagnostici e predittivi nell analisi quali-quantitativa di routine in relazione alla gestione del rischio correlata alla individuazione di molecole nuove nella procedura analitica di controllo. L uso di materiali di riferimento certificati permette di valutare la bontà della determinazione analitica e validare quindi la metodica analitica. Data la non disponibilità di materiali di riferimento certificati per i fitofarmaci nella matrice vino, sarebbe auspicabile preparare miscele di fitofarmaci in soluzione e materiali certificati (vino) da utilizzare nei processi di validazione di metodiche multi-analita per la determinazione di fitofarmaci. Un altro aspetto di sicurezza alimentare che riguarda anche i vini sono gli allergeni, per i quali la Commissione Europea richiede l obbligo di indicarli in etichetta (una proroga è stata concessa con il Regolamento CE 1266/2010). Le proteine del latte (caseine) e le proteine del bianco d uovo (albumina), noti allergeni alimentari, sono largamente utilizzati dall industria vinicola per l illimpidimento dei vini. A tal riguardo le metodiche LC-MS rappresentano una tecnologia avanzata molto potente per l identificazione e/o conferma di allergeni contaminanti le matrici alimentari e richieste per corroborare i risultati degli immunosaggi ELISA comunemente usati in questo settore (47, 48). Il vino rappresenta una matrice ancora in fase di studio. Recentemente presso l ISPA-CNR sono stati identificati tramite LC-MS alcuni peptidi marker delle caseine in campioni di vino chiarificato (49). Tuttavia l approccio più utilizzato per la rivelazione di allergeni in prodotti alimentari si basa su immunosaggi (48). Allo scopo di avere saggi di facile implementazione lungo tutta la filiera vitivinicola, ad oggi gli sforzi sono mirati essenzialmente allo sviluppo di metodiche rapide e semplici nell esecuzione quali LFD (lateral flow devices) finora disponibili solo con applicazioni in altri prodotti alimentari (50). In riferimento allo sviluppo di biosensori basati su tecnologia 10

11 SPR (Surface Plasmon Resonance), il loro campo di applicazione risulta ad oggi ancora molto limitato, con pochi esempi riferiti ad altri allergeni alimentari (48). Immunosaggi utilizzanti la tecnologia della polarizzazione di fluorescenza risultano invece ad oggi ancora inesplorati. Tali metodi rapidi opportunamente ottimizzati potrebbero rivelarsi utili strumenti per il monitoraggio rapido di eventuali proteine allergeniche residue in vini chiarificati. b) Strumenti innovativi per il monitoraggio di micotossine e fitofarmaci in cereali e prodotti derivati e per prevenire/ridurre la contaminazione da microrganismi indesiderati e l infestazione di insetti nel frumento. La contaminazione da micotossine in cereali e prodotti derivati è un problema di sicurezza alimentare a livello globale. Essendo determinata da un complesso di condizioni ambientali ed ecologiche (temperatura, precipitazioni, umidità relativa, suscettibilità del prodotto alla contaminazione dal fungo), tale contaminazione può essere ridotta, ma non completamente eliminata. Le micotossine più importanti per diffusione ed incidenza di contaminazione e per i loro effetti tossici su uomini ed animali sono: aflatossine, ocratossina A (OTA), fumonisine, zearalenone e tricoteceni, in particolare deossinivalenolo (DON), tossine T-2 e HT-2. Esse sono ritrovate con frequenza in cereali e prodotti derivati, anche a livelli di un certo interesse tossicologico (51, 52). Al fine di proteggere la salute dei consumatori dal rischio di esposizione a questi contaminanti naturali, la Commissione Europea ha recentemente fissato i valori massimi ammissibili per alcune micotossine in diversi prodotti agroalimentari (53, 54). Per le tossine T-2 e HT-2 i limiti sono attualmente in discussione. Per assicurare il rispetto della legislazione e preservare la salute del consumatore dall esposizione a tali contaminanti è necessario disporre di metodiche analitiche robuste ed affidabili in grado di determinarne i livelli negli alimenti. Negli ultimi decenni la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è diventata la tecnica più ampiamente utilizzata per l analisi delle micotossine in alimenti e mangimi (55, 56). In questo contesto l utilizzo dello spettrometro di massa (MS) come rivelatore ne aumenta ulteriormente le potenzialità, offrendo la possibilità di ottenere determinazioni quantitative e conferma univoca dell identità degli analiti in un unica analisi, in conformità con quanto richiesto dalla legislazione vigente (57, 58). La diffusione di questa tecnica ha aperto inoltre la strada allo sviluppo di metodiche multi-analita per la determinazione simultanea di micotossine (59). La crescente disponibilità sul mercato di strumentazione LC-MS(MS) basata su una tecnologia avanzata e in continua evoluzione sta agevolando notevolmente il processo di trasferimento di metodiche tradizionali su strumentazione LC-MS consentendo una significativa riduzione dei tempi e dei costi dell analisi (59). Tuttavia, le recenti pubblicazioni in merito mettono in evidenza come queste metodiche non siano facili da sviluppare proprio in ragione delle diverse proprietà chimico-fisiche delle varie micotossine, che devono essere attentamente gestite in tutte le fasi della procedura analitica. Nonostante il crescente numero di pubblicazioni scientifiche proponenti nuove metodiche multimicotossina in varie matrici basate sull utilizzo di strumentazione LC-MS (59-61), si riscontra la necessità di verificare la robustezza di questi approcci mediante validazione intra- e inter-laboratorio prima di poterne prevedere un effettivo utilizzo in laboratori di controllo. L uso di materiali di riferimento certificati permette di valutare l accuratezza delle determinazioni analitiche. Considerato il crescente interesse nello sviluppo di metodiche multi-analita, l attuale disponibilità di materiali di riferimento certificati per micotossine non sempre riesce a soddisfare pienamente le esigenze dell operatore. Attualmente sono infatti disponibili sul mercato materiali di riferimento certificati per singole micotossine, o micotossine appartenenti alla stessa famiglia (FAPAS, ERM, BCR ). Nei processi di validazione di metodiche multi-analita si riscontra pertanto la necessità di utilizzare materiali di riferimento contenenti un numero più elevato di micotossine, e in particolare quelle sottoposte a regolamentazione in EU. Tra le micotossine che contaminano i cereali, DON, OTA e tossine T-2 e HT-2 sono quelle più frequentemente ritrovate nel frumento e prodotti derivati (crusca, farina, pasta). La determinazione accurata di queste micotossine avviene comunemente mediante metodi di tipo cromatografico (LC-FD/DAD o LC-MS) che, sebbene garantiscano un elevata sensibilità e specificità, non sono proponibili come metodi rapidi di screening in quanto sono costosi e richiedono lunghi tempi di analisi (62). Lo sviluppo di metodi rapidi, semplici, sensibili ed affidabili per la determinazione analitica di tali contaminanti naturali è pertanto di notevole interesse. Negli ultimi anni particolare attenzione è stata rivolta allo sviluppo di metodi rapidi basati sull impiego di anticorpi o recettori sintetici (aptameri), come immunosaggi basati sulla polarizzazione di fluorescenza (FPIA) e lateral flow devices (LFD), e di metodi non-invasivi basati sulla spettroscopia nel vicino infrarosso (NIR) o sull impiego del naso elettronico per la determinazione quantitativa o semiquantitativa di micotossine in matrici alimentari (56, 63-68). Questi metodi sono stati sviluppati prevalentemente per la determinazione del DON in cariossidi di cereali e alcuni kit, basati sull impiego di 11

12 anticorpi, sono anche commercialmente disponibili. Tuttavia la loro applicazione a matrici alimentari non sempre permette una determinazione accurata e precisa della micotossina dando spesso un risultato che sovrastima il reale contenuto di tossina (effetto matrice). Metodi rapidi ed affidabili per la determinazione del DON in prodotti derivati del frumento (farina, crusca, farinaccio) e dell OTA e delle tossine T-2 e HT-2 in frumento e prodotti derivati, nel farro e nella pasta di farro non sono stati ancora sviluppati. I fitofarmaci sono tra i contaminanti chimici più frequentemente ritrovati nei prodotti alimentari, inclusi i cereali (69). Circa 500 fitofarmaci sono attualmente sottoposti a regolamentazione in numerose matrici agroalimentari in Europa (70). Per assicurare il rispetto della legislazione e preservare la salute del consumatore dall esposizione a tali contaminanti è necessario quindi disporre di metodiche analitiche robuste ed affidabili in grado di identificarne la presenza negli alimenti. Il crescente interesse per l applicazione delle tecniche LC-MS, accanto ai tradizionali approcci GC-MS, per la determinazione di fitofarmaci è da attribuirsi almeno in parte alla possibilità di determinare in un'unica analisi un elevatissimo numero di composti, ottenendo la determinazione quantitativa e la conferma univoca dell identità dell analita, in conformità con quanto richiesto dalle linee guida ufficiali (58). La disponibilità di miscele di standard certificati e di materiali di riferimento certificati contenenti diversi fitofarmaci supporteranno l implementazione di queste metodiche per l analisi di routine e nei controlli ufficiali. L elevato numero degli analiti da determinare e la complessità delle matrici da analizzare rendono particolarmente complesso il problema della preparazione del campione. La tendenza attuale è quella di semplificare il più possibile questa fase, spesso ridotta alla sola estrazione o ad una purificazione rapida, per esempio mediane l uso di QueChers (71, 72). Questa strategia, che si traduce in una minore selettività della fase di pretrattamento, consente di determinare nell estratto un maggiore numero di analiti. Tale approccio richiede però l uso di una strumentazione particolarmente sensibile e selettiva in grado di discriminare le molecole di interesse in estratti complessi. In questo contesto la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) rappresenta una soluzione particolarmente appropriata (46). In letteratura sono riportati numerosi esempi di applicazione delle tecniche GC-MS e LC-MS per l analisi di fitofarmaci (73), tuttavia la maggior parte di questi è dedicata alla determinazione dei composti tal quali, non prendendo in considerazione i possibili metaboliti e/o prodotti di trasformazione (analisi targeted). Al contrario, si riscontra una crescente necessità di disporre di protocolli generici di preparazione del campione e metodiche di analisi untargeted per poter determinare simultaneamente composti precursori e relativi metaboliti. Recenti studi hanno dimostrato come l analisi simultanea di fitofarmaci e micotossine in matrici agroalimentari sia possibile, sebbene le caratteristiche analitiche di tali metodi in termini di accuratezza e precisione non siano ancora soddisfacenti. Per esempio, sono stati descritti metodi capaci di estrarre simultaneamente 172 pesticidi e 36 tossine in matrici quali mais, carne, latte e uova mediante UPLC- MS(MS) e metodi di analisi per 163 pesticidi e 14 micotossine nel grano mediante LC-MS(MS) (74, 75). Un altro problema di sicurezza per l intera filiera cerealicola è rappresentato dalla ricorrente contaminazione da insetti e microrganismi indesiderati (funghi tossigeni e bacilli) nelle granaglie che, in fase di stoccaggio, potrebbero compromettere la qualità della materia prima. In particolare il frumento risulta comunemente contaminato da funghi del genere Aspergillus e Fusarium (produttori di micotossine quali OTA e DON) (76, 77). Lepidotteri (Tignole in particolare) e Coleotteri (Sitophilus granarius, Trogoderma granarium, Tribolium confusum, Rhyzopertha dominica) sono i principali insetti infestanti delle granaglie (78). Inoltre, le farine di grano possono contenere anche batteri sporigeni del genere Bacillus responsabili di un alterazione del pane molto diffusa definita pane filante (79, 80). La loro presenza nel frumento e prodotti derivati comporta gravi ripercussioni sul mercato, sia sotto l aspetto socio-economico, che sanitario. Il controllo di questi contaminanti prevede generalmente l uso di buone pratiche agricole e di stoccaggio, sebbene in alcuni casi risulti necessario l uso di fungicidi e insetticidi per prevenire/ridurre la contaminazione (81). Recentemente è stato riportato in letteratura l uso di ozono per il controllo di funghi, micotossine ed insetti nelle granaglie (82, 83). L ozono è un efficace gas ossidante a basso impatto ambientale che può essere generato in loco eliminando i problemi legati alla conservazione, manipolazione e trasporto. Dal 2001 l FDA (U.S. Food and Drug Administration) ammette l'impiego di ozono nei processi produttivi dell'industria alimentare (84). Tutti i processi riportati in letteratura sono stati svolti in condizioni non trasferibili a livello industriale poiché le quantità di granaglie trattate erano limitate (decine di kg), i tempi di contatto molto lunghi (giorni) e le prove svolte non confrontavano diverse metodologie applicabili (ozono gassoso e/o acqua ozonizzata) al fine di individuare quale fosse la migliore tecnica da utilizzare o studiare, ad esempio, l azione sinergica tra le due applicazioni. 12

13 c) Strumenti innovativi per il monitoraggio di metalli pesanti, microrganismi alteranti e patogeni in prodotti freschi. La quantità di metalli quotidianamente assunti con l alimentazione è in continuo aumento a causa sia della contaminazione ambientale, sia delle tecniche di coltivazione che utilizzano spesso substrati, ricchi di metalli pesanti, come il nichel, cadmio, piombo, cromo e cobalto quali ad esempio acque e suoli inquinati, fertilizzanti, fanghi di depurazione e scarti industriali (85, 86). Il rischio per la salute umana relativo all assunzione di metalli pesanti è legato alle diverse disfunzioni o, in alcuni casi, all effetto cancerogeno indotti dalla loro presenza e accumulo nell organismo oltre determinati livelli. Inoltre, evidenze cliniche e sperimentali dimostrano come l elevata esposizione a metalli pesanti stia provocando un incremento di infiammazioni croniche immunomediate (87). In Italia l assunzione di piombo e cadmio nella dieta è dovuta prevalentemente a frutta e ortaggi (rispettivamente, 117 e 105 μg/settimana). Per tali metalli sono previsti limiti massimi ammissibili in alcune categorie alimentari (53). Negli ultimi anni, l agricoltura è chiamata sempre più a rispondere alla esigenza di definire modelli di recupero delle crescenti quantità di rifiuti, che altrimenti sarebbero avviate in discarica (87-91). L utilizzazione del compost come ammendante può sopperire al progressivo depauperamento della sostanza organica nel terreno, sebbene possa comportare rischi per la salute umana e per l ambiente. Nell ottica di ridurre il pericolo derivante dalla presenza di metalli pesanti nei compost, i sistemi senza suolo, sempre più utilizzati in agricoltura, possono rappresentare degli efficaci e alternativi sistemi di produzione e, comunque, un valido strumento nello studio della nutrizione delle piante, incluse le interazioni con i metalli pesanti. Al senza suolo si possono aggiungere anche tecniche innovative, quali ad esempio l innesto erbaceo. Questa tecnica viene proposta per la prevenzione o la riduzione delle perdite di produzione causate da condizioni di stress abiotici, in particolare quelli causati da metalli pesanti, modificando la captazione degli stessi da parte della pianta (92). Metodi avanzati di analisi con raggi X di sincrotrone possono, inoltre, permettere di comprendere i processi che permettono alle piante di modificare l assorbimento e la traslocazione di metalli pesanti (93). L analisi dei metalli pesanti in matrici agroalimentari generalmente viene effettuata con metodi spettroscopici di assorbimento/emissione o fluorescenza atomica o con cromatografia ionica che, sebbene garantiscano un elevata sensibilità e specificità, non sono proponibili come metodi rapidi di screening in quanto costosi e richiedono lunghi tempi di analisi e personale qualificato (94). Lo sviluppo di metodi rapidi, semplici, sensibili ed affidabili per la determinazione analitica di tali contaminanti è pertanto di notevole interesse. Lo sviluppo di accessori per riflettanza totale attenuata (ATR) da utilizzare nei convenzionali spettrofotometri infrarossi operanti in trasformata di Fourier (FTIR) ha reso interessante da un punto di vista applicativo la trasduzione ottica di sensori chimici nell intervallo infrarosso (IR). Gli ioni metallici monoatomici, come per esempio il Ni 2+, non presentano bande d assorbimento nell intervallo IR (95, 96). Tuttavia la loro rilevazione mediante ATR-FTIR è possibile con un metodo innovativo basato sullo spostamento delle bande d assorbimento IR di gruppi ligandi in seguito alla transizione dalla forma libera a quella complessata (97, 98). La spettroscopia ATR-FTIR viene utilizzata in tal caso in modalità differenziale (99). Tale approccio permette da un lato di testare strati attivi ad alta affinità e selettività per i metalli pesanti, allo scopo di sviluppare sensori innovativi per matrici acquose, dall altro di rivelare direttamente in matrici complesse la presenza dei metalli coordinati a gruppi ligandi. Relativamente a questo aspetto, la tecnica è interessante in ambito agronomico non solo quale sistema di rivelazione, ma anche quale strumento d indagine per identificare i siti di accumulo preferenziali del metallo nelle varie componenti chimiche di prodotti alimentari freschi. Materiali ad alta affinità e selettività per gli ioni metallici possono essere selezionati per un utilizzo in microbilance piezoelettriche. Tali strumenti analitici, estremamente economici e di semplice utilizzo sfruttano la variazione della frequenza di oscillazione di lamine di quarzo piezoelettrico in seguito a variazioni di massa indotte dall assorbimento di analiti (100, 101). La funzionalizzazione dei cristalli di quarzo con opportuni materiali idrofobici ad alto potere chemisorbente nei confronti dello ione nichel appare una strategia estremamente promettente per lo sviluppo di sistemi di analisi semplici ed economici, utilizzabili dagli operatori del settore alimentare. La mozzarella è un formaggio fresco a pasta filata soggetto ad alterazioni microbiologiche, una delle quali è nota come mozzarella blu, ed è causata dal batterio Pseudomonas. Questo microrganismo può essere presente nel latte e/o nell acqua usata per il raffreddamento del prodotto (102). Contenere specie di Pseudomonas ad una densità cellulare inferiore a 10 6 ufc/g comporta una forte riduzione del rischio che si verifichi l alterazione mozzarella blu (103, 104). Tra gli approcci seguiti per controllare la moltiplicazione di Pseudomonas spp. e di altri microrganismi deterioranti nei formaggi freschi, è doveroso ricordare: i) l impiego di confezionamenti attivi inserendo nel liquido di governo estratti vegetali, o lisozima in 13

14 combinazione con EDTA ( ); ii) l uso di alginato, in combinazione con antimicrobici e/o confezionamento in atmosfera modificata (109, 110); e iii) l impiego di chitosano, in combinazione con lisozima, all interno del film di confezionamento dell alimento (111). Estendendo la visione su derivati lattiero-caseari freschi diversi dalla mozzarella, è da rilevare che l impiego di Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, ad una densità cellulare finale nell ordine di 10 8 ufc/g, durante la produzione di formaggio Cottage ha permesso di ritardare notevolmente la crescita di Pseudomonas fluorescens (112). Infine, è stato sperimentato l uso combinato di una batteriocina e di glicina per ampliare il raggio di azione della batteriocina nei confronti di P. fluorescens in crema pasticcera (113). La vigente normativa comunitaria (il cosiddetto "pacchetto igiene") prevede azioni di sorveglianza ufficiale dirette al controllo della qualità e salubrità anche delle specie di molluschi (Reg. CE No 852, , 882/2004). Gli studi sullo stato igienico delle acque e la ricerca di microrganismi nei molluschi, anche ai fini dei processi e tempi di depurazione, è focalizzata sulla ricerca di tossine algali, coliformi, Escherichia coli, indicatori di patogeni fecali, Salmonella spp. e metalli. Giardia, Cryptosporidium e Toxoplasma, considerati dall'oms come agenti patogeni emergenti, sono protozoi veicolati principalmente da cibo e/o acqua contaminati da materiale fecale e in grado di causare infezione nell uomo anche con scarse dosi infettanti. Casi di criptosporidiosi e giardiosi nell uomo sono riportati in diverse regioni europee, Italia compresa, responsabili nell uomo di patologie gastro-enteriche (principalmente diarrea) anche molto gravi; le infezioni causate da questi protozoi si rilevano particolarmente in bambini e pazienti immunocompromessi (114). I casi di toxoplasmosi più pericolosi si sviluppano principalmente nelle donne gravide, nei soggetti immunocompetenti o immunocompromessi (115). Questi protozoi di interesse zoonosico, vengono riversati, attraverso reflui zootecnici e urbani o dalle acque di dilavamento, nei fiumi, i quali, confluendo verso le acque costiere possono contaminare il mare. Per la loro natura di filtratori, isolati di questi protozoi sono stati, infatti, identificati in numerosi molluschi (ostriche, cozze, vongole, ecc.), in diverse aree del mondo ( ), Italia compresa ( ). Il problema della contaminazione dei molluschi da agenti patogeni emergenti non è stato mai affrontato sia per la mancanza di conoscenza della problematica e del rischio sanitario correlato (i servizi sanitari, gli esercenti di impianti di allevamento di molluschi e gli stessi consumatori non sono ancora consapevoli del problema e della sua entità e, di conseguenza, i molluschi, sulla base della normativa vigente, non vengono routinariamente sottoposti a monitoraggio per questi agenti patogeni), sia per assenza di metodologie innovative e rapide per ricercare i protozoi. Per la ricerca di tali patogeni emergenti ci sì è finora avvalsi di tecniche classiche, quali colture in vitro, immunofluorescenza diretta e indiretta e microscopia con colorazione, metodiche che oltre a mostrare una sensibilità e specificità limitata (93%) richiedono tempi lunghi di esecuzione e personale addestrato. Le metodologie molecolari sono caratterizzate da una elevata sensibilità e specificità (fino al 100%), ma la loro applicazione è limitata attualmente alla ricerca scientifica e non trova alcuna applicazione nel campo della diagnostica di routine. Il mancato impiego di tecniche molecolari nelle pratiche diagnostiche quotidiane limita notevolmente il monitoraggio dei molluschi destinati all alimentazione umana, sia perché questi protozoi idrodiffusi non sono ricercati sia perché, anche se lo fossero ma con tecniche classiche, i risultati falsi negativi rappresentano un ostacolo importante per la salubrità di questi alimenti. La Piattaforma Tecnologica Europea Food for Life ha inserito, insieme ad altri microrganismi contemplati nelle normative, anche i protozoi di interesse zoonosico oggetto del presente progetto, sottolineando la necessità non solo di rilevare i parassiti ma di sviluppare strumenti di rilevazione affidabili per la salvaguardia della salute umana. Tali diagnosi potrebbero essere significativamente migliorate sia nella velocità sia nella capacità di evidenziare il patogeno mediante l utilizzo di biosensori basati su nanomateriali e nanotecnologie sviluppati per una rapida diagnosi del DNA del patogeno. L impiego delle nanotecnologie, oltre a fornire i vantaggi intrinseci delle tecniche molecolari, consente anche al personale non specializzato di applicare in campo e su larga scala, metodiche diagnostiche molecolari, amplificando i vantaggi per il raggiungimento di un più elevato standard di sicurezza alimentare. Le aziende di produzione di prodotti carnei necessitano della conoscenza in tempo reale di eventuali contaminazioni da microrganismi patogeni. Listeria monocytogenes e Salmonella enterica, due specie che crescono a temperature basse, rappresentano un serio rischio nei prodotti carnei da banco (122, 123). La contaminazione da Salmonella e Listeria nelle aziende di lavorazione delle carni è tuttora un problema in Europa occidentale (124, 125). I regolamenti per la sicurezza alimentare riguardo a L. monocytogenes in questa tipologia di prodotti prevedono l assenza del patogeno in 25 g di alimento (126, 127). L identificazione di L. monocytogenes avviene mediante metodiche lunghe di coltura microbiologica, per la presenza di altre specie come L. innocua. Le analisi HACCP e l analisi Qualitative Proficiency Test Data dei laboratori di microbiologia degli alimenti producono un 10% di falsi negativi per il basso numero di patogeni 14

15 (128, 129). Le metodiche PCR (130, 131) combinate alla lisi della matrice alimentare con immunoseparazione dei patogeni permettono l eliminazione della matrice e degli inibitori di PCR (sangue, emoglobina e composti fenolici), e la possibilità di quantificare i batteri bersaglio in presenza di una microflora preponderante ( ). Questi metodi sono in grado di rilevare fino a 7-10 cfu/g di patogeni (133, 137). Terreni di arricchimento come l UPB (universal pre-enrichment broth) fortemente tamponato per prevenire l abbassamento di ph (138) ed il SEL broth (selective enrichment broth) (139) sono usati per far crescere cellule stressate di E. coli, Salmonella spp. e L. monocytogenes (140). Metodi innovativi alternativi alla PCR sono i DNA microarrays e metodiche basate su immunosensori. I primi consistono in vetrini contenenti sonde legate al supporto, usati per ibridare con prodotti di PCR marcati in fluorescenza, per l identificazione a livello di specie del DNA presente nel campione (141, 142). DNA microarray commerciali sono stati applicati per l identificazione di Salmonella (143). Protein chips basati su anticorpi sono stati usati per individuare antigeni batterici ( ). Tra i biosensori con metodo diretto c è l SPR ( ) che mostra un elevata sensibilità nella rivelazione di E. coli (153), Salmonella (154, 155) e L. monocytogenes (156). Tra i metodi indiretti di rilevamento si utilizza la lettura con un laser scanner di un secondo anticorpo fluorescente (157). 3) DESCRIZIONE DELL'OBIETTIVO FINALE Per sicurezza alimentare si intende l insieme delle azioni finalizzate a conoscere, limitare e monitorare i fattori di rischio alimentare, derivanti dalla presenza di elementi nocivi alla salute nei prodotti destinati al consumo alimentare umano ed animale. Il progetto S.I.Mi.S.A. si vuole inserire nell ampio scenario della problematica della sicurezza alimentare con un insieme strutturato di interventi di ricerca avanzata, guidata da qualificati attori internazionali, intervenendo in un contesto in cui le problematiche di contaminazione sempre più ricorrenti richiedono sforzi maggiori e comuni per innalzare in generale le soglie di sicurezza dei prodotti alimentari, con un raggio di azione che opera nelle fasi di produzione primaria e di trasformazione di alcuni prodotti pugliesi economicamente rilevanti. L obiettivo finale del progetto è dunque quello di intervenire sui principali processi di prevenzione, controllo e correzione al fine di garantire elevati standard di sicurezza degli alimenti contribuendo alla realizzazione di un sistema di sicurezza lungo tutta la filiera, in linea con l orientamento comunitario. Oggetto della ricerca saranno alcuni tra i key foods pugliesi selezionati in base al rischio di contaminazione anche da differenti classi di contaminanti, alla loro valenza economica e territoriale e considerando il livello di interesse scientifico in termini di applicazione di tecnologie innovative: - uva e vino, - cereali (in particolare frumento) e prodotti derivati, - mozzarella, - prodotti ortofrutticoli, - molluschi bivalvi, - carni bovine. Il progetto si articola in 7 Obiettivi Realizzativi (OR) di ricerca e sviluppo, definiti in funzione dei processi di Prevenzione, Controllo e Correzione applicati ai prodotti sopra elencati. Ogni OR è suddiviso in Obiettivi Specifici (OS) per la messa a punto di strumenti innovativi di controllo/prevenzione/correzione in risposta a specifiche problematiche di sicurezza correlate ai singoli prodotti. Inoltre è previsto un OR di scale-up industriale per l applicazione nelle Aziende partner del progetto di alcuni degli strumenti e metodi sviluppati nell ambito degli altri OR. Di seguito vengono descritte in dettaglio: caratteristiche e prestazioni da realizzare, specifiche quantitative da conseguire e principali problematiche di ricerca e sviluppo di ogni singolo OS nell ambito dei vari OR. 15

16 OR 1 STRUMENTI PREVENTIVI INNOVATIVI PER LA RIDUZIONE DEL RISCHIO DI MICRORGANISMI ALTERANTI IN VINO OS1.1: Messa a punto un protocollo biotecnologico per minimizzare lo sviluppo di lieviti del genere Brettanomyces e per ridurre la presenza di etilfenoli nel vino Caratteristiche e prestazioni da realizzare L Obiettivo Specifico 1.1 prevede l acquisizione di nuove conoscenze su Brettanomyces bruxellensis allo scopo di mettere a punto un processo biotecnologico di produzione innovativo in grado di prevenire lo sviluppo nei vini pugliesi di tale lievito, responsabile della produzione di metaboliti indesiderati causa di sgradevoli percezioni sensoriali. Questo lievito contaminante infatti, esplica attività metaboliche capaci di ridurre sensibilmente la qualità del prodotto finito, causando gravi danni economici alle imprese vitivinicole. L obiettivo specifico sarà perseguito attraverso l applicazione di un approccio ecosistemico al sistema mosto-vino e alle problematiche di qualità e sicurezza alimentare ad esso connesse. Durante il processo di vinificazione si realizzano le condizioni sviluppo sequenziale di specifici microrganismi, in particolare di Saccharomyces cerevisiae e di Oenococcus oeni, rispettivamente principali responsabili della fermentazione alcolica e della fermentazione malolattica. Nelle diverse fasi, ed in ragione dell ecologia microbica, si creano le condizioni anche per lo sviluppo di lieviti e batteri indesiderati, tra cui B. bruxellensis. Gli organismi causa di degradazione di vini competono quindi con i lieviti e i batteri enologici per i substrati presenti nel sistema mosto-vino. Lo sviluppo di B. bruxellensis è caratteristico delle fasi di fine fermentazione alcolica/inizio fermentazione malolattica, ragion per cui i rischi sono connessi alle fasi di invecchiamento e imbottigliamento. L obiettivo sarà perseguito attraverso lo studio e la ricerca delle condizioni di gestione delle risorse microbiche enologiche, ovvero alla definizione di un protocollo biotecnologico, in grado di permettere alle colture starter impiegate di competere efficacemente con B. bruxellensis, specie nelle fase di latenza esistente tra la fine della fermentazione alcolica e l inizio della malolattica. È, inoltre, importante considerare che un migliore controllo microbiologico del processo è passibile di sfavorire la formazione di precursori degli etilderivati. Infatti, mentre B. bruxellensis è protagonista della riduzione dei vinil-derivati ad etil-derivati, ceppi di lieviti e batteri lattici naturalmente presenti nel consorzio microbico enologico sono responsabili della conversione degli acidi cinnamici in vinil-derivati. Le attività di ricerca industriale proposte compendiano lo studio di diversi biotipi di lieviti e batteri enologici (ceppi commerciali e ceppi autoctoni, rispettivamente disponibili in commercio e di proprietà delle unità di ricerca coinvolte nel progetto), di diverse formulazioni dello starter (come singolo o multi ceppo), e di diverse tempistiche di inoculo (inoculo sequenziale o coinoculo). Accanto allo studio di misure preventive, si ritiene opportuno anche prevedere un azione correttiva, quale l impiego di pareti cellulari di lieviti per la riduzione degli etilfenoli in vino, che sarà anch essa oggetto di analisi critica. Specifiche quantitative da conseguire L attività di ricerca vuole essere una risposta fattiva alle istanze provenienti dal mondo produttivo, in termini di sviluppo di tecnologie innovative per affrontare e gestire il rischio di contaminazione di Brettanomyces bruxellensis nel corso della produzione vinicola. Da un punto di vista quantitativo, relativamente all obiettivo nel suo complesso, la ricerca ambisce a definire un protocollo biotecnologico che, dettagliando e standardizzando le materie prime da impiegare e le procedure da mettere in atto, permetta di ridurre le perdite annue causate da B. bruxellensis al di sotto dell 1% della produzione. Nelle prime fasi dell attività di ricerca i parametri operativi coincideranno con la capacità di rivelazione del microrganismo spoilage e dei relativi metaboliti secondari responsabili del difetto organolettico, parametri che saranno, poi, continuamente monitorati nel corso dello studio. Metodiche pubblicate di PCR quantitativa in tempo reale per rilevare ed enumerare B. bruxellensis direttamente in vino sono in grado di rilevare fino ad una cellula di microrganismo per ml di vino. Metodiche pubblicate basate sulla cromatografia liquida ad alta prestazione riportano limite di rilevabilità di 4,0 μg/l nella rivelazione di etil-fenoli. Per le finalità progettuali, tali limiti saranno assunti come specifiche quantitative da conseguire, in quanto rappresentano ottime soglie di detection operative. Per ciò che concerne gli etil-fenoli, in particolare, il limite riportato è più di cento volte inferiore alla soglia di percezione olfattiva di tale molecola in vino. Sempre nelle prime fasi si provvederà a campionare mosti, mosti in fermentazione e vini per la ricerca di ceppi autoctoni di B. bruxellensis, per i quali sarà effettuato il sequenziamento di un gene target per la tassonomia dei lieviti. Il corrispondente obiettivo intermedio sarà la realizzazione di una collezione microbica, ed il parametro il numero di ceppi. Il valore di tale parametro 16

17 rifletterà il grado di biodiversità di B. bruxellensis nei vini analizzati. Il progetto prevede di stimare qualitativamente nelle vinificazioni la biodiversità all interno della specie B. bruxellensis mediante una metodica molecolare economica e sensibile per la detection di mutazioni e polimorfismi in sequenze target di DNA. L influenza delle condizioni stressanti tipiche del vino sulla vitalità di B. bruxellensis e sulla relativa produzione di etil-derivati sarà realizzata monitorando, in qualità di parametri operativi, le caratteristiche chimico-fisiche delle vinificazioni (ph, temperatura, concentrazione di etanolo, concentrazione zuccherina) e i dati analitici relativi alla rivelazione del microrganismo e delle molecole spoilage da esso prodotte. Con analisi di genomica funzionale sarà studiato il complesso dei geni di B. bruxellensis trascritti in vino, per cui i parametri operativi saranno rappresentati dalla abbondanza dei trascritti. Per la restante parte di attività, in funzione della differente gestione delle risorse microbiche (natura delle colture starter enologiche e loro impiego) e dei coadiuvanti tecnologici (a base di pareti cellulari di lieviti), saranno monitorati i dati analitici relativi alla rivelazione del microrganismo, degli etil-derivati e dei relativi precursori. Principali problematiche di R&S L attività di ricerca proposta si basa sul concetto della prevenzione biologica del problema, senza trascurare la ricerca per soluzioni correttive. In questo quadro, una difficoltà cruciale è rappresentata dalla diversità microbica dei microrganismi starter (principalmente Saccharomyces cerevisiae ed Oenococcus oeni) e di Brettanomyces bruxellensis, in relazione alla variabilità dei parametri chimico-fisici di diverse vinificazioni. I riflessi delle differenze genotipiche sul fenotipo in ambiente enologico potrebbero inficiare i risultati ottenuti al variare delle caratteristiche chimico-fisiche delle produzioni, per questo l attività di ricerca prevede lo studio di soluzioni calibrate sulla tipologia dei processi di vinificazione di alcune aziende partner. Inoltre, è da tempo evidente che i ceppi commerciali di starter microbici per l enologia non sono la soluzione universale per la fermentazione dei mosti di uve. Esiste, infatti, la necessità di una continua selezione dei ceppi più adatti alle vinificazioni nei diversi territori e dalle diverse varietà di uve. Esistono studi che mostrano come i ceppi autoctoni di S. cerevisiae siano spesso più adatti a crescere in mosti di uve di qualsiasi ceppo commerciale. I ceppi di lieviti enologici si distinguono principalmente per la loro capacità di contribuire al bouquet del vino e per le loro prestazioni di fermentazione. Rispetto a tale possibile problematica, è bene evidenziare che le unità di ricerca coinvolte sono da anni attive nella ricerca, studio e caratterizzazione di ceppi enologici per la fermentazione alcolica e malolattica. Tra le criticità è da notare che, ove i ceppi starter ottimali per ridurre le perdite annue causate da B. bruxellensis dovessero essere ceppi autoctoni precedentemente selezionati e caratterizzati e non colture starter disponibili sul mercato, si porrebbe il problema di ottenere da essi biomassa sufficiente per gli impieghi industriali. OR 2 STRUMENTI DI CONTROLLO INNOVATIVI PER LA DETERMINAZIONE DI CONTAMINANTI IN UVA E VINO OS2.1: Messa a punto di metodiche di controllo per la selezione delle uve per la vinificazione e per la determinazione di Ocratossina A in uva e vino Caratteristiche e prestazioni da realizzare L Obiettivo Specifico 2.1 prevede la messa a punto di nuovi sistemi per: a) il controllo della contaminazione da OTA delle uve in fase di vendemmia e b) il controllo dei livelli di glucosio e alcool nelle uve destinate alla vinificazione e nel vino. Per il raggiungimento dell obiettivo specifico si prevede di: - sviluppare una metodica analitica per la determinazione dell OTA basata su una nuova tecnica di estrazione, purificazione e preconcentrazione della tossina, chiamata Micro Extraction by Packed Sorbent (MEPS), accoppiata ad un sistema classico di cromatografia liquida con rivelazione a fluorescenza. - sviluppare un metodo rapido ed economico per il monitoraggio simultaneo di glucosio ed etanolo in uva e vino basato su un nuovo biosensore amperometrico doppio. La selezione delle uve in fase di vendemmia, infatti, può limitare in misura significativa i livelli di OTA nel vino. Far sì che un azienda possa procedere autonomamente alla determinazione di questo contaminante tossico, utilizzando un protocollo di analisi messo a punto nei propri laboratori, implementerebbe le potenzialità di intervento in tempo reale sulle fasi critiche della filiera e porterebbe ad un duplice vantaggio: - produttivo (velocizzazione dei controlli e quindi della trasformazione della materia prima), - economico (risparmio nei costi di analisi affidate a terzi). 17

18 La tecnica MEPS non è mai stata utilizzata per analisi di OTA. La MEPS si basa sugli stessi principi della Solid Phase Extraction (SPE), ma risulta essere notevolmente più vantaggiosa perché utilizza volumi molto più piccoli di campione (fino a 10 µl), può essere completamente automatizzato (le fasi di prelievo, estrazione ed iniezione possono essere eseguite on-line, usando la stessa siringa) e consente la riduzione significativa dei volumi di solvente e campioni necessari all analisi. L operatore dell azienda non dovrà far altro che aspirare tramite una siringa, contenente la fase adsorbente, il campione reale liquido opportunamente diluito ed effettuare la successiva iniezione nello strumento analitico, dopo aver aspirato una quantità sufficiente di fase mobile e/o di solvente di eluizione. La metodica basata sul biosensore doppio garantirà il controllo accurato, rapido ed a basso costo di glucosio e alcool nelle materie prime e nel prodotto, con un incremento notevole del numero di campioni giornalieri analizzabili da un azienda ed un abbattimento dei costi, rispetto a quelli necessari con le metodiche analitiche correnti. Il biosensore amperometrico doppio, integrato in un sistema di analisi in flusso dotato di un rivelatore elettrochimico e di un campionatore a fibra da microdialisi, sarà in grado di rilevare in maniera continua o discontinua i livelli di glucosio ed alcool presenti nella matrice reale analizzata. La tecnologia di sviluppo del biosensore lo rende altamente selettivo, per cui l operatore dovrà semplicemente iniettare nel sistema in flusso il campione reale senza particolari accorgimenti o pretrattamenti. Gli analiti presenti nella matrice reale saranno rilevati dal biosensore, che darà come output una corrente proporzionale, dopo opportuna calibrazione, alla loro concentrazione. Il dispositivo sarà in grado di operare in condizioni reali per almeno una settimana. Specifiche quantitative da conseguire Nel caso del metodo per l OTA basato su MEPS le principali specifiche quantitative da conseguire sono la riproducibilità espressa come RSD%, che dovrà essere minore del 23% (valore di riferimento sulla base del Regolamento CE 401/2006 e dell equazione di Thompson), ed il recupero percentuale, che dovrà essere nell intervallo %, per concentrazioni di analita comprese tra 1 e 10 µg/kg e % per concentrazioni inferiori a 1 µg/kg. Le principali specifiche che verranno prese in considerazione durante la fase di messa a punto del metodo di analisi con biosensore sono la riproducibilità di fabbricazione, che dovrà essere maggiore dell 80%, e, come indicato dalle normative sulla validazione (Decisione CE 657/2002, Regolamento CE 882/2004), l accuratezza (ovvero i valori di recupero) nelle determinazioni dei campioni reali, dovrà essere nell intervallo % e la riproducibilità di misura (RSD%) inferiore al 6%. Principali problematiche di R&S Nella determinazione dell OTA con la tecnica di estrazione/separazione MEPS, la fase critica è rappresentata dal recupero dell analita, che deve soddisfare standard normativi rigorosi. I risultati che si ottengono in questa fase sono dipendenti da una serie di parametri che devono essere attentamente valutati ed ottimizzati per il raggiungimento degli obiettivi del progetto. Essi comprendono: la tipologia di sorbente utilizzato, le condizioni estrattive e di eluizione e la tempistica relativa, il solvente utilizzato nella fase di eluizione, i volumi di campione e di solvente di eluizione, i parametri chimico fisici dei campioni reali (ph, forza ionica, presenza di altri analiti e/o inteferenti, ecc.). L influenza di questi parametri, non ancora studiata per l OTA, verrà attentamente valutata per la messa a punto del metodo, con particolare riguardo alle percentuali di recupero nelle fasi critiche di estrazione campione/meps e MEPS/solvente di eluizione. Ad esempio, a causa delle proprietà acide dell OTA potrebbe verificarsi una dipendenza della costante di partizione campione/meps dal ph della soluzione di partenza. In tal caso, sarà necessario provvedere ad una standardizzazione del ph nei campioni di partenza mediante aggiunte bilanciate di soluzioni tampone. Un altro aspetto rilevante, a cui verrà data particolare attenzione, è la validazione dei metodi di analisi proposti secondo i cogenti standard di qualità imposti dalla Comunità Europea. Per quanto concerne la realizzazione del biosensore, di fondamentale importanza saranno parametri quali selettività, riproducibilità di realizzazione, tempi ed intervallo lineare di risposta. Al fine di ottenere i risultati migliori verranno variati alcuni parametri di realizzazione del biosensore doppio, quali carico enzimatico, caratteristiche delle membrana intrappolante l enzima e film permselettivo. Il biosensore sarà sottoposto a verifica misurando la sensibilità iniziale, la linearità di risposta, la selettività in matrici reali, il limite di rivelabilità ed il tempo di risposta. Tutti i parametri operativi saranno ottimizzati in base alle esigenze specifiche richieste dalla verifica delle caratteristiche di funzionalità. Il biosensore sarà integrato in un sistema di analisi in flusso dotato di un campionatore a fibra da microdialisi, pertanto saranno ottimizzate le condizioni idrodinamiche al fine di ottenere un rapido e semplice campionamento delle matrici reali. 18

19 OS2.2: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni nel vino Caratteristiche e prestazioni da realizzare Lo scopo dell Obiettivo Specifico 2.2 è quello di sviluppare metodi multi-analita basati sulla spettrometria di massa e metodi rapidi basati sull uso di anticorpi per la determinazione di allergeni alimentari, quali proteine di uovo e di latte, in vini chiarificati. Per lo sviluppo di un metodo multi-analita verranno utilizzate tecnologie avanzate basate sulla rivelazione spettrometrica di massa ad alta risoluzione per l analisi simultanea di più allergeni, quali proteine di uovo e latte, che rappresentano agenti comunemente utilizzati nelle pratiche di chiarificazione dei vini. Il metodo multi-analita LC-MS che si intende sviluppare mira ad individuare e a rivelare con elevata accuratezza i principali peptidi marker di caseine e di ovalbumina (previa digestione enzimatica) nei vini sottoposti a chiarifica. A tal fine sarà esplorato un ampio intervallo di concentrazioni e valutata la quantità di proteina eventualmente precipitata. Parallelamente si provvederà a sviluppare metodi rapidi e facilmente trasferibili che utilizzano un riconoscimento anticorpale e basate su tecnologie innovative quali polarizzazione di fluorescenza (FP) e/o test immunocromatografici (LFD o dipstick) e/o risonanza plasmonica superficiale (SPR) per la rivelazione degli stessi allergeni in campioni di vino chiarificati. I metodi rapidi che si intendono mettere a punto mirano a soddisfare le seguenti caratteristiche: capacità di analizzare un singolo allergene all'interno della matrice vino in un ampio intervallo di concentrazioni, tempo di analisi relativamente breve, elevata affidabilità e, infine, capacità di fornire risultati accurati e ripetibili. I metodi sviluppati saranno impiegati per un monitoraggio costante lungo tutta la filiera viti-vinicola in grado di rilevare in tempo reale la presenza dei principali allergeni potenzialmente contaminanti i vini chiarificati. Specifiche quantitative da conseguire Per quanto riguarda la metodica multi-analita per allergeni mediante LC-MS, ci si propone di identificare almeno due peptidi per ciascun allergene alimentare con un accuratezza di massa 10 ppm e limite di rivelabilità 10 µg/ml. Nello sviluppo di immunosaggi FP e/o SPR e/o LFD le principali specifiche quantitative da conseguire saranno limiti di rivelabilità 5 µg/ml e tempi di analisi 30 min. Principali problematiche di R&S I principali limiti offerti dai saggi ELISA ad oggi sviluppati per la determinazione di proteine allergeniche quali proteine di latte e di uovo residue in vini chiarificati risiede nella possibilità che interferenti di matrice possano alterare il risultato dell analisi ELISA con il rischio di falsi positivi/negativi. Inoltre è stata riportata la difficoltà di sviluppare immunosaggi ELISA per la rivelazione di proteine allergeniche usate a scopo di chiarificazione in vini rossi a causa dell assorbimento dei pigmenti in essi contenuti nella stessa regione UV- VIS del colorante usato per la rivelazione. Altresì con lo sviluppo di nuovi biosensori basati su tecnologia SPR e/o FP e/o LFD ad oggi poco o non ancora esplorati a questo scopo, si mirerà a superare gli ostacoli attualmente presentati dai saggi ELISA. Tali metodi, una volta sviluppati, consentirebbero di monitorare l eventuale presenza di caseinati residui in vini chiarificati e sarebbero di facile e rapida implementazione lungo tutta la filiera viti-vinicola. I metodi rapidi inoltre necessitano in generale di essere corroborati con un metodo accurato e affidabile ad oggi non ancora disponibile in letteratura. Al fine di ottemperare all attuale legislazione si richiede lo sviluppo di metodi affidabili per l inequivocabile identificazione di proteine allergeniche in vini chiarificati. Fra gli obiettivi previsti ci si propone anche di sviluppare una metodica basata su HPLC e rivelazione in spettrometria di massa per la conferma inequivocabile di residui di proteine allergeniche in campioni di vino. Sebbene quest approccio sia già stato utilizzato per alcune matrici alimentari l applicazione alla matrice vino risulta ad oggi poco indagata. A tal riguardo alcuni risultati preliminari sono stati ottenuti nei laboratori ISPA-CNR con riferimento alle proteine del latte in vini bianchi. Lo sviluppo di una simile metodica estesa alla rivelazione simultanea di allergeni di uovo e di latte, previa individuazione di marker specifici, rappresenterebbe un utile strumento per la definitiva conferma di residui di proteine allergeniche in vini chiarificati. Ciò contribuirebbe a fornire chiare indicazioni, come richiesto anche dall Agenzia Europea sulla Sicurezza Alimentare (EFSA), circa la possibile pericolosità dell uso di tali proteine a scopo di chiarificazione nei confronti dei soggetti allergici. 19

20 Le principali problematiche di ricerca e sviluppo che si potrebbero incontrare durante lo svolgimento delle attività previste nell OS 2.2 riguardano la disponibilità in commercio di anticorpi con elevata specificità e sensibilità nei confronti degli allergeni di interesse. Qualora tali anticorpi non fossero idonei, sarà necessario reperire nuovi anticorpi attraverso le numerose collaborazioni che l ISPA-CNR ha con altri Enti di Ricerca in ambito nazionale e internazionale. Un altro punto critico, comune a tutte le attività nell ambito dell OS 2.2, potrebbe riguardare il reperimento di campioni di vino chiarificati ottenuti applicando le procedure standard di cantina, e da impiegare per la fase di validazione finale delle metodiche sviluppate. Inoltre sarebbe opportuno reperire vini ottenuti da uve provenienti da diversi vitigni al fine di valutare l eventuale effetto matrice. Nell eventualità di sviluppare metodi rapidi basati su saggi immunocromatografici per la determinazione di allergeni in campioni di vino si renderà auspicabile la collaborazione con aziende in grado di fornire strip da modificare da dedicare allo sviluppo dell immunosaggio. La messa a punto di tali strip potrebbe avere ricadute industriali. OS2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento Caratteristiche e prestazioni da realizzare Lo scopo dell Obiettivo Specifico 2.3 è lo svulippo e la validazione metodi di indagine multiresiduale di fitofarmaci, che si caratterizzeranno per l elevato numero di analiti (circa 500) determinabili in una sola analisi, con elevata sensibilità e specificità. Tali metodiche si baseranno sull utilizzo di tecnologie avanzate di gas cromatografia e cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem (GC-MS/MS) o spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) basata su tecnologia Orbitrap al fine di orientare l analisi di routine dei campioni verso la modalità untargeted. Le metodiche sviluppate verranno validate in uva e/o vino. A supporto di tali metodiche verranno sviluppati opportuni materiali di riferimento, attualmente non disponibili sul mercato, in matrice vino contenenti diversi fitofarmaci a concentrazioni certificate. Nelle fasi di sviluppo e validazione verranno utilizzate inoltre le miscele standard di fitofarmaci preparate nell OS 5.1. Specifiche quantitative da conseguire Nello sviluppo e validazione delle metodiche multiresiduali si farà riferimento alle linee guida indicate nel documento DG SANCO n /2009 (Method validation and quality control procedures for pesticide analysis in food and feed), che definisce i criteri di accettabilità per metodiche quantitative e di screening per l analisi di pesticidi in matrici alimentari. Le metodiche sviluppate dovranno inoltre possedere requisiti di sensibilità tali da consentire la rivelazione dei fitofarmaci sottoposti a regolamentazione in Europa per uva e vino a livelli di contaminazione uguali o minori ai relativi limiti massimi ammissibili. A seguito degli studi di inclusione di fitofarmaci in matrice si prevede di sviluppare almeno un materiale di riferimento per la matrice vino contenente almeno 10 fitofarmaci. Il materiale dovrà risultare omogeneo e stabile per almeno 12 mesi in condizioni ottimizzate. Nel monitoraggio della stabilità delle soluzioni saranno valutati anche i materiali e la forma dei contenitori di conservazioni oltre che le condizioni di conservazione. Principali problematiche di R&S Sviluppo delle metodiche. Il principale problema da affrontare nell attività di ricerca proposta risiede nella diversità delle proprietà chimico-fisiche delle molecole che si intendono determinare. In ragione di tali diversità, in tutte le fasi dello sviluppo del metodo vanno operate scelte di compromesso allo scopo di ottenere requisiti indispensabili quali: - co-estrazione quantitativa di tutti gli analiti dalle matrici di interesse; - limiti di rivelabilità e di quantificazione sufficienti per la rivelazione di tutti gli analiti ai limiti massimi ammissibili imposti dalla legislazione; - rivelazione mediante un approccio che fornisca informazioni specifiche per ogni analita; - conformità alle linee guida per l analisi di pesticidi stabilite nel documento DG Sanco n /2009; - sviluppo del metodo e della procedura di stoccaggio, ottimizzazione delle condizioni di conservazione e scelta dei materiali di contatto idonei al fine di poter determinare l effettiva stabilità; - validazione in house di metodiche multi-analita GC-MS/MS e LC-HRMS. 20

21 Preparazione di materiali di riferimento. Nell ambito dello studio di fattibilità di un materiale di riferimento in matrice vino" le principali problematiche da affrontare saranno quelle correlate all inclusione degli analiti target in matrice ovvero: - valutazione di stabilità ed interazioni tra medium e soluzione di analiti; - valutazione della omogeneità; - interferenza dei componenti della matrice nella risposta strumentale dei fitofarmaci inclusi; - determinazione di livelli di contaminazione mediante metodiche analitiche validate e/o ufficiali. OR 3 STRUMENTI CORRETTIVI INNOVATIVI PER LA RIMOZIONE DI METABOLITI MICROBICI INDESIDERATI NEL VINO OS3.1: Messa a punto di un prototipo per la rimozione dell ocratossina A (OTA) nel vino mediante la tecnica del ripasso continuo su vinacce/buccette Caratteristiche e prestazioni da realizzare L Obiettivo Specifico 3.1 si prefigge di costruire un prototipo di impianto per la rimozione dell OTA dal mosto/vino. Il prototipo utilizzerà la tecnica del ripasso in continuo del mosto/vino su vinacce/buccette incontaminate. Il prototipo sarà progettato e sviluppato con l obiettivo di rimuovere completamente l OTA dal mosto/vino e di ridurre al minimo il tempo di ripasso del mosto/vino sulle vinacce/buccette. Attualmente non esistono impianti/sistemi adibiti alla rimozione dell OTA da mosti/vini. Il prototipo che ci si prefigge di sviluppare è innovativo e sfrutterà la naturale capacità delle vinacce, o di alcuni loro componenti, di adsorbire l OTA. L impianto prototipo farà uso di vinacce incontaminate su cui si ripasserà il mosto/vino contaminato da OTA mediante un processo in continuo di mescolamento finalizzato al passaggio liquido-solido dell OTA dal mosto/vino alle vinacce. Il flusso del mosto/vino attraverso le vinacce sarà regolato tramite pompa al fine di ottimizzare i tempi di contatto solido-liquido in relazione al tenore di OTA da rimuovere. Il progetto prevede di sviluppare e ottimizzare le condizioni di conservazione delle vinacce/buccette al fine di stabilizzarle per un periodo di tempo che va dall inizio a fine vendemmia. Il progetto mira a conservare/esaltare gli standard qualitativi dei mosti/vini ripassati su vinacce/buccette. Saranno definite le condizioni per aumentare la naturale capacità delle vinacce di adsorbire l OTA dal mosto/vino. Specifiche quantitative da conseguire Ridurre di almeno il 90% l OTA nei mosti/vini ripassati su vinacce/buccette incontaminate con tempi di ripasso inferiori a 5 ore. Conservare o esaltare i parametri qualitativi e sensoriali dei mosti/vini ripassati. L eventuale riduzione di questi parametri nei mosti/vini ripassati non deve essere statisticamente differente (p = 0,05) dai controlli. Principali problematiche di R&S Le principali criticità che dovranno essere affrontate e superate per la rimozione dell OTA con la tecnica del ripasso breve sono rappresentate da: i) rimozione selettiva dell OTA, in percentuali > 90% e in tempi brevi; mantenimento dei parametri qualitativi dei mosti/vini durante il ripasso; ii) individuazione di partite di vinacce esenti da contaminazione da OTA; iii) individuazione delle condizioni ottimali per la stabilizzazione delle vinacce o suoi componenti per un periodo di almeno 30 gg; iv) progettazione e costruzione dei serbatoi idonei per la stabilizzazione delle vinacce; v) progettazione e costruzione dell impianto prototipo idoneo a rimuovere percentuali di tossina > 90% con un processo in continuo. Per aumentare la naturale capacità delle vinacce di adsorbire l OTA si prevede di separare le diverse componenti delle vinacce e di saggiarne in vitro l attitudine ad adsorbire l OTA. La possibilità di poter stabilizzare le vinacce/buccette per un periodo di almeno 30 gg permetterà di eliminare le criticità connesse con il reperimento e la conservazione di vinacce/buccette fresche non stabilizzate per un periodo che copra i tempi della vendemmia. La risoluzione del problema OTA nei vini pugliesi è fondamentale per preservarne la sicurezza e la qualità, nonchè migliorare la competitività nazionale e internazionale delle aziende vitivinicole pugliesi. 21

22 OS3.2: Sviluppo di metodologie bio-molecolari per la decontaminazione/degradazione dell ocratossina A (OTA) nei mosti/vini Caratteristiche e prestazioni da realizzare L attività progettuale intende ottenere approfondite informazioni molecolari utili per l identificazione di microrganismi autoctoni e di enzimi di origine microbica coinvolti nel processo di detossificazione/ degradazione di OTA, per la successiva implementazione di un efficace sistema di decontaminazione della tossina in mosti/vini. Il vantaggio di questo tipo di analisi risiede nell elevata sensibilità e capacità di indagare il complesso trascrittoma associato ad una specifica funzione, consentendo di visualizzare/rilevare geni codificanti per proteine con determinate attività enzimatiche, altrimenti non rilevabili con approcci metodologici classici. L analisi trascrittomica del microbioma presente sia sulle bacche che nel mosto/vino, effettuata utilizzando oligonucleotidi specifici per classi di geni (quali peptidasi, lipasi, carbossipeptidasi, proteasi acide) con documentata capacità di degradazione dell OTA potrà portare all isolamento di tale gene. Infatti verranno prodotte delle librerie geniche specifiche per una delle suddette classi di geni che sarà oggetto dell attività di sequenziamento massivo. I dati ottenuti saranno oggetto dell analisi bioinformatica, che consentirà d identificare e, quindi, permettere l isolamento ed il successivo clonaggio in opportuni vettori plasmidici del gene/i codificante/i enzimi con documentata capacità degradativa dell OTA. Almeno un gene per ciascuna delle classi identificate, isolato e inserito in opportuno vettore plasmidico, verrà espresso in uno o più sistemi biologici eterologhi (Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Lactobacillus spp.). Gli enzimi ricombinanti prodotti saranno caratterizzati biochimicamente e ne verrà valutata l effettiva capacità di degradazione enzimatica dell OTA in vino. Inoltre, l implementazione biotecnologica prevederà anche di isolare direttamente dal microbiota associato alla nicchia ecologica uva/vino microrganismi naturali in grado di degradare l OTA durante i processi fermentativi e di valutarne l utilizzo nella vinificazione. Geni codificanti proteasi acide (di origine vegetale o microbica), selezionati sulla base del loro ph ottimale (3-4) e sulla capacità di idrolizzare il legame peptidico R-phe, verranno prodotti e ne verrà valutata l effettiva capacità di degradazione dell OTA in vino. L applicazione di tali sistemi biotecnologici potrà apportare notevoli vantaggi economici e pratici, rispetto ai sistemi tradizionali di rimozione delle tossine (quali il trattamento con carbone attivo) ad oggi disponibili, grazie al loro minimo impatto sulle qualità chimico-organolettiche della produzione vinaria. Specifiche quantitative da conseguire Nel corso della sperimentazione descritta, effettuata mediante tecnologie estremamente innovative, si intendono ottenere approfondite informazioni molecolari utili per l identificazione e caratterizzazione di enzimi coinvolti nel processo di detossificazione/degradazione di OTA e all individuazione/isolamento dei microrganismi potenzialmente responsabili di tale attività. Le specifiche che si conseguiranno attraverso tale progetto sono le seguenti: - identificazione mediante analisi metatrascrittomica e caratterizzazione bioinformatica di geni microbici codificanti enzimi con potenziale attività detossificante per l OTA; - espressione ricombinante del gene/i selezionato/i dall attività bioinformatica in sistemi eterologhi (S. cerevisiae, Escherichia coli, Lactobacillus spp.); - isolamento mirato di almeno un microrganismo naturale in grado di biodegradare l OTA e sua possibile applicazione tecnologica durante il processo di vinificazione. Tali specifiche potranno a medio termine consentire l ottenimento di strumenti biotecnologici in grado di detossificare vini contaminati senza alterare le proprietà chimiche ed organolettiche di questi ultimi, soprattutto in quelle annate favorevoli allo sviluppo sui grappoli di A. carbonarius, il principale agente di accumulo di OTA nella filiera viti-vinicola. Principali problematiche di R&S Sono allo studio, negli ultimi anni, sistemi biotecnologici dedicati alla riduzione dell OTA presente nel vino, che possono offrire prospettive di applicazione nel settore vinicolo quali l uso di microrganismi (batteri, funghi e lieviti) o enzimi da essi derivati (peptidasi). La criticità di questo approccio biotecnologico si ritrova nella difficoltà dei suddetti sistemi biotecnologici di ottenere la degradazione della tossina in presenza delle concentrazioni di etanolo e valore di acidità tipiche dei vini. L attività di ricerca proposta intende ottenere approfondite informazioni molecolari mediante approccio metatrascrittomico, le quali saranno utilizzate per l identificazione di microrganismi e di enzimi di origine microbica ed eventualmente vegetale, in grado di degradare l OTA in ambiente acido ed in presenza di 22

23 etanolo. Un ulteriore problematica collegata alla ricerca proposta consisterà nella produzione su scala pilota dell organismo/proteina identificato da utilizzarsi per la successiva implementazione di un efficace sistema di decontaminazione della tossina direttamente in vino. In riferimento a queste tematiche, è opportuno mettere in evidenza che l ISPA-CNR è da anni attivo sia nello studio di metodologie innovative per la detossificazione di alimenti e bevande e sia nella messa a punto di sistemi per la produzione di proteine ricombinanti. OR 4 STRUMENTI PREVENTIVI E CORRETTIVI INNOVATIVI PER LA RIDUZIONE DEL RISCHIO DI CONTAMINAZIONE DA MICRORGANISMI INDESIDERATI, MICOTOSSINE ED INSETTI IN FRUMENTO OS4.1: Messa a punto di metodiche per il trattamento di cariossidi di frumento con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata al fine di prevenire la contaminazione da microrganismi indesiderati e l'infestazione da insetti Caratteristiche e prestazioni da realizzare L Obiettivo Specifico 4.1 si propone la messa a punto di una soluzione tecnologica a basso impatto per l uomo e per l ambiente al fine di prevenire/ridurre l infestazione da insetti e la contaminazione da microrganismi indesiderati (Bacillus spp. e funghi tossigeni) e micotossine lungo la filiera del frumento. Tale obiettivo verrà raggiunto mediante la progettazione e realizzazione di un prototipo di generatore di ozono (O 3 ) in forma gassosa o di acqua ozonizzata da utilizzare a livello industriale. Saranno quindi ottimizzati i parametri sperimentali (tempo di contatto, livello di umidità del prodotto, livello di umidità dell aria, concentrazione di ozono, temperatura di trattamento) per un efficace riduzione di insetti/bacillus/funghi tossigeni/micotossine in frumento e farine senza alterare la qualità degli stessi. Il prototipo inoltre intende sfruttare nuove tecnologie di generazione dell ozono (come quella a plasmi freddi) che consentono consumi energetici molto ridotti e la realizzazione di impianti di dimensioni ridotte. Il prototipo sarà dotato di sensori di rilevazione di ozono per indicare eventuali superamenti delle soglie previste dalle normative vigenti del gas in aria in modo da garantire la sicurezza degli operatori e di sistemi di rilevazione di ozono in acqua ed in aria per misurare le concentrazioni ottimizzate per i tempi di contatto stabiliti. Specifiche quantitative da conseguire La tecnologia a base di ozono che si intende sviluppare per prevenire/ridurre lo sviluppo di insetti, microrganismi indesiderati e loro metaboliti tossici consentirà di assicurare una mortalità degli insetti, batteri alterativi e funghi micotossigeni dell ordine del 80-90%. La percentuale di abbattimento delle micotossine (in particolare il deossinivalenolo e l ocratossina A) in cariossidi di frumento che si intende raggiungere è del 60-70%. Il prototipo in grado di generare ozono gassoso e acqua ozonizzata che si intende sviluppare sarà in grado di produrre circa 30 g/h di ozono e sarà dotato di un sistema di gestione dello stesso, di un sensore per la misurazione dell ozono disciolto in acqua e di un sensore per la misurazione di ozono in aria. Il prototipo inoltre sarà dotato di un sistema di sicurezza che rileverà la concentrazione di ozono nell ambiente in modo da garantire la sicurezza degli operatori. Principali problematiche di R&S Un problema prioritario per l intera filiera cerealicola è rappresentato dalla ricorrente contaminazione da insetti, microrganismi indesiderati (in particolare funghi tossigeni e Bacillus spp.) e micotossine (in particolare tricoteceni e ocratossina A). L uso di ozono per il controllo di questi infestanti/contaminanti nelle granaglie potrebbe essere una soluzione a basso impatto ambientale. I principali problemi che potrebbero interferire con le attività previste nell ambito di questo OS possono derivare dalla indisponibilità di campioni di frumento naturalmente contaminati da micotossine a livelli tali da apprezzare l effetto dei trattamenti. Questo punto sarà superato utilizzando cariossidi di frumento provenienti da prove di inoculo in campo con funghi produttori di micotossine, al fine di avere campioni contaminati in campo da micotossine a vari livelli. 23

24 OR 5 STRUMENTI DI CONTROLLO INNOVATIVI PER LA DETERMINAZIONE DI CONTAMINANTI IN CEREALI E DERIVATI OS5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento Caratteristiche e prestazioni da realizzare L Obiettivo Specifico 5.1 ha come finalità lo sviluppo e la validazione di metodiche analitiche di indagine multi residuale di fitofarmaci in cereali e prodotti derivati, che si caratterizzino per l elevato numero di analiti (oltre 500) determinabili in una sola analisi, con elevata sensibilità e specificità. Tali metodiche si baseranno sull utilizzo di tecnologie avanzate di gas cromatografia e cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione basata su tecnologia Orbitrap (GC-MS/MS e LC-HRMS). Le attività verranno svolte in parallelo con quelle previste nell OS 2.3, e avranno anche in questo caso l obiettivo finale di orientare l analisi di routine dei campioni verso la modalità untargeted e supportarla con la realizzazione di materiali di riferimento in miscela al fine di garantire la qualità del dato analitico prodotto. Specifiche quantitative da conseguire Nello sviluppo e validazione delle metodiche multi residuali si farà riferimento alle linee guida indicate nel Documento DG SANCO N /2009, che definisce i criteri di accettabilità per metodiche quantitative e di screening per l analisi di pesticidi in matrici alimentari. Le metodiche sviluppate dovranno inoltre possedere requisiti di sensibilità tali da consentire la rivelazione dei fitofarmaci sottoposti a regolamentazione in Europa, in cereali e prodotti derivati, a livelli di contaminazione uguali o minori dei relativi limiti massimi ammissibili. Le nuove miscele standard di riferimento dovranno contenere almeno 500 principi attivi a titolo noto, ad incertezza definita e certificata, secondo le procedure ISO EN 9001, ISO EN ed ISO EN Principali problematiche di R&S Il principale problema da affrontare nell attività di ricerca proposta risiede nella diversità delle proprietà chimico-fisiche delle molecole che si intendono determinare. In ragione di tali diversità, in tutte le fasi dello sviluppo del metodo vanno operate scelte di compromesso allo scopo di ottenere requisiti indispensabili quali: - co-estrazione quantitativa di tutti gli analiti dalle matrici di interesse; - limiti di rivelabilità e di quantificazione sufficienti per la rivelazione di tutti gli analiti ai limiti massimi ammissibili imposti dalla legislazione; - conformità alle linee guida per l analisi di pesticidi stabilite nel documento DG Sanco N /2009. Per affrontare tali problematiche si prevede di saggiare e confrontare diversi solventi estraenti e modalità di estrazione allo scopo di identificare una miscela di solventi in grado di dare recuperi accettabili per la maggior parte dei 500 fitofarmaci considerati. Per soddisfare quanto richiesto dalle linee guida ufficiali per l identificazione e l analisi di residui di fitofarmaci si prevede di testare diversi approcci analitici basati su spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e in alta risoluzione (LC-HRMS). Inoltre, le principali problematiche da affrontare nella preparazione dei materiali di riferimento per fitofarmaci in miscela riguarderanno essenzialmente l approvvigionamento delle materie prime di purezza soddisfacente (fitofarmaci) da produttori accreditati ed eventuali problemi connessi con l allestimento delle miscele e della loro conservazion. Questi aspetti verranno valutati e gestiti sulla base dei risultati derivanti dagli studi di stabilità in soluzione, degradazione termica e foto-disattivazione, su superfici (vials silanizzati e non). OS5.2: Messa a punto di una metodica multi-micotossina in cereali e derivati e produzione di materiali di riferimento Caratteristiche e prestazioni da realizzare Nell ambito dell Obiettivo Specifico 5.2 ci si propone di sviluppare metodiche analitiche robuste e affidabili per la determinazione simultanea delle principali micotossine sottoposte a regolamentazione in Europa (aflatossine, ocratossina A, fumonisine, tricoteceni e zearalenone) e di micotossine per le quali si ricontra un crescente interesse da parte della comunità scientifica e/o degli organi legislatori (acetil derivati del DON, 24

25 glucosil derivati, fumonisine nascoste). Tali metodiche si baseranno sull utilizzo di tecnologie avanzate di cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) o spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) e verranno validate in matrici quali frumento e mais e prodotti derivati. Verranno inoltre valutati l utilizzo della sorgente ionica DART (Direct Analysis in Real Time) e l implementazione di un sistema per estrazione in fase solida on line che consentirà un incremento del numero di campioni analizzabili, ma soprattutto un miglioramento della sensibilità della metodica grazie alla possibilità di aumentare il fattore di concentrazione del campione nella fase di purificazione. A supporto di tali metodiche verranno sviluppati materiali di riferimento (farine di frumento e mais) contenenti differenti micotossine che attualmente non sono disponibili sul mercato, ma che risulteranno di notevole importanza vista la crescente diffusione di approcci multi-analita per la determinazione di micotossine in alimenti. Specifiche quantitative da conseguire La metodica multi-micotossina che si intende sviluppare dovrà possedere requisiti di sensibilità tali da consentire la determinazione delle micotossine sottoposte a regolamentazione in Europa in cereali e prodotti derivati a livelli di contaminazione uguali o minori ai relativi limiti massimi ammissibili. Durante la procedura di validazione in house si terrà conto anche dei criteri di accettabilità stabiliti dalla Commissione Europea (2006/401/EC) sia in termini di precisione e accuratezza, sia in termini di requisiti richiesti per la rivelazione mediante spettrometria di massa (2002/657/EC). I materiali di riferimento verranno pertanto preparati a livelli di contaminazione prossimi ai limiti massimi ammissibili per aflatossine, ocratossina A, fumonisine, tricoteceni e zearalenone in frumento e mais. I materiali dovranno essere caratterizzati mediante metodiche analitiche ufficiali o di riferimento e risultare omogenei e stabili in condizioni ottimizzate per un periodo superiore ai 6 mesi. Principali problematiche di R&S Il principale problema da affrontare nell attività di ricerca proposta risiede nella diversità delle proprietà chimico-fisiche delle molecole che si intendono determinare. Tali differenze devono essere attentamente gestite durante tutte le fasi dello sviluppo del metodo e in particolare: - ottenere la co-estrazione quantitativa di tutti gli analiti dalle matrici di interesse; - mettere a punto una strategia di purificazione degli estratti che garantisca elevati recuperi e una efficiente rimozione dei componenti della matrice; - effettuare la rivelazione mediante una tecnica universale ovvero non dipendente da proprietà specifiche molecole, come l assorbimento UV o l emissione in fluorescenza. Per rispondere a queste esigenze, nel corso di questa attività ci si propone di: - confrontare diverse miscele di estrazione; - saggiare e confrontare differenti tecniche di purificazione basate sull uso di colonnine ad immunoaffinità e colonnine per estrazione in fase solida. - mettere a punto e confrontare differenti metodiche di analisi basate su tecniche LC-MS/MS e LC- HRMS. La principale problematica da affrontare nella preparazione di materiali di riferimento multi-micotossina è la reperibilità di matrici (farine di frumento e mais, o frumento e mais non processati) naturalmente contaminate da diverse tossine e a livelli pari a o maggiori dei limiti massimi ammissibili. Per far fronte a questa esigenza, nel corso dell attività ci si propone di: - raccogliere e analizzare campioni di mais e frumento (e/o farine) al fine di individuare matrici naturalmente contaminate da almeno una famiglia di micotossine (tricoteceni/zearalenone, fumonisine, aflatossine, ocratossina A) a livelli prossimi o superiori ai limiti massimi ammissibili; - allestire colture fungine su frumento e mais allo scopo di produrre cereali altamente contaminati; - procedere alla preparazione di materiali multi-micotossina mediante miscelazione di materiali altamente contaminati con materiali naturalmente contaminati e/o non contaminati. 25

26 OS5.3: Messa a punto di una metodica analitica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati Caratteristiche e prestazioni da realizzare L obiettivo specifico si propone lo sviluppo di una metodica analitica per la determinazione simultanea di un numero elevato di contaminanti (circa 600 fitofarmaci e 10 micotossine) nella filiera del grano duro, semola e pasta basata su una unica fase estrattiva e tecnologie avanzate come GC-MS/MS e LC-MS/MS. In particolare verrà utilizzato un sistema LC-MS/MS (triplo quadrupolo) che, a differenza dei sistemi LC-MS (singolo quadrupolo) posseduti dalla gran parte dei laboratori, si basa sulla sinergia tra cromatografia liquida a pressione ultra-alta e la spettrometria di massa tandem a ionizzazione elettrospray. Tale sistema è in grado di rilevare e quantificare i principi attivi con un maggiore grado di selettività e sensibilità nelle diverse matrici. Inoltre, la strumentazione GC-MS/MS (triplo quadrupolo) dotata di un sistema fast resolution è in grado, invece, rispetto ai sistemi GC-MS (singolo quadrupolo) di ridurre di 1/3 i tempi di analisi e di identificare e quantificare con certezza assoluta più di 250 principi attivi in una singola corsa cromatografica. L utilizzo di questa strumentazione accoppiata a sistemi di estrazione rapidi ed affidabili, permetterà di velocizzare l intero percorso analitico garantendo nel contempo la qualità del dato analitico. Specifiche quantitative da conseguire I principali parametri operativi che verranno presi in considerazione durante la fase di messa a punto del metodo di analisi saranno: - limiti di quantificazione in campioni reali dovranno essere almeno pari a 1/5 del limite di legge per concentrazioni 100 µg/kg e ai 2/5 del limite di legge per concentrazioni < 100 µg/kg per le micotossine. Per i fitofarmaci il limite di quantificazione dovrà essere < 0,005 mg/kg; - valori di recupero dovranno essere compresi in tra il %. Potranno essere accettati per le micotossine anche recuperi compresi tra il 50 e il 70 % quando ripetibili e riproducibili; - dati di ripetibilità conformi alle indicazioni del Regolamento 401/2006/EC per le micotossine e al documento DG SANCO n /2009 per i fitofarmaci; - tempi di analisi brevi (24-36 ore) rispetto alle analisi convenzionali ottimizzando il servizio offerto ai produttori che intendono inserire nel mercato i propri prodotti; - elevata specificità: grazie all'utilizzo del triplo quadrupolo per ciascuna molecola si otterranno tre dati specifici quali tempo di ritenzione e ioni caratteristici (primario e secondario), che garantiranno una elevata specificità del metodo; - elevata selettività dovuta alla sicura identificazione dei principi attivi presenti nelle matrici con assenza di interferenze. Principali problematiche di R&S Fino ad oggi, dai lavori bibliografici presi in considerazione e dalle metodiche ufficiali di analisi, è emersa la mancanza di una metodica di analisi unica, con un unica procedura estrattiva standardizzata, capace di determinare un elevato numero di principi attivi di fitofarmaci e micotossine validata secondo quanto disposto dal Regolamento 401/2006/EC e dal Documento DG SANCO n /2009. Le attività nell ambito del presente OS mirano alla messa a punto di un nuovo metodo per la ricerca di fitofarmaci e micotossine presenti nei cereali e derivati. In particolare si vuole ricercare un protocollo analitico capace di determinare circa 600 molecole, attraverso un unica procedura estrattiva, e identificati tramite HPLC-MS-MS e GC-MS-MS. L'elevata selettività e sensibilità di queste tecniche permetterebbe di quantificare i principi attivi eliminando ogni tipo di interferenza e fornendone la conferma in un unica analisi. Le maggiori problematiche sono essenzialmente legate all elevato numero di molecole da determinare. Per ottenere le specifiche descritte sopra si opererà sia a livello della fase estrattiva, che dovrà garantire recuperi conformi alle specifiche per tutte le molecole con un unico procedimento, sia nell ottimizzazione delle condizioni analitiche strumentali. La separazione cromatografica in particolare dovrà essere accuratamente ottimizzata per garantire una corretta risoluzione e separazione delle molecole tale da permettere una successiva analisi in spettrometria di massa. 26

27 OS 5.4: Sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di micotossine in cereali e derivati Caratteristiche e prestazioni da realizzare L Obiettivo Specifico 5.4 riguarda la messa a punto e validazione di metodi di analisi rapidi e affidabili, prontamente trasferibili, per la determinazione del deossinivalenolo (DON), ocratossina A (OTA) e tossine T-2 e HT-2 nel frumento, farro e prodotti derivati (crusca, farine e pasta). Le metodologie avanzate che si intende utilizzare sono: polarizzazione di fluorescenza (FP), lateral flow (LF), spettroscopia nel vicino infrarosso a trasformata di Fourier (FT-NIR) e naso elettronico con tecnologia Metal Oxide Semiconductors (MOS). In particolare si intendeno sviluppare metodi basati sulla polarizzazione di fluorescenza per la determinazione di DON in farro, pasta di farro, crusca e farinaccio, di OTA in frumento, crusca, farinaccio e pasta, di T-2/HT-2 in crusca, farinaccio e pasta; metodi basati sull utilizzo di lateral flow devices per la determinazione di OTA in frumento, crusca, farinaccio e pasta; metodi basati su FT-NIR per la determinazione di DON in crusca e farinaccio e di OTA in frumento, crusca e farinaccio; metodi basati sull utilizzo di un naso elettronico con tecnologia MOS per la determinazione di DON in crusca e farinaccio e di OTA in frumento, crusca e farinaccio I metodi che si intendono sviluppare saranno in grado di soddisfare le seguenti caratteristiche analitiche: i) capacità di analizzare una singola micotossina all'interno di una matrice complessa in concentrazioni ampiamente variabili; ii) tempo di analisi relativamente breve; iii) elevata affidabilità; e infine iv) capacità di fornire risultati accurati e ripetibili. I metodi sviluppati saranno impiegati per un monitoraggio costante lungo tutta la filiera cerealicola, in grado di rilevare in tempo reale la presenza delle principali micotossine a concentrazioni critiche. Specifiche quantitative da conseguire L OS 5.4 si prefigge il conseguimento dei seguenti risultati: - un immunosaggio FP per la determinazione di una micotossina in almeno una matrice selezionata con le seguenti caratteristiche: valori di precisione e accuratezza in conformità ai criteri di accettabilità del Regolamento CE n. 401/2006/EC e tempo totale di analisi 30 minuti. - un saggio LF per la determinazione di OTA in almeno una matrice selezionata con le seguenti caratteristiche: numero di falsi positivi / negativi: 10%, livello di cut off: 80% del limite massimo ammissibile (Regolamento CE n. 1881/2006/EC) e tempo totale di analisi 30 minuti. - un metodo qualitativo o semi-quantitativo FT-NIR per una micotossina in almeno una matrice selezionata con le seguenti caratteristiche: per il metodo qualitativo, percentuale di corretta classificazione 80%; per il metodo semi-quantitativo, incertezza di misura 40%. Per entrambi i metodi il tempo totale di analisi sarà 10 min. - un metodo qualitativo, basato sul naso elettronico MOS, per una micotossina in almeno una matrice selezionata con le seguenti caratteristiche: percentuale di corretta classificazione 80% e tempo totale di analisi: 10 minuti. Principali problematiche di R&S La contaminazione da micotossine nelle derrate alimentari è un problema prioritario nella gestione della sicurezza igienico-sanitaria delle materie prime e dei prodotti di trasformazione che arrivano giornalmente sulla tavola dei consumatori. I metodi di analisi per la determinazione di micotossine negli alimenti comunemente utilizzati nei laboratori di controllo qualità si basano prevalentemente su tecniche analitiche di tipo cromatografico che, pur garantendo affidabilità in termini di precisione ed accuratezza dei risultati, richiedono tempi di analisi e costi non compatibili con le esigenze aziendali. Negli ultimi anni si è assistito ad un crescente interesse da parte delle aziende agroalimentari verso metodi di analisi rapidi, semplici, sensibili ed affidabili per la determinazione di micotossine al fine di monitorare la filiera di produzione in maniera capillare e con costi contenuti. I metodi rapidi attualmente disponibili sono applicabili solo ad alcuni cereali non processati e risentono spesso di interferenze dovute alla matrice che portano ad una sovrastima della micotossina (effetto matrice) falsando il risultato analitico. L Obiettivo Specifico 5.4 si propone di superare queste problematiche attraverso lo sviluppo di metodi rapidi basati su metodologie avanzate. Tali metodologie hanno caratteristiche intrinseche in termini di specificità e sensibilità che permetteranno di minimizzare le interferenze analitiche dovute alla composizione della matrice. Per tale ragione sarà possibile estendere l applicabilità di queste metodologie ai prodotti processati per i quali l effetto matrice è generalmente elevato. Tutto ciò consentirà alle aziende di effettuare un monitoraggio aziendale interno più 27

28 capillare sia delle materie prime che dei prodotti finiti destinati al consumatore migliorando in maniera significativa l efficienza del controllo di qualità lungo tutta la filiera agroalimentare. Le principali problematiche di ricerca e sviluppo che potrebbero insorgere durante lo svolgimento delle attività previste nell OS3.3 riguardano la disponibilità in commercio di anticorpi con elevata specificità e sensibilità nei confronti delle micotossine d interesse. Qualora tali anticorpi non mostrassero caratteristiche accettabili, sarà necessario reperire nuovi anticorpi attraverso le numerose collaborazioni che l ISPA-CNR ha con altri Enti di Ricerca in ambito nazionale e internazionale. Un altro punto critico, comune a tutte le attività nell ambito dell OS 5.4, potrebbe riguardare il reperimento di campioni di cereali e prodotti derivati naturalmente contaminati dalle micotossine in oggetto a livelli d interesse da utilizzare nella fase validazione delle metodiche sviluppate. Una possibile soluzione al problema sarà il reperimento, nell arco temporale del progetto, di campioni provenienti da altre fonti diverse dall azienda partner. OR 6 STRUMENTI INNOVATIVI PER LA PREVENZIONE DEL RISCHIO DI CONTAMINAZIONE DI PRODOTTI FRESCHI OS6.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per ridurre i rischi di alterazione da Pseudomonas spp. nelle mozzarelle Caratteristiche e prestazioni da realizzare L Obiettivo Specifico 6.1 consiste nel mettere a punto un protocollo biotecnologico innovativo basato sull impiego di antimicrobici naturali (batteri lattici anti-pseudomonas, plantaricina) per ridurre al minimo il rischio dell alterazione nota come mozzarella blu, lasciando inalterate le caratteristiche sensoriali della mozzarella. L immissione di questi antimicrobici naturali nel liquido di governo dovrebbe inibire la moltiplicazione del batterio responsabile dell alterazione della mozzarella. L inibizione del batterio alterante sarà rilevata mediante analisi microbiologiche ad hoc eseguite sull alimento, mentre la verifica del mantenimento delle caratteristiche sensoriali della mozzarella sarà effettuata mediante panel test. L effetto inibitorio e/o antagonistico che i batteri lattici possono esercitare nei confronti di microrganismi indesiderati può essere determinato sia dalla competizione esercitata direttamente in termini di accaparramento di spazio e sostanze nutritive, sia mediante la produzione di composti antimicrobici, quali peptidi, batteriocine, sostanze ad azione batteriocino-simile, acidi organici, perossido d idrogeno ed altri composti a basso peso molecolare. La produzione di composti antimicrobici può rappresentare per i batteri lattici un vantaggio ecologico nei confronti di altri microrganismi (anche quelli indesiderati) dello stesso ecosistema. Le batteriocine sono composti di natura peptidica o proteica sintetizzati per lo più dai batteri lattici, aventi uno spettro di azione limitato ai microrganismi filogeneticamente vicini al microrganismo produttore. Un tipico esempio di batteriocina comunemente aggiunta agli alimenti come antimicrobico è costituito dalla nisina (E234), sintetizzata da Lactococcus lactis. L impiego della plantaricina, una batteriocina prodotta da alcuni ceppi di Lactobacillus plantarum, o di altre batteriocine prodotte da batteri lattici (bacilli Gran-positivi) come antimicrobici nei confronti di batteri alteranti filogeneticamente distanti, quali le specie di Pseudomonas (batteri Gram-negativi) responsabili del fenomeno della mozzarella blu, potrebbe essere efficace solo se usata in combinazione con sostanze, quale l EDTA, in grado di creare uno scompenso a livello di parete cellulare. Sebbene la combinazione batteriocine-edta si sia rivelata efficace per alcuni alimenti, essa non è stata mai sperimentata nel settore lattiero-caseario con la finalità di inibire batteri Gramnegativi. Inoltre, indipendentemente dalla capacità di sintetizzare composti antimicrobici quali appunto le batteriocine, alcuni batteri possono essere impiegati come bio-conservanti. Sebbene vi siano alcuni esempi dell applicazione di bio-conservanti nel settore lattiero-caseario, non vi sono dati bibliografici che riguardano i formaggi freschi a pasta filata. Anche in tal senso il presente progetto risulta innovativo rispetto all esistente. La gamma di strategie preventive nei confronti delle alterazioni della mozzarella da specie di Pseudomonas sarà ampliata inglobando anche l applicazione di estratti vegetali ad azione antimicrobica e di lisozima in combinazione con EDTA. Alcune di tali strategie sono state oggetto, in tempi relativamente recenti, di pubblicazioni su riviste internazionali, ma non utilizzano la simulazione della contaminazione del liquido di governo con il batterio alterativo, prevista invece nel presente progetto. 28

29 Specifiche quantitative da conseguire Sulla base delle caratteristiche e prestazioni da realizzare per incrementare la competitività dell impresa produttrice di formaggi freschi a pasta filata, si ritiene debbano essere prioritariamente conseguite le seguenti specifiche quantitative: - Selezione di almeno un batterio lattico con attività inibitoria nei confronti di Pseudomonas. La quantificazione dell inibizione sarà determinata mediante misurazione del diametro di inibizione su piastra Petri e mediante determinazione della densità cellulare del batterio alterante in presenza del batterio lattico avente attività inibitoria. - Confronto tra le strategie proposte per controllare le alterazioni della mozzarella causate da Pseudomonas. In particolare i termini di confronto saranno: i) densità cellulare di Pseudomonas nella mozzarella in presenza di uno o più degli antimicrobici selezionati, inferiore a ufc/g o comunque significativamente inferiore ad una mozzarella-controllo, dopo 14 giorni di frigo-conservazione; ii) punteggio complessivo assegnato dal panel alla mozzarella in presenza di uno o più degli antimicrobici selezionati maggiore o uguale rispetto a quello assegnato ad una mozzarella-controllo. - Innovazione di processo consistente nella messa a punto e validazione, su scala di laboratorio, del protocollo biotecnologico innovativo dimostratosi più efficace nel controllare le alterazioni da specie di Pseudomonas. Il conseguimento di tali specifiche quantitative consentirà la risoluzione del problema delle colorazioni anomale di formaggi freschi a pasta filata. Tale problema, quando si verifica, ha una notevole ricaduta economica negativa per l impresa, la cui immagine ne risulta altresì compromessa. Principali problematiche di R&S La principale problematica di R&S da affrontare per il raggiungimento dell OS 6.1 consiste nella possibile comparsa di colorazioni anomale dei formaggi freschi a pasta filata durante la shelf-life di questi prodotti. Il batterio responsabile di tale alterazione è un batterio Gram-negativo, psicrotrofico e ubiquitario, appartenente al genere Pseudomonas. La capacità degli Pseudomonas di moltiplicarsi più velocemente di altri microrganismi anche a temperature di frigo-conservazione viene definita appunto psicrotroficità. Dunque il metodo di conservazione a basse temperature, comunemente applicato per alimenti deperibili quali i formaggi freschi, può non essere sufficiente a scongiurare la comparsa di questa alterazione, soprattutto nel caso in cui il prodotto venga consumato dopo alcuni giorni dalla data in cui è stato prodotto. Occorre considerare che quest ultima evenienza si verifica frequentemente, dal momento che prodotti come il fiordilatte sono venduti fuori regione, e prima di essere acquistati possono permanere negli scomparti refrigerati delle rivendite (soprattutto GDO) per diversi giorni, dato che possono avere una shelf-life che dura fino a 14 giorni. Data la natura ubiquitaria delle specie di Pseudomonas, le fonti di contaminazione del prodotto possono essere svariate: latte, aria del caseificio, operatori (nel caso di filatura o altre operazioni effettuate manualmente), liquido di governo, vasche di rassodamento del prodotto. Pertanto, se è praticamente impossibile prevenire la contaminazione del prodotto da parte di questo batterio alterante, dovrebbe per lo meno essere possibile tenere sotto controllo la densità cellulare dello stesso nel prodotto, evitando che essa raggiunga valori tali da causare la comparsa dell alterazione. In tale contesto la soluzione proposta col presente progetto consiste nel selezionare uno o più preparati antimicrobici (anche in forma di colture batteriche bio-conservanti o protettive ) che mostrino la capacità di inibire la moltiplicazione nei confronti del batterio alterante dapprima in vitro e la mantengano anche in un sistema reale. Il progetto prevede di effettuare un confronto tra le varie strategie possibili di prevenzione delle alterazioni da Pseudomonas e di mettere a punto un protocollo di applicazione della strategia risultata più efficace. Inoltre, sarà messo a punto un protocollo di analisi del prodotto, basato sulla Real Time PCR, che potrà essere utilizzato al fine di prevedere il verificarsi delle alterazioni in base alla quantificazione del batterio alterante nell alimento determinata nel giorno di produzione. OS6.2 - Impiego di compost e strategie agronomiche innovative per ridurre il contenuto di metalli pesanti nelle produzioni orticole da consumo fresco Caratteristiche e prestazioni da realizzare Obiettivo Specifico 6.2 consiste nella messa a punto di strategie agronomiche innovative (screening varietale, innesto erbaceo, gestione del ph della soluzione nutritiva) finalizzate a ridurre l assorbimento di metalli pesanti a seguito di utilizzo di compost in orticoltura per la produzione di ortaggi da destinare al consumo fresco, nel rispetto dei requisiti imposti dalla sicurezza alimentare. 29

30 Caratteristiche e prestazioni da realizzare in tale processo sono: 1) individuazione di compost utilizzabili nel settore orticolo attraverso test di fitotossicità e analisi delle proprietà chimico-fisiche con particolare riferimento al contenuto di metalli pesanti; 2) screening varietale in sistemi di coltivazione senza suolo di cultivar di pomodoro e lattuga al fine di individuare cultivar a ridotto accumulo di metalli pesanti negli organi eduli (frutti o foglie); 3) confronto tra coltivazione senza suolo e su terreno, e analisi della trasferibilità dei risultati dal sistema di coltivazione senza suolo al sistema pianta - terreno; 4) valutazione di tecniche innovative (innesto erbaceo su pomodoro e gestione del ph della soluzione nutritiva su lattuga) al fine di ridurre l accumulo di metalli pesanti nelle cultivar che hanno mostrato il maggior accumulo nello screening varietale. Specifiche quantitative da conseguire Le specifiche quantitative che si intendono conseguire sono: 1) presenza di piombo e cadmio in misura pari o inferiore al limite imposto dal Regolamento 1881/2006 per lattuga e pomodoro; presenza di nichel, cromo, cobalto, zinco, rame e manganese in misura pari o inferiore al controllo rappresentato dalle piante coltivate su un substrato di riferimento (senza compost); 2) mantenimento della qualità nutrizionale di pomodoro da mensa (solidi solubili totali, acidità titolabile, sostanza secca, contenuto di sodio, potassio, magnesio e calcio) e lattuga (nitrati e sostanza secca) rispetto al prodotto ottenuto in assenza di compost (fertilizzazione minerale), in due diversi sistemi di coltivazione (terreno e senza suolo); 3) individuazione di almeno un portinnesto adatto alle coltivazioni in ambiente protetto in grado di ridurre l accumulo di metalli pesanti nel pomodoro; 4) individuazione del ph ottimale della soluzione nutritiva al fine di ridurre l accumulo di metalli pesanti in foglie di lattuga allevate senza suolo. Principali problematiche di R&S Il compostaggio consente di soddisfare l esigenza di reintrodurre nel ciclo produttivo materiali che altrimenti sarebbero destinati ad essere smaltiti in discarica. Alcune matrici utilizzate per produrre compost possono contenere metalli pesanti che, oltre ad essere responsabili di inquinamento del terreno, pongono un problema di sicurezza alimentare se traslocati e accumulati nei diversi organi eduli delle piante orticole. L impiego di sistemi colturali confinati in ambiente protetto (sistemi di coltivazione senza suolo e impiego di mesocosmi per le prove su terreno ammendato con compost) e l adozione di tecniche colturali innovative (innesto erbaceo e gestione del ph della soluzione nutritiva) consentiranno di verificare in maniera accurata potenzialità, limiti e mezzi correttivi della tecnica del reimpiego del compost in orticoltura. OR 7 STRUMENTI DI CONTROLLO INNOVATIVI PER LA DETERMINAZIONE DI METALLI PESANTI E MICRORGANISMI PATOGENI IN PRODOTTI FRESCHI OS7.1: Sistemi innovativi per l analisi rapida di metalli pesanti in prodotti freschi Caratteristiche e prestazioni da realizzare L obiettivo finale della proposta è la messa a punto di sistemi innovativi per una rapida rivelazione del Nichel ed altri metalli pesanti in prodotti freschi (pomodoro, lattuga). Mediante la spettroscopia ATR-FTIR si propone di sviluppare metodologie di facile applicazione per l analisi immediata, senza pretrattamento, degli alimenti e di sviluppare sensori chimici a trasduzione ottica o piezoelettrica. La spettroscopia ATR- FTIR sarà testata quale sistema innovativo di nichel-detection sia da un punto di vista qualitativo che quantitativo. Le diverse matrici alimentari presentano un pattern spettroscopico caratteristico dipendente dalla composizione chimica di base (carboidrati, proteine, lipidi), costituito da poche bande IR, intense e slargate, dovute alla sovrapposizione di numerosi segnali. Considerando l ordine di grandezza del contenuto in nichel ed altri metalli pesanti (piombo, cadmio, cobalto, cromo) delle diverse matrici alimentari ( ppm) è chiaro che i segnali dovuti ai gruppi ligandi chelati con tali metalli contribuiscono in minima parte allo spettro d assorbimento infrarosso del prodotto alimentare. Pertanto il progetto si propone di sviluppare strategie per consentire la rivelazione di tali segnali indicativi della presenza di nichel ed altri metalli pesanti in campioni che mostrino una contaminazione inferiore a 100 ppm, e possibilmente a 10 ppm. La semplicità 30

31 di applicazione e l economicità dei reagenti richiesti rende tali metodi innovativi rispetto a quelli già esistenti e idonei ad un utilizzo in azienda alimentare. La spettroscopia ATR-FTIR sarà applicata anche per lo studio di materiali idrofobici naturali (derivati di acidi grassi semplici e complessi) o di sintesi (derivati politiofenici e macrociclici) da utilizzare in sensori chimici per matrici acquose. In tal caso i materiali selezionati saranno depositati come film sottili sul cristallo ATR e, mediante celle a flusso, sarà studiata la loro abilità di legare i metalli pesanti generando segnali caratteristici. La possibilità di operare in situ consente di incrementare il rapporto segnale/rumore della tecnica. Pertanto, in tal caso, saranno perseguiti limiti di rivelabilità dell ordine dei 10 ppm. Lo studio della trasduzione ottica sarà seguito dall applicazione degli stessi materiali in sensori chimici a trasduzione piezoelettrica, per ottenere un sistema di analisi di metalli pesanti presenti nelle matrici alimentari ancora più semplice da utilizzare ed estremamente economico. Specifiche quantitative da conseguire Sarà valutata la sensibilità della tecnica ATR-FTIR per la rivelazione di metalli pesanti (nichel, cromo, piombo e cadmio) direttamente nei prodotti freschi (pomodoro, lattuga) e saranno ottimizzati i protocolli di analisi allo scopo di rivelare livelli di contaminazione inferiori a 100 ppm. Per quanto riguarda l applicazione della tecnica allo studio di strati attivi da utilizzare in sensori chimici, saranno perseguiti limiti di rivelabilità più bassi, inferiori a 10 ppm. In tal caso saranno monitorati altri parametri operativi fondamentali per migliorare le prestazioni del sensore, quali la selettività, la presenza di specie interferenti (risposta ad altri analiti presenti nelle matrici alimentari), la stabilità nel tempo dei materiali utilizzati, sia in termini strutturali che funzionali, la ripetibilità delle misure, la precisione e l accuratezza. La deposizione degli strati attivi, già testati mediante spettroscopia ATR-FTIR, su cristalli di quarzo per un utilizzo in sensori piezoelettrici rappresenta operativamente un passaggio relativamente semplice, in quanto le caratteristiche dei materiali saranno già state ampiamente consolidate. Chiaramente il differente sistema di trasduzione necessiterà di definire le nuove prestazioni del sensore soprattutto in termini di sensibilità (limite di rivelabilità). Principali problematiche di R&S Tutti gli attuali protocolli per la quantificazione di metalli pesanti in matrici alimentari prevedono diverse fasi, quali la mineralizzazione, estrazione o preconcentrazione, che rendono i tempi di analisi estremamente lunghi e richiedono grandi quantità di reagenti costosi, come acidi forti e chelanti ultrapuri. La possibilità di sviluppare metodi innovativi in grado di rivelare nel campione tal quale o dopo blando trattamento, la presenza di metalli contaminanti è pertanto estremamente importante per consentire uno screening rapido e su larga scala degli alimenti freschi o trasformati potenzialmente dannosi per i soggetti affetti da intolleranza ai metalli pesanti. Nel presente progetto di ricerca, la spettroscopia ATR-FTIR differenziale sarà testata quale sistema innovativo di detection di metalli pesanti (nichel, cobalto, piombo, cadmio e cromo) nei prodotti freschi (pomodoro, lattuga), sia da un punto di vista qualitativo che quantitativo. La possibilità di sviluppare metodi innovativi semplici e poco costosi, in grado di rivelare nell alimento, tal quale o dopo blando trattamento, la presenza di diversi metalli rappresenta una novità assoluta ed è pertanto estremamente importante per consentire uno screening rapido, in campo e su larga scala, di tali contaminanti nei prodotti alimentari freschi. OS7.2: Messa a punto di un prototipo per la diagnosi rapida di patogeni emergenti in molluschi bivalvi Caratteristiche e prestazioni da realizzare L Obiettivo Specifico 7.2 è di mettere a punto una piattaforma miniaturizzata basata su nanotecnologie, compatta, rapida, semplice e maneggevole, che permetta attraverso metodiche di real-time PCR il rilievo simultaneo di agenti patogeni emergenti protozoari zoonosici (Giardia, Cryptosporidium e Toxoplasma) nei molluschi bivalvi allevati per consumo alimentare. Ciò al fine di: - garantire nel prodotto commercializzato, non solo l assenza di agenti patogeni ben noti, ma anche di microrganismi emergenti, di origine fecale, non contemplati dalla normativa vigente, pericolosi per la salute umana, ma ad oggi sottovalutati; - disporre nella pratica analitica di tecnologie innovative, veloci, e di facile impiego; 31

32 - fornire garanzie aggiuntive al committente delle analisi, e di conseguenza al consumatore, ed essere attraente e competitiva, anche sul mercato internazionale; - offrire al mercato una tecnologia innovativa per la diagnostica rapida di patogeni. La piattaforma funzionerà come uno strumento per analisi in real-time PCR (reazione di polimerizzazione di una o più sequenze di DNA target all interno di un campione biologico) di sequenze di DNA dei patogeni di interesse in molluschi bivalvi. Saranno messe a punto le condizioni sperimentali ottimali per lo sviluppo di un protocollo di analisi quantitativa dei patogeni di interesse in un range dinamico elevato con una buona precisione. Specifiche quantitative da conseguire La piattaforma miniaturizzata, che sarà sviluppata attraverso i protocolli di Real-Time PCR messi a punto dai laboratori partner di ricerca, sarà allestita per essere il sistema più attendibile per la rivelazione e la quantificazione degli acidi nucleici dei patogeni in esame. In particolare, si tratterà di uno strumento dalle ridotte dimensioni (14 8 cm), di facile impiego e basso costo; esso consentirà di eseguire le analisi su un lab-on-chip in silicio, anch esso sviluppato ad hoc, caratterizzato da proprietà termiche funzionali allo sviluppo di Real-Time PCR in piattaforma miniaturizzata. Lo strumento implementerà la ciclatura termica, l illuminazione e la rivelazione ottica necessarie per condurre le reazioni di Real-Time PCR. Sarà dunque un sistema all-in-one indipendente, con tecnologie USB o Bluetooth di connessione per funzionamento e analisi dei dati in remoto. La piattaforma miniaturizzata eseguirà una real-time PCR multipla, grazie all inclusione nella miscela di reazione di due sonde legate a due differenti fluorofori. In questo modo, in ogni cameretta del lab-on-chip sarà possibile rilevare e quantificare contemporaneamente due diversi patogeni, o un patogeno e un controllo interno di reazione (come ad esempio un gene endogeno del mollusco), aumentando le informazioni ottenibili da ogni singola analisi e diminuendo quindi i costi totali. Principali problematiche di R&S Le principali problematiche tecnico-scientifiche da risolvere sono relative al monitoraggio in tempo reale dell'amplificazione del materiale genetico. Le soluzioni proposte consisteranno nell adattamento progressivo del volume di reazione, delle concentrazioni dei diversi reagenti e dei protocolli termici alla piattaforma miniaturizzata. Inoltre, si procederà alla scelta dei due fluorofori da utilizzare secondo criteri di efficienza, facilità di discriminazione, costi e reperibilità degli stessi. Le principali problematiche tecnologiche da risolvere riguarderanno la configurazione finale del lab-on-chip e la semplicità e facilità d uso dello strumento miniaturizzato dedicato. Le soluzioni consisteranno, per quanto riguarda il lab-on-chip, nella scelta definitiva del numero di camerette di reazione, col giusto compromesso tra quantità di informazioni ottenibili con una singola analisi e volume di reazione. Lo sviluppo dello strumento dovrà tendere alla massima affidabilità dei risultati ottenuti (a livello di sensibilità e specificità analitica, oltre che di affidabilità della quantificazione) e delle componenti meccaniche, elettroniche e ottiche. Le soluzioni tecnologiche adattate dovranno mirare alla maggiore semplicità d uso possibile. OS7.3: Sviluppo di sistemi di allerta rapidi della presenza di patogeni Gram positivi (Listeria) e negativi (Salmonella) in tagli bovini prima della destinazione d uso Caratteristiche e prestazioni da realizzare Il progetto prevede 2 obiettivi finali distinti: 1) la validazione di nuove metodiche molecolari per il rilevamento di contaminazioni da Listeria e Salmonella (basate su un protocollo con pre-arricchimento in coltura overnight e successiva analisi mediante un metodo molecolare multiplex a biosensori ad elevata sensibilità e specificità; 2) la verifica dell applicabilità in azienda della metodica che fornisca migliori performance, in sostituzione delle analisi microbiologiche classiche affidante a consulenti esterni. Per messa a punto di nuovi sistemi di identificazione di Salmonella enterica e Listeria monocytogenes basati su metodiche molecolari rapide e ad elevata sensibilità saranno svolte le seguenti attività: 1) studio bioinformatico per disegnare nuovi primers utili per il rilevamento di L. monocytogenes e S. enterica, capaci di riconoscere tutti i ceppi da individuare appartenenti alle due specie di patogeni; e messa a punto di un metodo di amplificazione PCR in Real-Time con primers multipli, in grado di rilevare, identificare e differenziare i due patogeni, ottimizzando l estrazione del DNA eliminando gli inibitori 32

33 enzimatici (sangue, emoglobina), testando metodi diversi di amplificazione del DNA (esponenziale o lineare) e di marcatura delle sonde per la detection specie-selettiva, o usando primers fluorescenti oppure primers padloc da circolarizzare con reazione rolling cyrcle amplification (RCA), forniti di tags LDR-ZIP per l utilizzo su una piattaforma OpenArray. 2) studio di un DNA microarray per il rilevamento e l identificazione dei patogeni su vetrino (chip), mettendo a punto nuovi metodi di rilevamento del segnale mediante lettura della fluorescenza o altra proprietà fisico-chimica (sprettroscopia Raman, quantum dots, gold nanoparticles). 3) studio di una metodica a Protein chips con anticorpi anti-salmonella ed anti-l. monocytogenes, e anticorpi contro specie batteriche vicine (E. coli, L. innocua, ecc..) valutando il limite di sensibilità del metodo, la sua convenienza per i requisiti di applicabilità (una sensibilità microbiologica quanto più vicina a 10 CFU/10 ml di pre-coltura). Il rilevamento di due specie patogene (Listeria e Salmonella) sulla superficie di mezzene da destinare alla produzione di prodotti carnei da banco, con metodi rapidi ed innovativi, sarà effettuato comparando un biosensore a protein chip ed un DNA microarrays con un metodo di amplificazione Real-Time PCR mediante studio di un campionamento e di alimenti contaminati, mediante analisi di miscele di cellule delle due specie patogene target sia in assenza che in presenza di una microflora di sottofondo (per esempio carne naturalmente contenente E. coli). La modalità di funzionamento per il conseguimento dell obiettivo finale prevede dunque due possibilità: un metodo molecolare basato sull identificazione mediante sonde molecolari del DNA batterico, la seconda prevede l identificazione mediante anticorpi specifici di antigeni di superficie sui batteri interi, evitando lo step di estrazione del DNA. Il sistema più sensibile sarà poi sottoposto a test di validazione all interno dell azienda su campionamenti fatti in tempo reale. La modalità d uso si basa su una marcatura in fluorescenza del rilevatore (la sonda o l anticorpo), ed una lettura mediante uno laser scanner del microchip sulla cui superficie è avvenuto il legame tra analita e la sonda fluorescente. Specifiche quantitative da conseguire Le specifiche da conseguire nelle attività di ricerca e sviluppo sono le seguenti: - nuovi primers utili per il rilevamento di Listeria monocytogenes e Salmonella enterica disegnati per analisi molecolari di Real-Time PCR in multiplex e per DNA microarrays, in grado di riconoscere tutti i ceppi appartenenti alle due specie patogene (innovazione di processo e di metodica), - nuovi metodi ottimizzati per l estrazione del DNA privo di inibitori enzimatici (sangue, emoglobina), - nuovi metodi di amplificazione e di marcatura del DNA (con amplificazione esponenziale o lineare) da sfruttare per la rivelazione specie-selettiva, usando o primers fluorescenti oppure primers padlock da circolarizzare con reazione rolling cyrcle amplification (RCA), forniti di tags LDR-ZIP per l utilizzo su una piattaforma OpenArray, e rilevamento del segnale mediante lettura della fluorescenza o altra proprietà (sprettroscopia Raman, gold nanoparticles) su DNA microarrays, - valutazione comparata di differenti substrati (selettivi e non) di brodo di pre-arricchimento per cellule (anche stressate) delle specie Listeria monocytogenes e Salmonella entrerica, - nuovi metodi molecolari basati su biosensori a protein chips (anticorpi anti-salmonella / anti- Listeria monocytogenes) con limite inferiore di sensibilità del metodo quanto più vicina a 10 CFU/ 25 gr di campione, - valutazione comparata dei biosensori (sistemi di identificazione in multiplex su RT-PCR, su DNA arrays e su protein chips, e lateral flow) e loro validazione in un sistema artificiale e in un sistema reale, mediante analisi di miscele di cellule delle due specie patogene target sia in assenza che in presenza di una microflora di sottofondo, - validazione del sistema molecolare per il rilevamento delle specie patogene con le migliori performance, migliori adattabilità d uso (anche ad un personale non specializzato) e con costi contenibili, - applicabilità della metodica di detection migliore per sensibilità ed uso del biosensore in azienda per la caratterizzazione batterica (identificazione a livello specie) in grado di aumentare le produzioni di carni da banco grazie alla riduzione dei tempi di analisi. Principali problematiche di R&S La realizzazione di un nuovo metodo molecolare per la sicurezza microbiologica ad alta sensibilità richiede realizzazioni tecnologiche che forniscano i seguenti vantaggi: 33

34 - sviluppare una metodica comparabile in sensibilità alla coltura in piastra, ma eseguibile in 24 ore, - ottenere una metodica di esecuzione facile, da affidare ad un tecnico in azienda, - superare punti critici della reazione di PCR quali la variabilità dei risultati da una estrazione all altra, la presenza di contaminanti ed inbitori della PCR (per eliminare i falsi negativi si metterà a punto un controllo interno, plasmide o altra sequenza, che co-amplifichi e sia distinguibile dal prodotto di PCR specifico), - superare i punti critici intrinseci della Real-Time PCR quali affidabilità delle sonde (falsi positivi), e della lettura del risultato (melting T) su cui si basa la rilevazione della presenza del patogeno. Le problematiche tecnologiche che verranno affrontate nel progetto comprendono: - problematiche inerenti ai materiali da utilizzare (superfici su cui avviene l interazione tra analiti (DNA o antigeni) e alle molecole rivelatrici (sonde o anticorpi fluorescenti), - problematiche chimiche e fisiche (miniaturizzazione delle reazioni in modo da accelerare le interazioni nel tempo, lavorando in piccoli volumi), - problematiche del rilevamento del segnale: la fluorescenza spesso produce un rumore di fondo elevato, per cui si deve sperimentare un metodo di marcatura mediante nanoparticelle che emettano un segnale forte e altamente coordinato (attualmente i quantum dots realizzati con ossidi di metalli sono incoerenti, solo una piccola parte emette fluorescenza contemporaneamente). Inoltre, pochi scanners sono i grado di quantificare e comparare i segnali di fluorescenza letti in diversi esperimenti, per una standardizzazione. Spesso il fotomoltiplicatore viene settato a valori arbitrari, a causa di una perdita di luminosità dei laser, e quindi occorre sempre uno standard interno; inoltre in ogni esperimento il rumore di fondo causa una variabilità della quantificazione (delta tra segnale dello spot e rumore di fondo). Occorre utilizzare camere CCD Evolve in grado di leggere i valori dei pixels in termini di elettroni misurati e di calcolare il flusso fotonico, ma queste non sono in grado di posizionarsi sullo spot del vetrino automaticamente. A questo fine, la sperimentazione RTD prevista rappresenta la prima attività RTD di nostra conoscenza che si prefigge di leggere il flusso fotonico su microchip. OR 8 SCALE UP INDUSTRIALE DEGLI STRUMENTI PREVENTIVI, DI CONTROLLO E CORRETTIVI MESSI A PUNTO NEL PROGETTO Questo Obiettivo Realizzativo ha l obiettivo finale di sperimentare e validare su scala industriale o semiindustriale nelle aziende impegnate nel progetto alcuni degli strumenti e metodi innovativi messi a punto, ed eventualmente già provati su scala pilota, nell ambito di diverse attività degli OR1 - OR7. In particolare, si prevede lo sviluppo di interventi di scale-up industriale di natura preventiva, di controllo e/o correttiva, a seconda dei prodotti, con gli OS 8.1, 8.2 e 8.3 elencati di seguito. Le caratteristiche e prestazioni da realizzare, le specifiche quantitative da conseguire e le principali problematiche di ricerca e sviluppo sono state descritte nei precedenti paragrafi (OR1 - OR7). OS8.1: Scale up degli strumenti preventivi messi a punto Vino, frumento e mozzarella sono i prodotti interessati a questo OS che si propone di: - sperimentare su scala industriale un protocollo biotecnologico che minimizzi lo sviluppo di lieviti di Brettamonmyces bruxellensis e che riduca la presenza di etilfenoli nel vino; - sperimentare su scala semi-industriale un prototipo per il trattamento delle cariossidi di frumento con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata al fine di prevenire/ridurre la contaminazione da microrganismi indesiderati e l infestazione da insetti; - sperimentare su scala industriale un protocollo biotecnologico che riduca i rischi di alterazione da Pseudomonas spp su latti di origine e storia tecnologica diversa per la produzione di mozzarelle. OS8.2: Scale up degli strumenti di controllo messi a punto Questo OS riguarda strumenti innovativi di controllo che interessa vino, frumento e carni. In particolare l OS si propone di: - applicare in condizioni operazionali la metodica basata sul biosensore doppio per la rivelazione di glucosio e alcool in uve e vini; - applicare in condizioni operazionali la nuova metodica analitica con MEPS validata per la determinazione di ocratossina A; 34

35 - validare l immunosaggio a polarizzazione di fluorescenza (FP) per la determinazione di micotossine in farro, frumento e prodotti derivati; - verificare l efficacia dei metodi innovativi a biosensori/biochips per il rilevamento di batteri patogeni (Listeria, Salmonella) nelle carni. OS8.3: Scale up degli strumenti correttivi messi a punto Questo OS si propone di: - validare in cantina i protocolli di stabilizzazione delle vinacce, di ripasso dei mosti/vini e di gestione complessiva del processo di detossificazione dell ocratossina A. 4) DURATA (IN MESI) E DATA DI INIZIO DEL PROGETTO: Data di inizio progetto: 01/11/2011. Durata progetto: 36 mesi. 5) LUOGHI DI SVOLGIMENTO DEL PROGETTO - Distretto Agro-alimentare Regionale scrl, via Torelli 4, FOGGIA - Istituto di Biomembrane e Bioenergetica, Consiglio Nazionale delle Ricerche (IBBE-CNR), via Amendola 165/A, BARI - Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari, Consiglio Nazionale delle Ricerche (ISPA-CNR): Sede di Bari, via Amendola 122/O, BARI Unità Territoriale Lecce, via Provinciale Lecce-Monteroni, LECCE - Università degli Studi di Bari Aldo Moro: Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex Dipartimento. di Biologia e Chimica Agro-forestale ed Ambientale DiBCA), via Amendola 165/A, BARI Dipartimento di Medicina Veterinaria (Ex Dipartimento di Sanità Pubblica e Zootecnia DISPeZ), strada Provinciale per Casamassima, Km. 3 Valenzano (BARI) - Università degli Studi di Foggia: Dipartimento di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex Dipartimento di Scienze degli Alimenti DiSA - Ex Dipartimento di Scienze Agro-ambientali, Chimica e Difesa Vegetale DiSACD - Ex Dipartimento di Scienze delle produzioni e dell innovazione dei sistemi agro-alimentari mediterranei PrIME), via Napoli 25, FOGGIA - Università del Salento, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali DiSTeBA (Ex Dipartimento di Ingegneria dell Innovazione DII), Complesso Ecotekne, via per Monteroni, LECCE - Agriplan s.r.l., via Amendola 166/165, BARI - Azienda Vinicola Cantele s.r.l., S.P. 365 (Salice Salentino Sandonaci) Km 1 Guagnano (LECCE) - Azienda Viti-vinicola Incoronata, via Borgo Incoronata Pod.775/A, Borgo Incoronata (FOGGIA) - Biotecgen s.r.l., Viale Rossini 3, (LECCE) - BonassisaLab s.r.l. viale degli Aviatori 75, FOGGIA - Cantine D Alfonso del Sordo s.r.l., SS 89 Km 5, c.da Sant Antonino San Severo (FOGGIA) - C.D.P. s.r.l., viale Regina Margherita 96/B, Altamura (BARI) - Centro Latte Stasi s.r.l., zona Artigianale Molfetta (BARI) - Ciullo Carni s.r.l., corso Mazzini 76, Taurisano (LECCE) - Coop. Lavorazione Prodotti Agricoli Terra Maiorum, Via Castel del Monte 184, Corato (BARI) - Industrie Fracchiolla s.r.l.,sp per Valenzano km 1,200, Adelfia (BARI), - Lab. Instruments s.r.l., S.S. 172 Putignano - Alberobello, Km Castellana Grotte (BARI) - Molini Tandoi Pellegrino S.p.A., via Sant Elia zona ind., Corato (BARI) 35

36 6) DESCRIZIONE DELLA COMPAGINE DEI PROPONENTI Istituto di Biomembrane e Bioenergetica, Consiglio Nazionale delle Ricerche (IBBE-CNR) L Istituto di Biomembrane e Bioenergetica di Bari del Consiglio Nazionale delle Ricerche (IBBE CNR) in oltre quarant anni anni di attività si è qualificato come uno dei principali laboratori di ricerca nel campo della Bioenergetica e Biomembrane a livello nazionale ed internazionale. Operano presso l IBBE ricercatori largamente noti a livello internazionale per le loro competenze e per gli importanti contributi originali nel campo scientifico della bioenergetica e delle biomembrane, comprensivi di aspetti ed approcci di biochimica, genetica molecolare e biofisica. Negli anni più recenti l attività di ricerca si è estesa nel campo biotecnologico e medico e in particolare nello studio della biodiversità molecolare conseguendo risultati di notevole interesse. In particolare, con riferimento all'attività progettuale proposta, l IBBE è coinvolto, in collaborazione con l ITB CNR (sede di Bari), nella messa a punto e nella realizzazione di librerie di DNA o cdna finalizzate al pirosequenziamento tramite la piattaforma ad alta processività 454 Genome Sequencer FLX Titanium Series (Roche) e nella realizzazione di algoritmi e software di analisi bioinformatica e banche dati specializzate. L obiettivo di tale analisi è essenzialmente la determinazione della composizione tassonomica e genetico/funzionale dei campioni in esame. Le competenze descritte trovano una congeniale applicazione nell analisi dei dati metagenomici che si prevede di produrre nel corso del progetto. L IBBE è dotato di laboratori e facilities, per una superficie complessiva di circa 800 m 2, per effettuare attività di ricerca nel campo della biochimica, della genomica funzionale, della biologia molecolare, della genetica molecolare di organismi eucarioti, della biodiversità molecolare e della bioinformatica. La strumentazione scientifica in dotazione comprende: spettrofotometri, spettrofluorimetri, citofluorimetro, microscopio a fluorescenza, microscopio confocale, HPLC, centrifughe e ultracentrifughe, Agitatori/Incubatori, Analizzatore di immagini, Typhoon, IPGphor, Isoelectric Focusing System, Ossigrafo Rank Brothers, Laboratorio per colture cellulari, Sequenziatore DNA Applied Biosystem ABI PRISM 310, Sistema per elettroforesi bidimensionale di proteine, Spettrometro di massa tandem quadrupolo tempo di volo. L IBBE collabora con diversi laboratori di altri Istituti del CNR e Dipartimenti universitari (Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Dipartimento di Biochimica Medica, Dipartimento Farmaco Biologico) per l utilizzo di altre apparecchiature avanzate quali la piattaforma di pirosequenziamento 454 FLX Titanium (Roche) che sarà utilizzata per lo svolgimento del presente progetto. L IBBE è anche impegnato in attività di formazione di livello universitario e post universitario. Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari, Consiglio Nazionale delle Ricerche (ISPA-CNR) L Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA) del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), con sede principale a Bari e Unità Territoriali a Lecce, Milano, Torino e Sassari, è una realtà di eccellenza, riconosciuta a livello internazionale, che opera nel settore della ricerca, innovazione e trasferimento tecnologico per il miglioramento della qualità e della sicurezza dei prodotti agroalimentari. L'ISPA-CNR, realizzando azioni sinergiche tra ricerca scientifica e realtà produttive, con il trasferimento delle acquisizioni scientifiche, supporta percorsi di innovazione tecnologica di piccole, medie e grandi imprese nazionali ed estere del settore agroalimentare. In relazione alla proposta progettuale e al settore/ambito di riferimento, le principali tematiche di ricerca svolte o in corso di svolgimento presso l ISPA-CNR sono: monitoraggio di micotossine, funghi tossigeni e microrganismi alterativi nella filiera vitivinicola e cerealicola; messa a punto di strategie di decontaminazione e detossificazione di alimenti, bevande e mangimi; sviluppo e validazione di metodi analitici innovativi per la determinazione di contaminanti (micotossine e microrganismi patogeni ed alterativi) in matrici agroalimentari. Con riferimento ai metodi analitici, l ISPA-CNR ha maturato un esperienza trentennale nello sviluppo e validazione di nuovi metodi di analisi chimico-strumentali e immunometrici e, più recentemente, di metodi basati su tecnologie innovative (polarizzazione di fluorescenza, aptameri, lateral flow devices, spettroscopia nell infrarosso, naso elettronico) per la determinazione di micotossine in varie matrici agroalimentari. E nota di merito lo sviluppo e validazione di tre metodi analitici rispettivamente per la determinazione di fumonisine nel mais e prodotti derivati, e negli alimenti per l infanzia contenenti mais e per l ocratossina A nel vino e nella birra. Tali metodi sono stati adottati come metodi ufficiali da organizzazioni internazionali quali l AOAC International, il Comitato Europeo di Normazione (CEN) e l Organizzazione Internazionale 36

37 della Vite e del Vino (OIV). L ISPA ha esperienza nell organizzazione di studi interlaboratorio secondo le linee guida AOAC Int. e CEN per la validazione dei metodi di analisi di micotossine. Nell ambito del controllo delle micotossine nella filiera viti-vinicola, recentemente presso l ISPA sono stati messo a punto metodi di analisi affidabili per l analisi di OTA nei mosti, nelle uve e prodotti derivati dalla vinificazione e per la decontaminazione dei mosti/vini contaminati da OTA. L ISPA dispone di adeguate competenze per la caratterizzazione biotecnologica di batteri lattici e lieviti associati ai principali vitigni ed areali di produzione regionali, mediante l identificazione di ceppi d interesse industriale con metodiche molecolari, fisiologiche, tecnologiche ed enologiche. L ISPA possiede una riconosciuta esperienza nello sviluppo e nella validazione di nuovi metodi di analisi molecolare di DNA in diverse matrici agroalimentari. L ISPA-CNR ha sviluppato negli anni una fitta rete di collaborazioni a livello nazionale ed internazionale e partecipa a numerosi progetti di ricerca nel campo della sicurezza alimentare, anche con funzioni di coordinamento. Di particolare rilievo è il coordinamento da parte dell'ispa-cnr di un grande progetto di collaborazione scientifica nell'ambito del VII Programma Quadro per la Ricerca e lo Sviluppo Tecnologico dell'unione Europea finalizzato alla riduzione del contenuto di micotossine nelle derrate alimentari (MYCORED). E importante notare in relazione al progetto anche la partecipazione al Network di Eccellenza europeo MoniQA (VI Programma Quadro) per l armonizzazione dei metodi di analisi di contaminanti negli alimenti, con cui si potrà integrare il progetto in relazione a diverse attività di interesse comune (micotossine, allergeni, patogeni). Con la sua politica rivolta alla costante innovazione ed al sostegno mirato alla crescita del territorio, L ISPA- CNR si pone come interlocutore privilegiato nello scenario nazionale ed internazionale, attivando proficue e strategiche collaborazioni con organizzazioni leader nel panorama agroalimentare mondiale (ad es.: FAO, EFSA, FSA, USDA) o con importanti realtà industriali (Barilla, IBM Italia, Syngenta, Bayer, Thermo, Copaim, ecc.) per la realizzazione di progetti di ricerca finanziati nell ambito di programmi regionali, nazionali e comunitari (POR, PON, FP7, ecc.). Università degli Studi di Bari Aldo Moro, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-forestale ed Ambientale DiBCA) Il gruppo di Microbiologia Applicata del Dipartimento ha una pluriennale esperienza nel campo della microbiologia e tecnologia degli alimenti. In particolare, una significativa parte dell attività di ricerca è dedicata alla qualità sensoriale, microbiologica e nutrizionale dei derivati lattiero caseari, ed alla messa a punto di innovazioni di processo e/o prodotto esclusive di tale categoria di alimenti. Nello specifico dei formaggi a pasta filata, i ricercatori del Dipartimento vantano sei pubblicazioni su riviste internazionali censite dall ISI. L esperienza acquisita nel settore suddetto ha avuto una visibilità tale da consentire la pubblicazione di sei capitoli su libri a divulgazione internazionale, in seguito all invito presentato dai relativi editori. Non meno importante è la linea di ricerca sull uso di antimicrobici naturali portata avanti dai ricercatori del Dipartimento, testimoniata da cinque pubblicazioni su riviste internazionali censite dall ISI. Università degli Studi di Bari Aldo Moro, Dipartimento di Medicina Veterinaria (Ex Dipartimento di Sanità Pubblica e Zootecnia DISPeZ) Il Dipartimento riconosce una grande Area di ricerca relativa alle Malattie parassitarie, alle Malattie Infettive e al Controllo della sicurezza degli alimenti. Il Laboratorio dell Area ha competenze su: Diagnostica molecolare (PCR qualitativa, RT-PCR, real-time analisi dei polimorfismi, sequenziamento. western-blotting, NASBA, microsatelliti; PCR-SSCP, make up genetico, analisi filogenetiche e di popolazione, SDS-PAGE, Reverse Line Blot.). Diagnostica mediante saggi immunoenzimatici (Elisa e Ria). Disegno e progettazione di saggi diagnostici per l identificazione di parassiti (saggi real-time; saggi LAMP; saggi di genotipizzazione mediante mini- e micro satelliti e loci genici altamente ripetuti, Fluorescentamplicon generation assay. Epidemiologia-molecolare dei protozoi. Diagnostica di protozoi di interesse medico, tra cui in particolare Giardia duodenalis e Cryptosporidium spp, da campioni clinici e dalle acque potabili e reflue, con tecniche di: concentrazione mediante sedimentazione e flottazione; microscopia con colorazioni specifiche e tramite test di immunofluorescenza diretta; 37

38 Colture sia in terreni axenici che in colture cellulari, in particolare di Giardia duodenalis e Cryptosporidium spp Il Laboratorio ha collaborazioni consolidate con altri Organismi di Ricerca sia Regionali, sia Extra: Dipartimento di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (ex PrIME), Università degli Studi di Foggia, Facoltà di Agraria; Ospedale Bambino Gesù, Roma; Dipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Teramo, Facoltà di Medicina Veterinaria; Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica, Università degli Studi di Roma La Sapienza, Facoltà di Medicina e Chirurgia; Dipartimento di Sanità Pubblica e Biologia Cellulare, Università di Roma Tor Vergata, Facoltà di Medicina e Chirurgia. Università degli Studi di Foggia, Dipartimento di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente: - Ex Dipartimento di Scienze degli Alimenti (DiSA) Il laboratorio di Microbiologia Molecolare della Facoltà di Agraria dell Università degli Studi di Foggia è diretto dal professor Giuseppe Spano. Il professore Spano è stato responsabile di Unità Operativa di progetti di ricerca approvati dal MIUR, dal Ministero dello Sviluppo Economico, dal Ministero delle Risorse Agricole in collaborazione con piccole e medie imprese del settore vitivinicolo o cerealicolo. Il Professore Spano è attualmente responsabile scientifico di Unità di Ricerca del progetto di ricerca finanziato nell ambito del VII programma quadro dalla Comunità Europea dal titolo: Controlling Biogenic Amines in Traditional Food Fermentations BiAMFOOD. Dal 28/02/2009 il professore Spano è componente dell Albo degli esperti della European Food Safety Authority (EFSA) e dal 2010 è componente del gruppo di lavoro che si occupa, all interno dell EFSA dei rischi derivanti dalla presenza di ammine biogene in alimenti fermentati. E autore o coautore di più di cento pubblicazioni su riviste Nazionali ed Internazionali inerenti la Microbiologia enologica e la Microbiologia Industriale in generale. E frequentemente interpellato in qualità di referee dalle principali riviste del settore. Collabora con diverse Università e Centri di ricerca internazionali nel campo della microbiologia enologica e con diverse aziende coinvolte nella preparazione e produzione di starter microbici. Le linee di ricerca principali sono mirate: alla selezione e caratterizzazione di starter enologici (lieviti e batteri); al controllo delle ammine biogene in bevande fermentate; alla identificazione, allestimento ed utilizzo di coinoculi vinari; all analisi della tolleranza agli stress in microrganismi di interesse industriale. - Ex Dipartimento di Scienze Agro-ambientali, Chimica e Difesa Vegetale (DiSACD) Il gruppo GiBCA dell ex dipartimento DiSACD ha una vocazione storica nello sviluppo e messa a punto di metodi analitici innovativi per il monitoraggio in campo agro-alimentare, clinico ed ambientale. La ricerca è orientata al settore della sicurezza alimentare, con lo sviluppo di metodi per la determinazione di xenobiotici (analisi di micotossine, pesticidi, metalli pesanti, fitormoni, ammine biogene), e del monitoraggio della qualità, che prevede la tracciabilità ed il controllo di processo e di prodotto, anche con l ausilio di dispositivi analitici innovativi (biosensori). Le competenze scientifiche maturate riguardano le tecniche spettroscopiche, quali XPS, Assorbimento Atomico (in fiamma, fornetto e ICP), Spettroscopia UV-Vis, Spettrofluorimetria e Spettrometria di Massa, le tecniche elettroanalitiche, l analisi in flusso (FIA), il campionamento con microdialisi e microestrazione in fase solida (SPME) e le tecniche cromatografiche, quali GC ed HPLC. L attività scientifica è rivolta: alla caratterizzazione elettroanalitica e spettroscopica di materiali innovativi, impiegati nella realizzazione di dispositivi d interesse energetico e bioanalitico; alla realizzazione e caratterizzazione di biosensori amperometrici ad enzima immobilizzato in film polimerici elettrosintetizzati e loro applicazione; alla messa a punto di elettrodi modificati con metalli di transizione e con film elettrosintetizzati e loro applicazione come rivelatori in cromatografia liquida, per la determinazione di sostanze d interesse alimentare; allo sviluppo di metodi analitici per la tracciabilità e monitoraggio della qualità di prodotti alimentari; allo sviluppo di metodi analitici innovativi per il monitoraggio di xenobiotici in campo alimentare ed ambientale; all analisi di componenti volatili mediante GC-MS, con campionatori purge and trap ed SPME; alla Proteomica strutturale e funzionale con tecniche di nano- LC/ESI/IT/MS/MS n e MALDI/TOF. - Ex Dipartimento di Scienze delle produzioni e dell innovazione dei sistemi agro-alimentari mediterranei (PrIME) Il Dipartimento riconosce un Area di ricerca relativa alle Produzioni animali e alle scienze veterinarie. In particolare, le ricerche sono rivolte a: i) lo studio del benessere degli animali e metodi di gestione sostenibili dell allevamento, per il miglioramento della qualità delle produzioni animali (carne, latte, prodotti caseari, produzioni ittiche); ii) le zoonosi e loro impatto sulla salute degli animali e sull uomo. Il Laboratorio di Parassitologia ha competenze su: Biologia ed epidemiologia di protozoi di interesse zoonosico (Giardia e Cryptosporidium) 38

39 Diagnostica molecolare (PCR qualitativa, RT-PCR, real-time PCR, analisi dei polimorfismi, sequenziamento. western-blotting, NASBA, microsatelliti). Diagnostica mediante saggi immunoenzimatici (Elisa e Ria). Il Laboratorio ha collaborazioni consolidate con altri Organismi di Ricerca sia Regionali sia Extra: Dipartimento di Benessere animale, Università degli Studi di Bari, Facoltà di Medicina Veterinaria; Dipartimento di Scienze biomediche, Università degli Studi di Teramo, Facoltà di Medicina Veterinaria; Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica, Università degli Studi di Roma, Facoltà di Medicina e Chirurgia. I suddetti hanno competenze nel campo della patologia ittica e della biologia molecolare degli agenti patogeni: PCR-SSCP, make up genetico, analisi filogenetiche e di popolazione, SDS-PAGE, Reverse Line Blot. Università del Salento, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali DiSTeBA (Ex Dipartimento di Ingegneria dell Innovazione DII) L Unità di ricerca, coordinata dal Prof. Valli, operante presso il laboratorio di Chimica Fisica del Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali (DiSTeBA), da diversi anni sviluppa metodi innovativi in spettroscopia infrarossa per indagini strutturali e funzionali su sistemi biologici e su film sottili organici. Esistono competenze specifiche e strumentazione idonea non solo per indagini spettroscopiche nel medio infrarosso (MIR) ma anche nell intervallo dell ultravioletto (UV), del visibile (VIS) del vicino infrarosso (NIR). Il gruppo ha inoltre una notevole esperienza nell'immobilizzazione su supporto solido di film sottili di (bio)materiali, composti organici e compositi organico/inorganico e nello sviluppo di sensori chimici ottici, resistivi e piezoelettrici. Agriplan s.r.l. Agriplan srl è una società di studi e servizi che opera nell ambito della filiera agro alimentare. Nel settore agroalimentare e dello sviluppo rurale, la società svolge le proprie attività nelle seguenti aree tematiche: - promozione dei prodotti agroalimentari, - studi, ricerche e servizi, - sviluppo territoriale, - formazione. Per quanto riguarda studi, ricerche e servizi, Agriplan svolge attività di supporto per lo sviluppo della ricerca industriale e l innovazione tecnologica per la filiera agroalimentare in collaborazione con le istituzioni scientifiche. I servizi riguardano: - Fund raising: individuazione di strumenti agevolativi di fonte comunitaria, nazionale e regionale. - Ricerca e attivazione di partnership pubblico private. - Catalizzatore di processi di sviluppo aziendale grazie all interazione tra imprese ed enti di ricerca. - Progettazione di massima ed esecutiva. - Realizzazione e gestione di progetti e programmi nel settore agroalimentare. - Ricerche di mercato e marketing. Azienda Vinicola Cantele s.r.l. Nei primi anni 80 nasce l'azienda vinicola Cantele che sin dagli inizi ha come obiettivo quello di valorizzare le grandi potenzialità di una piattaforma ampelografica caratterizzata dalla tipicità di vitigni storici quali il Negroamaro ed il Primitivo e dalla perfetta capacità di adattamento e di espressione ad alto livello di vitigni internazionali come lo Chardonnay, il Merlot, il Cabernet Sauvignon. Per questo motivo la filosofia aziendale è stata improntata sulla selezione di un ristretto gruppo di viticoltori che ha permesso all'azienda di lavorare su circa 250 ha di vigneto con il fine di produrre le uve in funzione degli obiettivi aziendali in materia di qualità e denominazioni geografiche. La costruzione di una nuova cantina presso il comune di Guagnano ha dato nuovo impulso al progetto volto alla ricerca della qualità con una più scrupolosa gestione del vigneto e l'introduzione, negli schemi di lavorazione, di moderne tecnologie. L azienda collabora costantemente con centri di ricerca e università al fine di acquisire un sempre più elevato standard qualitativo. Alcuni risultati dei progetti che l hanno vista partecipe negli ultimi anni riguardano ad esempio la messa a punto di strumenti innovativi per il miglioramento della sicurezza dei vini tipici pugliesi. 39

40 Azienda Viti-vinicola Incoronata di Scapola Luca Anche se l azienda non ha precedenti esperienza in progetti di ricerca e sviluppo è sempre attenta all innovazione ed al miglioramento continuo. Obiettivo strategico nel prossimo triennio, infatti, è il miglioramento del processo produttivo con riferimento ad una maggiore capacità di trasformazione ed alla valorizzazione della qualità e sicurezza del prodotto, con possibilità di intaccare nuove nicchie di mercato in un contesto nazionale ed estero. Per la realizzazione di tale obiettivo, infatti, intende potenziare il laboratorio interno con protocolli, strumentazioni e dispositivi di analisi rapidi ed accurati, al fine di monitorare sia le materie prime, sia il prodotto finito nell ottica del raggiungimento di parametri di qualità, richiesti dal mercato, e sicurezza, prevista dalle normative cogenti del settore alimentare. Biotecgen s.r.l. Biotecgen srl (BTG) è una P.M.I. che opera dal 2002 nel settore della Ricerca e Sviluppo finalizzata alla messa a punto di soluzioni diagnostiche innovative basate su tecnologie biomolecolari, DNA arrays e di biosensori per l espressione genica e il rilevamento di DNA e proteine, in ambito microbico e di cellule in coltura. Nell ambito di attività di sviluppo di test rapidi per la detection di patogeni la PMI agirà da consulente per lo sviluppo di tecnologie bio-molecolari e biosensori. I principali campi di applicazione delle suddette riguardano l ambito medico, agroalimentare ed ambientale. Lo staff è composto da tre Biologi PhD, un Tecnico Specializzato ed un Dottore Commercialista responsabile del settore amministrativo e contabile. Nel corso degli anni l azienda, grazie alla partecipazione a progetti di Ricerca e Sviluppo in ambito internazionale, nazionale e regionale, ha potuto acquisire una concreta e peculiare competenza nella messa a punto di microarrays e lateral flow devices. Presso i laboratori della Biotecgen srl, incubati nell area della ricerca del campus Ecotekne di Lecce, è presente la seguente strumentazione di rilievo: - DNA microarrays: laser scanner, spottatore Perkin Elmer - Spettrometria di Massa - Termociclatori x PCR - Real time PCR - Nanodrop spettrofotometro per microvolumi. BonassisaLab s.r.l. BonassisaLab è un laboratorio di analisi e ricerca scientifica nei settori agroalimentare, ambientale e sanitario. I servizi offerti riguardano analisi chimiche e microbiologiche di vario genere su alimenti, acque, aria, terreni e rifiuti. I Laboratori vantano un elevatissimo grado di innovazione degli impianti e della strumentazione produttiva, oltre che professionalità di prim'ordine (su cui l'azienda effettua continui investimenti in termini formativi). L azienda è specializzata nella determinazione di microinquinanti di natura organica e inorganica, la cui ricerca viene effettuata nell ambito della sicurezza dei prodotti alimentari, nell ambito della tutela per l ambiente e, più in generale, nell ambito del rispetto per la vita. La Bonassisalab srl vanta diverse collaborazioni con enti di ricerca e partecipazioni in progetti di ricerca e sviluppo, con il fine ultimo di migliorare i propri servizi di analisi sui prodotti agroalimentari e, in particolare, implementare le garanzie per il settore agroalimentare, a fronte del crescente interesse da parte dei consumatori sul tema della sicurezza alimentare. Cantine D Alfonso del Sordo s.r.l. L azienda integra verticalmente tutta la produzione viti-vinicola, dalla gestione dei vigneti, fino ad imbottigliamento, confezionamento e commercializzazione del prodotto finito. La strategia aziendale prevede uno sforzo continuo in ricerca e sviluppo per garantire efficacemente la qualità sensoriale e igienicosanitaria del prodotto finito, così da incontrare il favore dei consumatori e da essere conforme rispetto alle diverse normative. L azienda collabora costantemente con centri di ricerca e università al fine di acquisire un sempre più elevato standard qualitativo; attualmente infatti è partner di 2 progetti europei, uno ha l obiettivo scientifico di produrre cibi più sani, riducendo o eliminando le ammine biogene (AB) in prodotti fermentati, (quali formaggi, vini e sidro), l altro che prevede la sperimentazione in campo di un innovativo sistema di monitoraggio della flavescenza dorata. Un azienda pertanto che ambisce ad innovare produzioni di punta della tradizione agroalimentare europea. 40

41 C.D.P. s.r.l. L azienda, nata nel 2008, si sta affermando come una delle realtà principali nel settore della molitura del grano duro per la produzione di semola rimacinata e di semola per paste di alta qualità. Per proseguire nel raggiungimento di tale obiettivo e garantire una sempre crescente qualità e sicurezza alimentare del prodotto offerto l Azienda intende investire in innovazione e ricerca per sviluppare nuovi sistemi green che consentano di elevare ancora gli standard di sicurezza e qualitativi. L Azienda ha avviato dal 2009 la lavorazione anche di altri cereali oltre al grano in modo da diversificare l offerta ai propri clienti. Anche se l azienda non ha precedenti esperienza in progetti di ricerca e sviluppo, poiché è nata nel 2008, è sempre attenta all innovazione, ritenendo strategico lo sviluppo e l applicazione di processi innovativi. Centro Latte Stasi s.r.l. La produzione aziendale si basa esclusivamente su formaggi a pasta filata e derivati, con due diverse tecnologie: acidificazione chimica e acidificazione biologica. Il Centro Latte Stasi nasce nel 1953 in un piccolo laboratorio a gestione familiare. Negli anni 80 l azienda incrementa la manodopera ed amplia la struttura impiantistica. Nel tempo la quantità di latte trasformato è passata dagli iniziali 100 Lt. agli oltre 8000 con conseguente ampliamento della struttura. Gli anni 90 sono caratterizzati da notevoli investimenti ed alla fine degli anni 90, l azienda viene trasferita in un area più vasta, più adeguata alle sopravvenute esigenze di mercato e più rispondente ai moderni standard tecnologici. Anche se l azienda non ha precedenti esperienza in progetti di ricerca e sviluppo è sempre attenta all innovazione, ritenendo strategico lo sviluppo e l applicazione di processi innovativi. Tradizione ed innovazione, infatti, sono sempre state le linee guida del Centro Latte Stasi che, continuerà ad operare in questa direzione, visti i risultati prestigiosi conseguiti dall azienda nel corso degli oltre cinquanta anni di attività. Ciullo Carni s.r.l. L'azienda Ciullo Carni, sviluppa l'intero processo di filiera dal sezionamento alla consegna della carne con propri automezzi refrigerati in funzione di ogni singola esigenza del cliente. Non solo ingrosso di carni fresche quindi, ma anche sezionamento, lavorazione e preparazione di cibi e insaccati a base di carne. Il nuovo stabilimento rappresenta il cuore pulsante dell innovativo sistema aziendale. La materia prima proveniente da allevamenti selezionati è seguita fino alla tavola dei propri clienti per garantire il meglio nel rispetto rigoroso delle norme igienico-sanitarie costantemente sotto controllo. Le nuove linee produttive consentono di realizzare nuovi prodotti in vaschetta (ATM) o sottovuoto permettendo di chiudere la filiera produttiva offrendo il meglio ai propri clienti. Seppur da sempre attenta e vigile circa la ricerca finalizzata alla messa a punto di processi innovativi, l azienda Ciullo Carni non ha ad oggi realizzato progetti di ricerca e sviluppo. Coop. Lavorazione Prodotti Agricoli Terra Maiorum La cooperativa conta circa 1145 soci produttori e conferenti di uve e olive che vengono trasformate in vini ed oli tipici del luogo. La vocazione dei terreni agricoli, la loro ubicazione in media collina, la struttura chimico-fisica ed il clima favorevole fanno sì che la zona di produzione delle uve assicurino alle stesse un buo grado di maturazione. La varietà di uve coltivate nei vigneti dei soci sono quelle tradizionali "Bombino Nero" per la produzione del vino rosato, il "Pampanuto" per il vino ianco e il "Nero di Troia" per il rosso. La scarsa produttività dei terreni e i sistemi di coltivazione, prevalentemente a spalliera non danno produzioni per ettaro molto alte ma garantiscono una buona maturazione e un'ottima qualità del prodotto. L'area di produzione rientra nel comprensorio D.O.C. "Castel del Monte. Sono prodotti con il sistema delle fermentazioni a temperature controllate che assicurano un particolare bouquet ed il tipico sapore di fruttato. Anche se l azienda non ha precedenti esperienza in progetti di ricerca e sviluppo è sempre attenta all innovazione ed al miglioramento continuo. Industrie Fracchiolla s.r.l. La Industrie Fracchiolla Srl è un azienda leader in Italia ed affermata anche in campo internazionale per la progettazione, produzione, vendita, ed installazione di serbatoi in acciaio inox, macchine enologiche, olearie e per l industria alimentare in genere, oltre alla progettazione ed alla realizzazione di cantine ed oleifici chiavi in mano. Nel 2001, ha brevettato una innovativa macchina di vinificazione (Gioiello) idonea per ottenere un vino di altissima qualità. Nel corso degli ultimi anni la Industrie Fracchiolla srl ha visto crescere il proprio volume di affari del 20% anno. La richiesta da parte delle cantine e degli stabilimenti vinicoli di 41

42 macchinari ed attrezzature che siano in grado di migliorare tecnologicamente il processo produttivo ha spinto l azienda ad investire in Progetti di Ricerca industriale per la progettazione e la costruzione di vinificatori particolarmente innovativi. L azienda ha così assunto nel 2008 due nuovi ingegneri meccanici dedicati alla progettazione di nuovi macchinari, i quali sono coordinati dagli altri componenti dell Ufficio Tecnico. L azienda ritiene pertanto determinante offrire macchine, attrezzature ed impianti tecnologicamente avanzati che siano in grado di far aumentare la redditività del processo di produzione della propria clientela, consentendo inoltre di ridurre i costi d esercizio in quanto si riescono ad ottenere prodotti di qualità evitando errori e difetti in fase di produzione. La strategia della Direzione aziendale confida fortemente che l esito positivo delle attività di Ricerca possa generare effetti positivi in termini di crescita del fatturato, con ricadute favorevoli sulla competitività e redditività. Nel corso degli ultimi 5 anni l azienda ha avviato, sviluppato e portato positivamente a termine numerose collaborazioni con i più prestigiosi Enti di Ricerca presenti nel nostro territorio, riuscendo ad affrontare e risolvere diverse problematiche nello sviluppo di nuove macchine e prototipi idonei per l uso industriale nel settore enologico ed alimentare. Lab. Instruments s.r.l. L azienda nasce nel 1984 quale azienda operante nel settore della fornitura di laboratori chimici di industrie del settore alimentare, chimico-farmaceutico, oltre a Università, CNR, IZS, ARPA, ITIS e laboratori privati. Al fine di supportare il miglioramento della qualità del dato analitico prodotto dai laboratori di controllo, le strategie di sviluppo aziendali prevedono: produzione di miscele calibranti di standard chimici; noleggio e manutenzione di strumentazione scientifica; trasferimento e implementazione di metodiche avanzate per la diagnosi rapida di contaminanti alimentari; servizio di consulenza applicativa e di formazione del personale. La Lab.Instruments srl opera già da oltre 25 anni nel settore delle forniture di apparecchiature scientifiche e materiali per laboratori di analisi. Negli ultimi anni ha avviato la produzione di miscele standard di fitofarmaci per analisi multiresiduale e la fornitura di spettrometri di massa. Anche se l azienda non ha precedenti esperienza in progetti di ricerca e sviluppo è sempre attenta all innovazione ed al miglioramento continuo. Molini Tandoi Pellegrino S.p.A. Molini Tandoi è impegnata nella trasformazione di prodotti cerealicoli e produce semilavorati dotati di elevata qualità. Tale risultato deriva dall attenta selezione delle materie prime e dall impiego di tecnologie innovative. Un impegno che è parte integrante della mission aziendale e che si rinnova costantemente. La struttura è dotata di tecnologie innovative capaci di trasformare tonnellate di grano all anno. La tecnologia della decorticazione applicata al grano tenero e al grano duro e le tecnologie di micronizzazione ed essiccazione preservano la qualità igienico-sanitaria delle farine e delle semole oltre che l integrità nativa di componenti biologici essenziali delle nuove produzioni che utilizzano miscele di grano duro, tenero, orzo, farro, grano saraceno, avena. Farine e semole prodotte dai Molini Tandoi sono distribuite in Italia per circa il 75%, e in Europa e nel resto del mondo per il restante 25%, con i propri marchi e con private label. Di estrema importanza per le strategie aziendali in tema di sicurezza alimentare è l impiego nei propri laboratori di strumentazione diagnostica e metodi analitici affidabili per l'analisi rapida e accurata di micotossine nelle produzioni della filiera cerealicola. L interesse è determinato dalla necessità di poter disporre di dati inerenti la qualità igienico-sanitaria del prodotto a più basso costo e, conseguentemente, incrementare la competitività sul mercato. L azienda vanta una notevole attività di ricerca, svolta per il miglioramento della qualità e sicurezza della filiera cerealicola con una serie di progetti in collaborazione con istituzioni pubbliche e numerose imprese (PMI e grandi imprese). 7) RESPONSABILE DEL PROGETTO Dr. Angelo Visconti, nato a Scorrano (LE) il 12 febbraio 1951, residente a Bari, in via G. Fanelli n. 218/A, laureato in Chimica, è membro del Consiglio di Amministrazione del DARE in rappresentanza del socio Consiglio Nazionale delle Ricerche. E Direttore dell Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari del CNR, a cui afferiscono 110 unità di personale di cui 65 ricercatori, con un numero medio di circa 80 progetti annui di ricerca, sviluppo e formazione. E (ed è stato) coordinatore di numerosi progetti (o workpackage) di ricerca nazionali ed europei 42

43 e di ricerca industriale con diverse imprese pugliesi, nazionali ed internazionali. Ha coordinato, tra l altro, un progetto RIDITT per il trasferimento tecnologico di innovazioni biotecnologiche al sistema produttivo pugliese (AGRIBIT). Curriculum vitae: vedi documento allegato. 8) OBIETTIVI, ATTIVITÀ E TEMPISTICA 8.1 Struttura del prodotto/processo/servizio La presente proposta progettuale è articolata in 8 distinti Obiettivi Realizzativi (OR). Il diagramma seguente si riferisce allo schema logico del progetto (in termini di OR). Prevenzione Controllo Correzione OR 1 OR 2 OR 3 UVA e VINO Strumenti preventivi innovativi per la riduzione del rischio di microrganismi alteranti in vino Strumenti di controllo innovativi per la determinazione di contaminanti in uva e vino Strumenti correttivi innovativi per la rimozione di metaboliti microbici indesiderati nel vino OR 8 FRUMENTO e DERIVATI OR 4 Strumenti preventivi e correttivi innovativi per la riduzione del rischio di contaminazione da microrganismi indesiderati, micotossine e insetti nel frumento OR 5 Strumenti di controllo innovativi per la determinazione di contaminanti in cereali e derivati OR 4 Strumenti preventivi e correttivi innovativi per la riduzione del rischio di contaminazione da microrganismi indesiderati, micotossine e insetti nel frumento SCALE UP Industriale Strumenti Preventivi, di Controllo e Correttivi messi a punto nel progetto OR 6 OR 7 PRODOTTI FRESCHI Strumenti preventivi innovativi per la prevenzione del rischio di contaminazione di prodotti freschi Strumenti di controllo innovativi per la determinazione di metalli pesanti e microrganismi patogeni in prodotti freschi Ciascun Obiettivo Realizzativo (OR) è stato suddiviso in una serie di Obiettivi Specifici (OS), ognuno dei quali è stato scomposto in diversi Task. Nello specifico: OR 1 - STRUMENTI PREVENTIVI INNOVATIVI PER LA RIDUZIONE DEL RISCHIO DI MICRORGANISMI ALTERANTI IN VINO OS1.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per minimizzare lo sviluppo di lieviti del genere Brettanomyces e per ridurre la produzione e la presenza di etilfenoli nel vino Task Sviluppo di metodiche biotecnologiche e cromatografiche per l'analisi delle dinamiche microbiche di Brettanomyces bruxellensis Task Studio dell influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni aziendali sullo sviluppo di diversi ceppi di Brettanomyces bruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati RI RI 43

44 Task Studio di strategie di riduzione del rischio da Brettanomyces bruxellensis e definizione di un protocollo di prevenzione OR 2 STRUMENTI DI CONTROLLO INNOVATIVI PER LA DETERMINAZIONE DI CONTAMINANTI IN UVA E VINO OS2.1: Messa a punto di metodiche di controllo per la selezione delle uve per la vinificazione e per la determinazione di ocratossina A in uva e vino OS2.2: Messa a punto di una metodica multi-analita LC- MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni nel vino OS2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento Task Sviluppo e validazione di una metodica analitica basata sulla tecnica MEPS per la determinazione dell'ocratossina A in uva e vino Task Sviluppo e validazione di una metodica analitica per la determinazione simultanea di glucosio e alcool nelle uve, basata sull'impiego di un biosensore doppio Task Messa a punto di una metodica LC-MS(MS) per la determinazione simultanea di allergeni di latte e di uovo in vini chiarificati Task Sviluppo di un immunosaggio basato su FP e/o LFD e/o SPR per la determinazione di allergeni di latte e uovo in vini chiarificati Task Studio di fattibilità, sviluppo di materiali di riferimento (RM) e loro certificabilità per l analisi multi residuale di fitofarmaci nella matrice vino mediante strumenti di controllo innovativi Task Sviluppo e validazione di metodiche multiresiduali in alta risoluzione (LC-HRMS) per la determinazione di fitofarmaci untargeted nel vino RI RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS OR 3 STRUMENTI CORRETTIVI INNOVATIVI PER LA RIMOZIONE DI METABOLITI MICROBICI INDESIDERATI NEL VINO OS3.1: Messa a punto di un prototipo per la rimozione dell ocratossina A (OTA) nel vino mediante la tecnica del ripasso continuo su vinacce/buccette OS3.2: Sviluppo di metodologie bio-molecolari per la decontaminazione/degradazione dell ocratossina A (OTA) nei mosti-vini Task Reperimento di vinacce esenti da OTA e di partite di mosti/vini naturalmente contaminate da OTA Task Stabilizzazione delle vinacce Task Rimozione dell OTA dai mosti/vini mediante ripasso breve su vinacce o loro componenti esenti da OTA Task Sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo su vinacce e/o loro componenti Task Isolamento e caratterizzazione di popolazioni microbiche in grado di degradare l'ota Task Identificazione di geni codificanti gli enzimi correlati alla degradazione di OTA in isolati microbici naturali Task Espressione dei geni identificati e valutazione dell'attività di degradazione di OTA OR 4 STRUMENTI PREVENTIVI E CORRETTIVI INNOVATIVI PER LA RIDUZIONE DEL RISCHIO DI CONTAMINAZIONE DA MICRORGANISMI INDESIDERATI, MICOTOSSINE E INSETTI NEL FRUMENTO OS4.1: Messa a punto di metodiche per il trattamento di Task Uso di ozono per prevenire lo sviluppo di insetti, batteri alterativi, funghi tossigeni e loro metaboliti tossici RI RI SS RI SS RI SS RI RI RI RI 44

45 cariossidi di frumento con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata per prevenire la contaminazione da microrganismi indesiderati e l'infestazione da insetti Task Progettazione e realizzazione del generatore di ozono gassoso e/o acqua ozonizzata RI SS OR 5 - STRUMENTI DI CONTROLLO INNOVATIVI PER LA DETERMINAZIONE DI CONTAMINANTI IN CEREALI E DERIVATI OS5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento OS5.2: Messa a punto di una metodica multi-micotossina in cereali e derivati e produzione di materiali di riferimento Task Individuazione delle sottoclassi di fitofarmaci, studio dell effetto matrice (frumento) sull analisi strumentale di fitofarmaci (RI) di solubilità, stabilità ed allestimento delle aliquote da destinare al proficiency test Task Sviluppo e confronto di metodiche di rivelazione basate sull uso di spettrometri di massa ad alta risoluzione (HRMS: untargeted analisys) e spettrometri a triplo quadrupolo (QqQ: targeted analysis) Task Produzione di materiali di riferimento (farine di frumento e mais) multi-micotossina Task Sviluppo di metodiche multi-analita LC-MS(MS) per micotossine in cereali e prodotti derivati. RI RI SS RI SS RI SS OS5.3: Messa a punto di una metodica analitica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati OS5.4: Sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di micotossine in cereali e derivati Task Sviluppo di una metodica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati Task Messa a punto di immunosaggi a polarizzazione di fluorescenza (FP) per la determinazione di OTA, DON e tossine T- 2 e HT-2 in cereali e prodotti derivati Task Messa a punto di un saggio lateral flow (LF) per la determinazione di OTA in cereali e prodotti derivati Task Messa a punto di metodi di spettroscopia nel vicino infrarosso (FT-NIR) per la determinazione semi-quantitativa/ qualitativa di DON e OTA in cereali e prodotti derivati Task Messa a punto di un metodo basato sul naso elettronico con tecnologia MOS per la determinazione di DON e OTA in cereali e prodotti derivati RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS OR 6 STRUMENTI INNOVATIVI PER LA PREVENZIONE DEL RISCHIO DI CONTAMINAZIONE DI PRODOTTI FRESCHI OS6.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per ridurre i rischi di alterazione da Pseudomonas spp. nelle mozzarelle OS6.2: Impiego di compost e strategie agronomiche innovative per ridurre il contenuto di metalli pesanti nelle produzioni orticole da consumo fresco Task Selezione di batteri lattici bio-conservanti Task Valutazione delle strategie di controllo di Pseudomonas spp. in condizioni di laboratorio Task Individuazione e valutazione di differenti compost idonei all impiego come substrati di coltivazione e/o ammendanti in orticoltura Task Screening varietale su pomodoro da mensa e lattuga Task Confronto tra sistemi di coltivazione (terreno vs. senza suolo) sull accumulo di metalli pesanti in pomodoro e lattuga RI RI RI RI RI 45

46 Task Sviluppo di tecniche innovative per ridurre l accumulo di metalli pesanti in pomodoro e lattuga OR 7 STRUMENTI DI CONTROLLO INNOVATIVI PER LA DETERMINAZIONE DI METALLI PESANTI E MICRORGANISMI PATOGENI IN PRODOTTI FRESCHI OS7.1: Sistemi innovativi per la diagnosi rapida di metalli pesanti in prodotti freschi OS7.2: Messa a punto di un prototipo per la diagnosi rapida di patogeni emergenti in molluschi bivalvi Task Messa a punto di sistemi innovativi per la rivelazione di metalli pesanti in matrici alimentari mediante la spettroscopia ATR-FTIR e microbilance piezoelettriche Task Allevamenti artificiali di molluschi edibili e spiking delle acque con protozoi zoonosici emergenti Task Rilevazione e quantificazione degli agenti patogeni nei molluschi contaminati e messa a punto di protocolli standardizzati mediante Real Time PCR Task Messa a punto della piattaforma Task Costruzione del prototipo e verifica dello strumento RI RI SS RI RI RI SS OS7.3: Sviluppo di sistemi di allerta rapidi per la presenza di patogeni Gram Positivi (Listeria) e negativi (Salmonella) in tagli bovini prima della destinazione d uso Task Analisi bioinformatica e progettazione e sperimentazione di DNA arrays Task Analisi su Matrice Complessa Task Messa a punto di sistemi di rilevamento dei patogeni tramite protein chip biosensori, DNA microarrays e immunosensori lateral flow RI RI RI SS OR 8 SCALE UP INDUSTRIALE DEGLI STRUMENTI PREVENTIVI, DI CONTROLLO E CORRETTIVI MESSI A PUNTO NEL PROGETTO OS8.1: Scale up degli strumenti preventivi messi a punto nel progetto (VINO / FRUMENTO / MOZZARELLA) OS8.2: Scale up degli strumenti di controllo messi a punto nel progetto (VINO / FRUMENTO / CARNI) OS8.3: Scale up degli strumenti correttivi messi a punto nel progetto (VINO) Task Sperimentazione su scala industriale di un protocollo biotecnologico che minimizzi lo sviluppo di lieviti di B. bruxellensis e che riduca la presenza di etilfenoli nel vino Task Sperimentazione su scala industriale di un prototipo per il trattamento delle cariossidi di frumento con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata al fine di prevenire/ridurre la contaminazione da microrganismi indesiderati e l infestazione da insetti Task Sperimentazione su scala industriale di un protocollo biotecnologico che riduca i rischi di alterazione da Pseudomonas spp su latti di origine e storia tecnologica diversa Task Applicazione in condizioni operazionali della metodica basata sul biosensore doppio Task Applicazione in condizioni operazionali della metodica analitica per la determinazione di ocratossina A Task Validazione dell immunosaggio a polarizzazione di fluorescenza (FP) Task Verifica dell efficacia dei metodi innovativi a biosensori/biochips Task Validazione in cantina dei protocolli di stabilizzazione delle vinacce, di ripasso dei mosti/vini e di gestione complessiva del processo di detossificazione SS SS SS SS SS SS SS SS 46

47 8.2 Obiettivi realizzativi e Attività OR 1 - STRUMENTI PREVENTIVI INNOVATIVI PER LA RIDUZIONE DEL RISCHIO DI MICRORGANISMI ALTERANTI IN VINO OS1.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per minimizzare lo sviluppo di lieviti del genere Brettanomyces e per ridurre la produzione e la presenza di etilfenoli nel vino Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: Università degli Studi di Foggia, Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex Dipartimento di Scienze degli Alimenti DiSA); ISPA- CNR) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Sviluppo di metodiche biotecnologiche e cromatografiche per l'analisi delle dinamiche microbiche di Brettanomyces bruxellensis (RI) Attività a - Isolamento mediante tecniche colturali di ceppi autoctoni di Brettanomyces bruxellensis in vini pugliesi e validazione della metodica molecolare per la identificazione, quantificazione e genotipizzazione rapida di B. bruxellensis in vino (RI) Diversi biotipi di B. bruxellensis saranno isolati mediante tecniche tradizionali, da campioni di vini pugliesi durante le diverse fasi del processo di vinificazione, con particolare riguardo alle fasi successive alla fine della fermentazione alcolica. Verranno messe a punto metodologie analitiche per l identificazione e la quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino, impiegando tecnologie avanzate di tipo molecolare, in particolare real-time PCR (qpcr) accoppiata all analisi High-Resolution Melting (HRM) curve, tecniche in grado di realizzare una quantificazione assoluta del lievito e di fornire, al contempo, un indicazione qualitativa sulla biodiversità all interno della specie stessa. In questo modo si svilupperanno le basi metodologiche necessarie per una rigorosa analisi scientifica delle dinamiche microbiche previste nel progetto di ricerca. In una prima fase sarà sviluppato un test per la quantificazione sensibile, selettiva e rapida di B. bruxellensis basato sulla tecnologia real-time PCR, diviso in due semplici passaggi, l'estrazione del DNA seguita dalla individuazione e la quantificazione del lievito (real-time PCR) (gli attuali metodi di coltura microbiologia prevedono 7-14 giorni prima che i risultati siano disponibili, mentre i risultati con questo approccio sono disponibili il giorno stesso di analisi). Nella seconda fase si realizzerà un analisi di High Resolution Melting (HRM) curve, tecnica economica, semplice e sensibile per la detection di polimorfismi a singolo nucleotide presenti in sequenze nucleotidiche. In questo modo, utilizzando un opportuna sequenza target, sarà possibile genotipizzare gli isolati, ottenendo una misura della variazione genetica tra i membri della specie B. bruxellensis. Attività b - Applicazione di metodi cromatografici per la quantificazione degli acidi idrossicinnamici e dei corrispondenti vinil- ed etil-derivati in vino (RI). Relativamente alla problematica rappresentata da B. bruxellensis in vino, è prevista la messa a punto di metodiche cromatografiche per la determinazione degli acidi idrossicinnamici e dei loro vinil- ed etilderivati. Tale attività svilupperà, così, le basi metodologiche necessarie per una rigorosa analisi scientifica delle dinamiche molecolari previste nel progetto di ricerca. L analisi rappresenterebbe uno strumento importante per i controlli di azienda, in grado di fornire non solo dati sui composti chimici indesiderati, ma anche sui corrispondenti substrati, ottenendo così informazioni preziose per comprendere e prevedere le dinamiche in funzione dei dati microbiologici. Task Studio dell influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni aziendali sullo sviluppo di diversi ceppi di Brettanomyces bruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati (RI) Attività a - Allestimento di vinificazioni sperimentali con inoculo di B. bruxellensis autoctoni (RI) In questa attività sarà studiato il fenomeno di sviluppo di B. bruxellensis in vino e sulla conseguente produzione di etil-derivati in funzione dei parametri chimico-fisici caratteristici, tipici delle vinificazioni delle aziende coinvolte nel progetto (da vitigni autoctoni e secondo i disciplinari delle D.O.C. prodotte), allo 47

48 scopo di comprendere le dinamiche che determinano l insorgenza del problema. In particolare, nel corso di vinificazioni sperimentali con inoculo di B. bruxellensis autoctoni, saranno valutati, ad intervalli regolari, i principali parametri chimico-fisici della produzione, l identificazione e quantificazione di B. bruxellensis, e la quantificazione degli etil-derivati. Attività b - Identificazione e quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino mediante real time PCR (RI) L identificazione e la quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino saranno realizzati con la tecnica realtime PCR implementata nel Task Attività c - Quantificazione degli etil-derivati in vino mediante metodi cromatografici (RI) La quantificazione degli etil-derivati in vino sarà ottenuta mediante applicazione di metodi cromatografici implementati nell attività b. Tale sperimentazione sarà condotta per ciascuna D.O.C. prodotta, per ciascuna tipologia di vino realizzato da vitigni autoctoni, e con diversi ceppi di B. bruxellensis isolati da vini pugliesi. Il complesso dei dati ottenuti fornirà informazioni sull influenza dei principali parametri chimicofisici tecnologici posti in relazione con lo sviluppo di B. bruxellensis e con la produzione di etil-derivati, nelle reali condizioni di vinificazione aziendale, al fine di comprendere l influenza degli stressori tipici del vino sulla produzione di questi metaboliti secondari. Attività d - Studio del trascrittoma in vivo (direttamente nel sistema mosto-vino) di un ceppo B. bruxellensis isolato da vini pugliesi particolarmente resistente alle condizioni stressanti dell ambiente vino (RI) Con analisi di genomica funzionale, sarà studiato il complesso dei geni di B. bruxellensis trascritti direttamente in vino, al fine di realizzare una maggior comprensione delle basi molecolari riguardo i fenomeni investigati (sviluppo e sopravvivenza in vino, produzione di etil-derivati in vino). Per tale analisi trascrittomica saranno impiegate tecnologie di sequenziamento massivo parallelo o Next Generation Sequencing (NGS), tecnologie che consentono di produrre dati di sequenza nella misura di diversi Gbp. Queste tecnologie forniscono strumenti di indagine molto potenti che stanno rivoluzionando gli ambiti di indagine della genomica e della genomica funzionale. In particolare per quello che riguarda gli studi di espressione genica, le tecnologie NGS hanno permesso di sviluppare una metodica nota come RNA-seq grazie alla quale è possibile ottenere informazioni sull intero set di trascritti di una cellula. L RNA-seq si basa sul sequenziamento di tutti i trascritti in modo da produrre delle short reads (il sistema ILLUMINA produce reads lunghe fino a 150 basi) le quali vengono poi allineate su genomi o trascritti di riferimento, oppure allineate de novo con approcci di tipo bioinformatico. In questo modo è possibile produrre una mappa completa delle sequenze espresse. Grazie a questo approccio, la quantità e qualità delle informazioni che è possibile ottenere da un singolo esperimento è di gran lunga superiore a quelle fornite dai microarray. L RNA-seq infatti, consente di produrre un catalogo di tutti i trascritti espressi in una cellula in una particolare condizione fisiologica, permettendo di identificare anche nuovi trascritti. Oltre a ciò, è possibile determinare la struttura trascrizionale dei geni nelle diverse condizioni indagate. Task Studio di strategie di riduzione del rischio da Brettanomyces bruxellensis e definizione di un protocollo di prevenzione (RI) Attività a - Valutazione di differenti impieghi delle risorse microbiche (valutazione di differenti biotipi, colture starter single e multi-strain, inoculo scalare e coinoculi) per inibire e ridurre la sviluppo di B. bruxellensis in vino (RI) Sarà analizzata l efficacia di una differente gestione delle risorse microbiche nell inibizione dello sviluppo di B. bruxellensis in vino mediante applicazione di un approccio innovativo che valuterà l utilizzo i) di differenti biotipi di lieviti e batteri nella formulazione di colture starter per l innesco delle fermentazioni alcolica e malolattica, ii) di diverse formulazioni dello starter e iii) di differenti tempistiche di inoculo. Saranno, così, opportunamente moltiplicati in fermentatore 6 ceppi di lievito (3 ceppi commerciali e 3 autoctoni) e 6 ceppi di batterio (3 ceppi commerciali e 3 autoctoni). Nel corso di vinificazioni sperimentali con inoculo di B. bruxellensis, saranno testati i biotipi singolarmente e due formulazioni multi-strain (1 autoctoni, 1 commerciali). In tutti i casi saranno valutate le tempistiche di inoculo sequenziale e di coinoculo. Nel corso delle prove sarà monitorata l identificazione e quantificazione di B. bruxellensis, e la quantificazione degli acidi idrossicinnamici e dei corrispondenti vinil- ed etil-derivati. L identificazione e la 48

49 quantificazione rapida di B.bruxellensis in vino saranno realizzati con la tecnica real-time PCR implementata nell attività 1.1.1a. La quantificazione degli etil-derivati e dei rispettivi precursori in vino sarà ottenuta mediante applicazione di metodi cromatografici implementati nell attività 1.1.1b. Attività b - Studio della riduzione degli etil-derivati prodotti da B. bruxellensis in vino mediante impiego di scorze di lieviti (RI). Tale attività valuterà l efficacia delle pareti cellulari di lievito nella rimozione per adsorbimento degli etilfenoli dal vino. La concentrazione di etilfenoli può essere ridotta mediante osmosi inversa, polivinilpolipirrolidone o carboni adsorbenti. Lo svantaggio principale di questi metodi è che comportano anche una riduzione della concentrazione di composti aromatici e del colore dei vini rossi. L'utilizzo di scorze di lievito rappresenta un alternativa ecocompatibile per diminuire il contenuto di fenoli volatili nel vino. Infatti, le scorze di lievito sono state utilizzate in vino per rimuovere molecole indesiderate, come acidi ottanoico e decanoico. Esistono studi in cui la concentrazione di 4-etilfenolo è stata ridotta mediante utilizzo si scorze di lievito. Questa osservazione trova spiegazione in fenomeni di assorbimento dei fenoli volatili da parte dei lieviti. I siti di interazione tra molecole fenoliche e lieviti sono localizzati sulla parete del lievito, e sono caratteristiche ceppo-dipendenti. Per questa ragione, in questa attività progettuale, si valuterà l efficacia di scorze di lievito provenienti da diversi biotipi e/o in diverse miscelazioni. La quantificazione degli etilderivati in vino sarà ottenuta mediante applicazione di metodi cromatografici implementati nell attività b. Attività c - Definizione e test di un protocollo finale che permetta, sulla base delle reali variabili di cantina, la pianificazione e realizzazione di azioni per ridurre le perdite annue causate da B. bruxellensis (RI) Questa attività avrà funzione di sintesi delle attività relative ai Task e raccogliendo i risultati da esse ottenuti per l implementazione di un protocollo standardizzato di produzione. Il protocollo consentirà di minimizzare lo sviluppo del lievito contaminante e di ridurre la produzione e la presenza di etil-derivati in vino. Tale approccio permetterà di affrontare radicalmente il problema agendo a livello dei tre punti critici della problematica in esame: i) inibizione dello sviluppo di B. bruxellensis in vino, ii) inibizione della produzione di etil-derivati da esso prodotti, iii) diminuzione degli etilfenoli prodotti presenti nel vino. Il protocollo sarà testato nel corso di vinificazioni sperimentali con e senza inoculo di B. bruxellensis, secondo i disciplinari delle D.O.C. prodotte dalle aziende vinicole coinvolte nel progetto, e saranno identificati e quantificati i B.bruxellensis e gli etil-derivati e loro precursori. L identificazione e la quantificazione rapida di B.bruxellensis in vino saranno realizzati con la tecnica real-time PCR implementata nell attività a. La quantificazione degli etil-derivati e dei relativi precursori in vino sarà ottenuta mediante applicazione di metodi cromatografici implementati nell attività b. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente I partner di ricerca mettono a servizio della ricerca industriale un esperienza decennale nello studio della microbiologia enologica, comprendente studio di lieviti enologici, batteri di interesse enologico, spoilage microbici, e dei problemi di sicurezza alimentare di origine microbica nel vino. Le strumentazioni a disposizione dei partner di ricerca, che saranno impiegati nelle attività progettuali, sono: cappa chimica, cappa microbiologica, centrifughe, ultracentrifuga, termostati, liofilizzatore, criotermostato, microscopi ottici a contrasto di fase, invertiti, ad epifluorescenza, microscopio confocale a 3 laser, spettrofotometri, microplate readers, termociclatori PCR, termociclatori Real Time PCR, apparati elettroforetici per acidi nucleici, transluminatore, sequenziatore per acidi nucleici, apparati elettroforetici per proteine, VersaDoc Gel Imaging System, fermentatore da banco modulare, fermentatori per cellule vegetali e microrganismi, microvinificatori, FPLC-HPLC UV/visibile e a fotodiodi, gascromatografo, gascromatografo a spettrometria di massa. In particolare, le strumentazioni di cui è previsto l acquisto nell ambito del progetto sono: Università degli Studi di Foggia, Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex DiSA): fermentatore da banco modulare, microvinificatori, congelatore -80. Si farà riferimento al prestatore di servizi Centro di ricerca per la genomica e la postgenomica animale e vegetale (Fiorenzuola d Arda PC) - Centro interdipartimentale che possiede le conoscenze e la 49

50 strumentazione necessaria per il sequenziamento genico massivo parallelo o Next Generation Sequencing (NGS) e per le analisi High Resolution Melting (HRM). - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a: Università degli Studi di Foggia, Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex DiSA) Attività b: ISPA-CNR Lecce Attività a: Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA; ISPA-CNR Lecce Attività b: Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA; ISPA-CNR Lecce Attività c: Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA,; ISPA-CNR Lecce Attività d: Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA Attività a: Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA Attività b: ISPA-CNR Lecce Attività c: Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA; ISPA-CNR - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a Università degli Studi di Foggia, Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex DiSA): isolamento mediante tecniche colturali di ceppi autoctoni di B. bruxellensis in vini pugliesi e validazione della metodica molecolare per la identificazione, quantificazione e genotipizzazione rapida di B. bruxellensis in vino. ISPA-CNR Lecce: applicazione di metodi cromatografici per la quantificazione degli acidi idrossicinnamici e dei corrispondenti vinil- ed etil-derivati in vino. Attività a-c ISPA-CNR Lecce: Studio dell influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni delle aziende Cantele e sullo sviluppo di diversi ceppi di B. bruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati. Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA: Studio dell influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni dell azienda Cantine d Alfonso del Sordo srl sullo sviluppo di diversi ceppi di B. bruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati (prove cromatografiche realizzate dal ISPA-CNR). Attività d Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA: Studio del trascrittoma in vivo (direttamente nel sistema mosto-vino) di un ceppo B. bruxellensis isolato da vini pugliesi e particolarmente resistente alle condizioni stressanti dell ambiente vino Attività a Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA: Valutazione di differenti impieghi delle risorse microbiche (valutazione di differenti biotipi, colture starter single e multi-strain, inoculo scalare e coinoculi) per inibire e ridurre la sviluppo di B. bruxellensis in vino; prove real time PCR; ISPA-CNR Lecce: Valutazione di differenti impieghi delle risorse microbiche (valutazione di differenti biotipi, colture starter single e multi-strain, inoculo scalare e coinoculi) per inibire e ridurre la sviluppo di B. bruxellensis in vino; prove cromatografiche per la quantificazione analitica degli etil-derivati e dei relativi precursori. Attività b Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA: Studio di riduzione degli etil-derivati prodotti da B. bruxellensis in vino mediante impiego di scorze di lieviti. ISPA-CNR Lecce : prove cromatografiche per la quantificazione analitica degli etil-derivati. 50

51 Attività c Università degli Studi di Foggia, Ex DiSA: Definizione e test di un protocollo finale che permetta, sulla base delle reali variabili di cantina, la pianificazione e realizzazione di azioni per ridurre le perdite annue causate da B. bruxellensis; prove real time PCR. ISPA-CNR Lecce: Definizione e test di un protocollo finale che permetta, sulla base delle reali variabili di cantina, la pianificazione e realizzazione di azioni per ridurre le perdite annue causate da B. bruxellensis; prove cromatografiche per la quantificazione analitica degli etil-derivati e dei relativi precursori. OR 2 STRUMENTI DI CONTROLLO INNOVATIVI PER LA DETERMINAZIONE DI CONTAMINANTI IN UVA E VINO OS2.1: Messa a punto di metodiche di controllo per la selezione delle uve per la vinificazione e per la determinazione di ocratossina A in uva e vino Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: Università degli Studi di Foggia, Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex Dipartimento di Scienze Agro-Ambientali, Chimica e Difesa Vegetale DiSACD) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Sviluppo e validazione di una metodica analitica basata sulla tecnica MEPS per la determinazione dell'ocratossina A in uva e vino (RI, SS) Attività a - Ottimizzazione della procedura di estrazione/purificazione del campione (RI) Questa fase risulta essere particolarmente importante poiché una elevata percentuale di recupero degli analiti ed una buona riproducibilità della procedura sono fondamentali per l utilizzo della stessa e la sua eventuale validazione analitica. Inoltre, questa fase analitica è probabilmente quella che viene influenzata maggiormente dall abilità e dall esperienza degli operatori, soprattutto quando la fase di separazione cromatografica è altamente automatizzata. L utilizzo delle MEPS (Micro Extraction by Packed Sorbent) per l estrazione/purificazione del campione potrebbe rivelarsi vincente in termini di rapidità di analisi, utilizzo di solventi (la tecnica può considerarsi solvent-free) e semplicità di utilizzo, rendendola adatta e funzionale anche per un uso con operatori non particolarmente esperti. L ottimizzazione di questa tecnica, che è una fase cruciale dell intero processo e che deve tenere in debita considerazione i tempi complessivi di estrazione, le percentuali di recupero e le proprietà selettive, verrà effettuata tenendo conto di numerosi parametri, quali le fasi preliminari di predisposizione del campione (eventuali diluizioni, filtraggi, ecc.), i tempi di adsorbimento e desorbimento, le temperature di esercizio, la composizione del solvente di desorbimento e la dipendenza dalla forza ionica e dal ph dei campioni. Attività b - Ottimizzazione dei parametri per la separazione cromatografica (RI) La tecnica MEPS prevede l iniezione diretta dell estratto nella strumentazione cromatografica, semplificando ulteriormente la procedura analitica, ma ciò rende ancora più interdipendenti le due fasi analitiche. Infatti, a seconda delle capacità estrattive e di purificazione della MEPS, i cromatogrammi che si otterranno potranno essere più o meno ricchi di picchi e mostrare sensibilità più o meno elevate nei confronti dell OTA. Dipendentemente da questi risultati, quindi, verranno ottimizzate le condizioni cromatografiche, in particolare la scelta dei solventi e dei gradienti di eluizione. Da questi parametri dipenderà anche il tempo complessivo di analisi: bisognerà quindi trovare un compromesso tra la purezza del picco ed i tempi di analisi, poiché essi influenzano di conseguenza il costo complessivo dell analisi e la bontà del risultato analitico. Attività c - Validazione del metodo secondo la procedura di validazione del Regolamento (EC) No. 882/2004 (SS) Questa attività si rende assolutamente necessaria per permettere alla azienda, alla fine del progetto, di avere a disposizione uno strumento analitico affidabile e difficilmente contestabile per la valutazione della OTA nei campioni oggetto delle misure. Infatti, tutti i metodi ufficiali dovrebbero essere validati non solo in studi 51

52 collaborativi ma anche seguendo le linee guida della validazione per l ottenimento dei criteri minimi prestazionali così come definito nel recente Regolamento della Commissione Europea 401/2006/EC. I metodi analitici per il controllo degli alimenti dovrebbero anche sottostare alle indicazioni del Regolamento 882/2004/EC, mediante il quale vengono introdotti i controlli per la conformità con le leggi relative ai mangimi ed agli alimenti ed al benessere degli animali e dell uomo. La procedura di validazione, richiesta per fornire risultati accurati e riproducibili per i controlli intra- ed inter-laboratorio, così come descritto nella Decisione 2002/657/CE consta di tre attività di sviluppo sperimentale fondamentali, così riassumibili: valutazione della linearità del metodo, valutazione della sensibilità del metodo e valutazione precisione del metodo. Attraverso queste tre attività verranno valutate alcune caratteristiche prestazionali del metodo quali la selettività, la linearità, la precisione, l esattezza, il limite di decisione, il limite di capacità CC α, la robustezza, il limite di rivelabilità e di quantificazione ed il recupero percentuale, in accordo con il Regolamento 882/2004/EC e la UNI CEI EN ISO/IEC 17025, indicate dalla Commissione Europea come protocolli di accreditamento per i laboratori di test e di calibrazione. Task Sviluppo e validazione di una metodica analitica per la determinazione simultanea di glucosio e alcool nelle uve, basata sull'impiego di un biosensore doppio (RI, SS) Attività a - Sviluppo ed ottimizzazione del biosensore doppio (GOx ed AOx) per la quantificazione simultanea di glucosio ed alcool (RI) La preparazione del biosensore prevedrà l impiego di un doppio elettrodo di oro per la determinazione contestuale di glucosio ed alcoli. La prima fase consisterà nella attivazione delle superfici elettroniche e successiva deposizione elettrochimica del film polimerico anti-interferente. In una seconda fase sarà eseguita l immobilizzazione degli enzimi Glucosio ossidasi (GOx type VII da Aspergillus niger) ed Alcool ossidasi (Alcohol oxidase da Hansenula sp.) sulla superficie modificata dell elettrodo trasduttore. L ottimizzazione dei parametri, riguardanti il film elettrosintetizzato e la membrana intrappolante il biocomponente, sarà rivolta all ottenimento di una elevata sensibilità, all eliminazione delle interferenze di specie elettroattive o ad alto peso molecolare (che avvelenerebbero la superficie del trasduttore determinando perdita di risposta) ed al miglioramento della stabilità dei dispositivi durante la conservazione (shelf life). Il biosensore amperometrico doppio, sarà integrato in un sistema di analisi in flusso dotato di un rivelatore elettrochimico e di un campionatore a fibra da microdialisi. La valutazione delle prestazioni del biosensore doppio avverrà mediante la registrazione delle curve di calibrazione con standard di β-d(+)glucosio ed etanolo e l iniezione di possibili interferenti (acido ascorbico, solfiti, polifenoli, etc.) alle concentrazioni in cui tipicamente sono presenti nelle matrici reali, quali mosto e vino al fine di valutarne la selettività. Inoltre, saranno valutate le caratteristiche di riproducibilità nella preparazione del dispositivo. Attività b - Messa a punto del protocollo di analisi con biosensore doppio (RI) Questa attività verterà sullo studio della stabilità dei prototipi realizzati (biosensori per la determinazione rapida e simultanea di etanolo e di glucosio). Il biosensore sarà testato in condizioni operative (integrato in un sistema di analisi in flusso) mediante il monitoraggio in continuo (on-line) e discontinuo (at-line) di miscele standard e di campioni reali a concentrazione nota di glucosio ed etanolo, e sarà valutata la variazione di sensibilità di risposta nel tempo. Inoltre, sarà ottimizzata la sensibilità di risposta e la velocità di campionamento in funzione della velocità di flusso, mediante la registrazione di curve di calibrazione, ottenute analizzando soluzioni standard (almeno 6) a diversa concentrazione di glucosio ed etanolo, valutando la linearità di risposta ai singoli analiti. Attività c - Validazione del metodo di analisi con biosensore doppio (SS) Tale attività sarà sviluppata mediante la valutazione di parametri di prestazione, quali accuratezza e precisione delle misure in condizioni operative. Nella determinazione dell accuratezza saranno effettuate misure della concentrazione degli analiti in campioni reali forniti dall azienda (almeno 6 replicati di tre differenti livelli di concentrazione) mediante il biosensore ed i risultati saranno confrontati con quelli ottenuti mediante metodiche classiche riconosciute ufficialmente. Nella determinazione della precisione saranno eseguite delle analisi ripetute sia di soluzioni standard sia di campioni reali di uva, mosto e vino, e sarà valutata la deviazione standard relativa. 52

53 - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Il gruppo di ricerca ha una vocazione storica nello sviluppo e messa a punto di metodi analitici innovativi per il monitoraggio in campo alimentare sia dal punto di vista della sicurezza sia da quello della qualità. Le competenze scientifiche maturate riguardano le tecniche spettroscopiche (es. UV-Vis e fluorimetria) ed elettroanalitiche, l analisi in flusso (FIA), il campionamento con microdialisi e microestrazione in fase solida (SPME) e le tecniche HPLC. La ricerca è orientata al settore della sicurezza alimentare, con lo sviluppo di metodi per la determinazione di xenobiotici (analisi di micotossine, pesticidi, metalli pesanti, fitormoni, ammine biogene), e del monitoraggio della qualità, che prevede la tracciabilità ed il controllo di processo e di prodotto, anche con l ausilio di dispositivi analitici innovativi (biosensori). Essa ha prodotto risultati importanti che riguardano la realizzazione e caratterizzazione di biosensori amperometrici ad enzima immobilizzato in film polimerici elettrosintetizzati e loro applicazione, nonché lo sviluppo di metodi analitici innovativi per il monitoraggio di micotossine in derrate alimentari. Attrezzature funzionali alla ricerca già in dotazione del gruppo di ricerca: - Stazione elettrochimica, AUTOLAB Mod. PGSTAT 12, dotata di modulo "SCAN GEN" ed interfacciata con un sistema di acquisizione digitale (da utilizzare per lo studio, preparazione ed applicazione del biosensore). - Stazione elettrochimica portatile PALMSENS interfacciata ad un palmare microprocessore e ad un sistema miniaturizzato di analisi in flusso (piattaforma di analisi portatile da impiegare per le analisi in cantina con il biosensore). - Sistema di cromatografia liquida ad alta risoluzione Agilent serie 1100 con rivelatore spettrofluorimetrico e derivatizzatore fotochimico (Analisi cromatografiche quali-quantitative negli alimenti e campioni reali in generale). - Siringa analitica semiautomatica per l estrazione degli analiti tramite MEPS (Campionamento di liquidi da campioni reali, con possibilità di accoppiamento alle MEPS). - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Tutte le attività previste nell ambito dell OS2.1 saranno svolte presso i laboratori del Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex DiSACD) dell Università degli Studi di Foggia - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Il Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex DiSACD) dell Università degli Studi di Foggia sarà impegnato su tutte le attività dell Obiettivo Specifico. OS2.2: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni nel vino Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: ISPA-CNR) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Messa a punto di una metodica LC-MS(MS) per la determinazione simultanea di allergeni di latte e di uovo in vini chiarificati (RI, SS) Attività a - Messa a punto di un protocollo di estrazione/purificazione (RI) Sarà dapprima sviluppata una metodica di preparazione del campione basata su estrazione e purificazione della componente proteica d interesse. A tal fine saranno vagliate procedure di pretrattamento del campione 53

54 basate su sistemi di ultrafiltrazione con membrana di differenti tagli molecolari accoppiati a cromatografia ad esclusione dimensionale al fine di purificare e al tempo stesso preconcentrare la componente proteica presente nei campioni di vino. Le analisi qualitative per valutare la bontà della purificazione saranno condotte tramite elettroforesi monodimensionale in SDS PAGE. Sarà pertanto valutata la procedura più idonea in grado di preconcentrare il campione garantendo da un lato una buona resa di estrazione e dall altro l allontanamento di eventuali proteine interferenti presenti nel vino che non interessano ai fini dell analisi e che potrebbero inficiare la resa della successiva reazione enzimatica. Attività b - Ottimizzazione del protocollo di digestione enzimatica (RI) Tale ottimizzazione sarà eseguita per entrambe le classi di proteine investigate (di latte e di uovo) utilizzando un singolo o, qualora richiesto, una miscela di enzimi di digestione. Successivamente, laddove si rendesse necessario, si valuteranno opportune strategie di arricchimento della componente peptidica come, per esempio, l uso di biglie magnetiche opportunamente derivatizzate o di puntali con fase stazionaria depositata modificata con catene alchiliche. Attività c - Messa a punto di una metodica di separazione cromatografica ed analisi MS della miscela peptidica generata (RI) Per l analisi cromatografica si confronteranno colonne a diversa polarità in relazione al tipo e alla lunghezza dei peptidi generati al fine di ottenere la migliore efficienza di separazione della miscela peptidica generata. Saranno contestualmente identificati i peptidi marker per ciascuna proteina allergenica d interesse ed analizzati i suoi frammenti sperimentalmente ottenuti in modalità MS/MS che verranno poi confrontati con quelli attesi da esperimenti di simulazione di taglio enzimatico. Per l analisi di massa sarà esplorata la modalità in alta risoluzione e sarà investigata la sensibilità del metodo. Inoltre le analisi saranno eseguite sia in modalità full scan che in modalità all ion fragmentation (attivando la cella di collisione), in cui sono monitorati anche gli ioni frammento di ciascun peptide, e saranno confrontati i risultati di entrambe le modalità di acquisizione al fine di identificare la modalità in grado di fornire i risultati più accurati. Attività d - Analisi qualitativa dei peptidi generati e validazione in house del metodo sviluppato (SS) Seguirà un analisi qualitativa di tutti i peptidi generati dalla digestione e attribuibili a ciascuna proteina in esame utilizzando strumenti di bioinformatica e verranno calcolati gli indici specifici che definiscono la bontà dell identificazione quali ion score, protein coverage ecc. La lista dei potenziali peptidi marker sarà successivamente sottoposta ad una capillare ricerca nelle più grandi banche-dati del tipo Swiss-Prot e i risultati ottenuti saranno elaborati statisticamente al fine di identificare i peptidi statisticamente più significativi in grado di rappresentare la proteina allergenica d interesse. Una volta identificati i peptidi marker per ciascuna classe di proteine, si procederà alla loro validazione in house con il metodo sviluppato ed alla loro applicazione a campioni di vino prelevati dal commercio. Task Sviluppo di un immunosaggio basato su FP e/o LFD e/o SPR per la determinazione di allergeni di latte e uovo in vini chiarificati (RI, SS) Attività a - Sintesi ed isolamento di addotti e/o derivati fluorescenti degli allergeni e/o preparazione di biochip di oro modificati Le attività consisteranno in una prima fase di sintesi dei derivati fluorescenti (traccianti) di caseine di latte e di proteine di uovo da utilizzare per lo sviluppo dell immunosaggio FP e/o sintesi di addotti da impiegare per lo sviluppo di saggi immunocromatografici (LFD) e/o preparazione di chip di oro modificati con anticorpi selezionati per lo sviluppo di immunosaggi SPR. Per quanto concerne la sintesi dei traccianti ciascuna proteina sarà singolarmente marcata con opportune molecole fluorescenti (es. derivati della fluoresceina) e l identificazione e la caratterizzazione dei coniugati fluorescenti ottenuti verrà realizzata mediante tecnica di conferma LC-MS(MS) previa purificazione HPLC semi-preparativa. Riferitamente agli addotti da utilizzare nello sviluppo di saggi LFD verrà condotta la coniugazione delle proteine di interesse o dei relativi anticorpi specifici con oro-colloidale e valutata la relativa stabilità in soluzione. Alternativamente, per la preparazione del biosensore SPR verranno investigate procedure di immobilizzazione della proteina o dell anticorpo selezionato su un chip d oro opportunamente modificato tramite specifica reazione di derivatizzazione. A tal fine saranno investigate le condizioni sperimentali di preparazione del biochip per garantire una buona ripetibilità nella quantità di proteina o anticorpo immobilizzato. 54

55 Attività b - Sviluppo di un immunosaggio FP e/o saggio immunocromatografico (LFD o dipstick) e/o immunosaggio basato su tecnologia SPR per la determinazione di allergeni in soluzione Nella fase iniziale di questa attività saranno selezionate e testate, fra quelle disponibili sul mercato, varie classi di anticorpi policlonali, verso la classi di caseine e di proteine di uovo prescelte. Per quanto concerne lo sviluppo dell immunosaggio FP sarà condotto un saggio specifico in soluzione teso ad accertare l avvenuto riconoscimento fra la proteina modificata e lo specifico anticorpo e saranno ottimizzate le condizioni sperimentali (tipo di tampone, ph, tempi di incubazione, ecc) da utilizzare nel saggio. Seguirà la messa a punto di un metodo competitivo in soluzione e saranno valutate le performance analitiche dell immunosaggio sviluppato (sensibilità, intervallo di linearità, cross-reattività, ecc). Per quanto riguarda il saggio immunocromatografico (LFD) le attività riguarderanno una prima fase di immobilizzazione della proteina o dell anticorpo su un supporto solido utilizzando diversi approcci di tipo chimico e/o fisico. Seguirà la messa a punto del sistema immunocromatografico ottimizzando le migliori condizioni sperimentali per l analisi. Infine si procederà alla valutazione della performance analitiche utilizzando soluzioni standard delle proteine selezionate. Infine nell ambito dello sviluppo dell immunosaggio basato su tecnologia SPR sarà condotto uno studio in soluzione per valutare l interazione proteina-anticorpo e saranno ottimizzati tutti i parametri coinvolti nell interazione. In particolare si valuterà l effetto del tipo di tampone utilizzato in soluzione, del valore di ph finale e del tempo d incubazione al fine di massimizzare il segnale finale. Inoltre saranno investigate le più opportune modalità di rigenerazione del biosensore. Si procederà poi a valutare le performance analitiche dell immunosaggio sviluppato quali la sensibilità, il limite di rivelabilità e il range dinamico di linearità dell immunosaggio, utilizzando soluzioni standard delle proteine. Al fine di valutare fenomeni di cross reattività verso proteine omologhe sarà valutata la risposta del biosensore in presenza di tali proteine in soluzione. Attività c - Applicazione dell immunosaggio FP e/o saggio immunocromatografico (LFD o dipstick) e/o immunosaggio basato su tecnologia SPR sviluppato alla determinazione di allergeni in campioni vino Nell ambito di questa attività sarà messo a punto un protocollo di preparazione dei campioni di vino che risulti compatibile con lo specifico immunosaggio FP e/o saggio immunocromatografico (LFD o dipstick) e/o immunosaggio basato su tecnologia SPR previamente sviluppato in soluzione. Eventualmente si potrà procedere a tecniche di purificazione e/o preconcentrazione al fine di incrementare la sensibilità del saggio e/o di eliminare potenziali interferenti di matrice. Al fine di valutare la bontà della purificazione saranno condotte analisi qualitative tramite elettroforesi monodimensionale in SDS PAGE. Le metodiche sviluppate saranno poi sottoposte a validazione in house su campioni di vini chiarificati prelevati dal commercio. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente L ISPA-CNR vanta una significativa esperienza nel campo dell analisi di allergeni alimentari con particolare riferimento allo sviluppo di metodi di spettrometria di massa per la loro identificazione e determinazione. Per le attività mirate a sviluppare un metodo HPLC-MS/MS per la determinazione di marker di allergeni alimentari in campioni di vino ci si avvarrà in parte della strumentazione presente nei laboratori dell ISPA- CNR (cromatografo liquido accoppiato a spettrometro di massa a triplo quadrupolo) e sarà necessario l acquisto di uno spettrometro di massa ad alta risoluzione che consenta di accrescere la sensibilità e l accuratezza del metodo in via di sviluppo. La nuova strumentazione sarà utilizzata anche per altre attività nell ambito del progetto (attività a-e). In riferimento allo sviluppo di immunosaggi per la determinazione di allergeni in alimenti l ISPA-CNR si avvarrà dell esperienza maturata da parte del suo staff nella messa a punto di vari dispositive biosensoristici e utilizzando differenti tecniche di immobilizzazione di anticorpi. In particolare si farà uso di strumentazione già disponibile presso l ISPA-CNR quali uno rivelatore a risonanza plasmonica superficiale, un rivelatore basato sulla polarizzazione di fluorescenza oltre a diversi sistemi HPLC. Per l analisi qualitativa finalizzata in generale ad accertare la bontà della metodica di purificazione sviluppata, si utilizzerà un sistema elettroforetico monodimensionale già disponibile presso l ISPA-CNR. 55

56 - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Tutte le attività previste nell ambito dell OS 2.2 verranno svolte presso i laboratori dell ISPA-CNR di Bari. - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Tutte le attività previste nell ambito dell OS 2.2 verranno svolte dal soggetto partner ISPA-CNR. OS2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento. Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: Lab. Instruments; ISPA-CNR) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Studio di fattibilità, sviluppo di materiali di riferimento (RM) e loro certificabilità per l analisi multi residuale di fitofarmaci nella matrice vino mediante strumenti di controllo innovativi (RI, SS) Attività a Studio delle caratteristiche chimico-fisiche dei fitofarmaci individuati nella ISO EN (RI) Verranno redatte liste di almeno 500 fitofarmaci, individuati dalla Normativa Europea ISO EN Method for the analysis of pesticide residues in foods of plant origin, such as fruits (including dried fruits), vegetables, cereals and processed products thereof, comprendenti dati bibliografici e sperimentali delle caratteristiche chimico-fisiche. Verranno determinati sperimentalmente i rispettivi retention time (Rt), fattori di capacità (K ), Kovatz s index, in una ipotesi di metodica standard, ovvero a condizioni e parametri operative dei sistemi di misura (HPLC, GC, MS, MS/MS, etc) predeterminati (chained conditions). Verranno individuati gli ioni (parent and product) caratterizzanti l analita. Sarà calcolato un indice di suscettibilità alla frammentazione per EI ed HESI, rispettivamente in esperimenti d GC-MS e LC-MS/MS. ed ai limiti di rivelabilità LOD ed LOQ per ogni singolo fitofarmaco. Verrà infine determinata sperimentalmente la solubilità in matrice vino. Ai dati sperimentali saranno accorpati dati bibliografici relativi ai parametri chimico-fisici d interesse con particolare riferimento ai PM esatti, logp, MW, solubilità in solventi, caratterizzazione funzionale, etc. Attività b - Allestimento di soluzioni madri di singoli fitofarmaci (RI) I fitofarmaci saranno approvvigionati da produttori accreditati e sottoposti a controllo qualità mediante determinazioni del titolo di ognuna con tecnica di HPLC/DAD/FL e determinazione quali/ quantitativa delle impurezze con tecniche GC-MS ed LC-MS/MS. L allestimento di soluzioni madri dei singoli fitofarmaci verrà effettuata tramite metodi gravimetrici validati con l ausilio di bilance microanalitiche posizionate in ambiente protetto (glove box) in considerazione della tossicità intrinseca dei fitofarmaci. Verranno effettuate, con tecniche di rifrattometria e HPLC/RID, determinazioni riguardo le impurezze dei solventi utilizzati Attività c - Determinazione dei livelli di contaminazione dei fitofarmaci in matrici bianche di vino mediante metodiche analitiche validate (RI) Verranno studiate ed individuate aree vitivinicole di campionamento per la preparazione di matrici bianche vinicole possibilmente esenti completamente da fitofarmaci residui. Dette matrici saranno utilizzate, dopo determinazione, in house, mediante metodica validata ISO EN 17025, del tenore di fitofarmaci esistenti, come medium per l incorporazione dei fitofarmaci standard. 56

57 Sarà oggetto d indagine la stabilità intrinseca della matrice bianca rispetto a fitofarmaci rappresentativi di classi chimiche (es. carbammati, piretroidi, organo fosfati, organo clorurati, etc.) al fine di valutare l inerzia chimica della matrice nei confronti degli analiti. Le indagini analitiche verranno condotte stabilendo congrui intervalli temporali, in modo da valutare la stabilità e la shelf-life degli analiti nel medium. Attività d - Preparazione di materiale di riferimento in miscela ed in matrice (RI) ed allestimento di procedura metrologica conforme alla ISO/REMCO 2005 (RI) Verranno preparate miscele di materiale di riferimento in matrice vino mediante procedure gravimetriche a tracciabilità metrologica definita in accordo con la ISO/REMCO Le miscele conterranno fino a 100 fitofarmaci in matrice da sottoporre a studi di omogeneità e stabilità a medio e lungo termine. Saranno sottoposte a controllo qualità mediante analisi GC-MS/MS ed LC-MS/MS per la determinazione della concentrazione dei singoli componenti in matrice allegando la documentazione tecnica di laboratorio relativa alle proprietà misurate, agli indici d incertezza ed alla riferibilità e tracciabilità metrologica adottata. Attività e - Studi di stabilità ed omogeneità (RI) Saranno effettuati studi di stabilità nella matrice vino e parallelamente studi di omogeneità del mix al fine di evidenziare dimorfismi e variazioni nella concentrazione analitica di ciascun composto implicato nella composizione della miscela. Verranno allestite una serie di aliquote di soluzioni madre, soluzioni figlie, matrici bianche, da conservare in appositi congelatori, sulle quali effettuare nel tempo, le prove di stabilità, omogeneità, etc e determinare il tempo di scadenza o di potenziale utilizzo di dette soluzioni. Verranno altresì effettuate analisi periodiche per la determinazione della shelf life della matrice bianca di vino mediante prove rifrattometriche e di cromatografia liquida e gassosa accoppiata a spettrometria di massa. Attività f Creazione di sottoclassi di fitofarmaci fortificanti in matrici bianche. Studio dell interazione tra medium e soluzione di fitofarmaci e prove di stabilità della matrice fortificata (RI) I fitofarmaci d interesse previsti dalla ISO EN verranno divisi in sottoclassi sulle quali verranno condotti studi di compatibilità, stabilità nel medium al fine di evitare nel prodotto finito perdite di analita per: degradazione termica, foto-disattivazione, mutue interazioni, formazione di complessi a trasferimento di carica, possibili reazioni collaterali, reazioni crociate ed adsorbimento su superfici (vials). In accordo con la normativa SANCO/10684/2009, verrà valutata la migliore tecnica di spettrometria di massa tandem (GC-MS o LC-MS) a bassa oppure alta risoluzione (GC-HRMS ed LC-HRMS) per il riconoscimento di ognuno dei fitofarmaci. Verrà, inoltre, determinato il residuo minimo rilevabile e studiate le condizioni operative per una migliore risposta strumentale di ogni singolo analita con le diverse tecniche di spettrometria di massa. Nell ambito di questa attività verranno considerati i fitofarmaci individuati dalla ISO EN ed in particolare i seguenti statisticamente più rappresentativi nel vino: dimetomorf, pirimetanil, fenexamide, iprovalicarb, metalaxil, ciprodimil, fludioxonil, benalaxil, boscalid, clorpirifos-ethyl, folpet. Verranno studiate le interferenze dovute alla presenza dei componenti della matrice (vino) e valutati i limiti delle tecniche suddette nell analisi multi residuale di fitofarmaci. Saranno effettuate studi d interazione tra medium e soluzione di analiti e prove inerenti i limiti di quantificazione degli analiti in matrice (LOQs) al fine di quantificare il rapporto segnale-rumore della matrice stessa e le eventuali interazioni matrice-analita. Attività g -Analisi di certificabilità delle materie di riferimento in miscela ed in matrice vino (SS) Al fine della determinazione della certificabilità delle materie di riferimento, saranno messe in atto procedure di produzione dei CMR, in accordo con le ISO Guide 34 General requirements for the competence of reference materials procedures, ISO Guide 31 Contents of certificates and labels ed ISO Guide 35 General and statistical principles for certification ed ILAC G9 e G12, integrandole con il manuale di qualità di sistema aziendale ISO EN Sarà individuato il confezionamento più idoneo ai fini della stabilità e conservabilità delle miscele di CRM. Saranno realizzate procedure di laboratorio prove di controllo qualità, conformi alla ISO EN 17025, integrandole con il manuale di qualità di sistema aziendale ISO EN Verranno allestiti, organizzati e condotte prove valutative interlaboratorio in conformità ai requisiti della ISO/IEC Conformity assessment - General requirments for proficiency testing, sui CRM prodotti al fine della certificabilità. 57

58 Task Sviluppo e validazione di metodiche multiresiduali in alta risoluzione (LC-HRMS) per la determinazione di fitofarmaci untargeted nel vino (RI, SS) Attività a - Sviluppo e confronto di metodiche di rivelazione basate sull uso di spettrometri di massa a triplo quadrupolo e spettrometri ad alta risoluzione (RI) Sarà sviluppata una nuova metodica untargeted che utilizzi tecniche quali U-HPLC tandem accoppiate con uno spettrometro ad alta risoluzione a tecnologia Orbitrap in grado di utilizzare la massa accurata per il rapido riconoscimento di tutti i fitofarmaci presenti nel campione sottoposto a controllo. I risultati ottenuto saranno posti a confronto con quelli ottenuto con metodica tradizionale (targeted analisys) basata sull uso di tripli quadrupoli (UPLC-QqQ) Saranno effettuate estrazione e purificazione, da matrici fortificate di vino, in conformità alla ISO EN ed alla SANCO/10684/2009. Attività b - Validazione intra-laboratorio delle metodiche sviluppate (SS) La validazione intra-laboratorio delle metodiche sviluppate verrà effettuata mediante analisi di materiali di riferimento (realizzati in house e preparati come descritto nelle attività relative ai Task e 5.1.1) e CRM e di altri forniti da produttori f accreditati ed inseriti nel data base internazionale COMAR. Saranno individuati laboratori pubblici e privati accreditati ISO EN per la prova di screening di residui di fitofarmaci nella matrice vino. Sarà istituito un sistema di conduzione di prove valutative inter-laboratorio in conformità ai requisiti della ISO/IEC (Proficiency testing). Saranno allestite aliquote delle miscele di fitofarmaci (CMR) ai fini dell istituzione di un confronto interlaboratorio tra tecniche innovative di spettrometria di massa ad alta risoluzione (HR-Orbitrap) e tecniche di spettrometria di massa convenzionali generalmente in uso (QqQ). Sarà prodotto un confronto statistico, in conformità alla ISO 13528:2005 Statistical method for use in proficiency testing by interlaboratory comparison dei dati analitici ottenuti dai vari laboratori selezionati ed accreditati ISO Attività c - Certificazione del materiale di riferimento in miscela (SS) Lo studio di certificabilità del materiale di riferimento contenente fino a 500 fitofarmaci in miscele sarà realizzato a partire da materiali di riferimento a tracciabilità nota secondo le seguenti modalità: - definizione dell organigramma, dei ruoli e delle responsabilità; - implementazione nel manuale di sistema qualità del nuovo ciclo di lavorazione, comprendente le procedure e le istruzioni operative secondo ISO EN 9000/14000, ISO EN ed ISO EN del nuovo prodotto finito; - approntamento della documentazione relativa all approvvigionamento, da produttori accreditati (Eurachem), delle materie prime (fitofarmaci) a tracciabilità nota; - approntamento della documentazione relativa al controllo qualità dei lotti di materie prime (fitofarmaci) in ingresso mediante strumentazione analitica (GC-MS/MS e LC-MS/MS ed ad alta risoluzione) validata; - approntamento della documentazione relativa all avvenuto stoccaggio dei materiali in ingresso in appositi frigo-congelatori dotati di termometri/data logger certificati SIT; - approntamento della documentazione relativa all approvvigionamento da produttori certificati ISO EN 9000 delle materie prime in ingresso (solventi organici ad elevato grado di purezza, ultrapure e picopure); - approntamento della documentazione relativa al controllo qualità sulle materie prime in ingresso (solventi organici ultrapuri e sostanze chimiche pure per l allestimento delle matrici) mediante strumentazione analitica (picnometro, rifrattometro, bilancia microanalitica, GC-MS/MS ed LC- MS/MS) validata possibilmente da centro SIT; - individuazione delle grandezze oggetto di accreditamento e dei campi di taratura e relativo addestramento del personale. Conseguente scrittura e aggiornamento delle procedure tecniche di taratura, gestione apparecchiature, movimentazione in campo delle stesse, definizione delle procedure statistiche, razionalizzazione della assistenza operativa nella applicazione e revisione delle procedure di taratura definitive. - definizione, implementazione e verifica del sistema di gestione conforme alle norme di riferimento. 58

59 - approntamento della documentazione relativa all avvenuto stoccaggio dei materiali in ingresso (solventi organici ultrapuri e sostanze chimiche pure per l allestimento delle matrici) in appositi armadi di sicurezza refrigerati e dotati di termometri/data logger certificati SIT; - approntamento della documentazione probante l avvenuto studio di compatibilità dei composti presenti nello standard mix di fitofarmaci realizzato; - approntamento della documentazione probante l avvenuto studio sulla selezione della matrice; - approntamento della documentazione probante l avvenuto studio di stabilità dello standard mix di fitofarmaci realizzato; - approntamento della documentazione probante l avvenuto studio ed approvvigionamento dei contenitori secondari (vials certificati) conformi alle specifiche d inerzia chimica; - attivazione del sistema di qualità per la gestione delle prove interlaboratorio (proficiency test) necessarie per la certificazione di prodotto (standard mix); - allestimento della documentazione probante lo studio e il calcolo statistico dei risultanti ottenuti dalle prove interlaboratorio (proficiency test); - allestimento della documentazione da allegare al prodotto (standard mix di fitofarmaci) attestante le analisi di QC effettuate, la riferibilità dei dati, l indice d incertezza e tutti gli advice (REACH, etc.) relativi alla gestione del rischio inerente l utilizzo del prodotto finito; - raccolta dei report dei laboratori coinvolti nei proficiency tests, come di prassi nella gestione della qualità, al fine di valutare, con obiettività e criticismo, i possibili miglioramenti; - raccolta dei report delle varie fasi del processo di lavorazione; - approntamento della richiesta di audit all ente certificatore. Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Sono disponibili in azienda informazioni relative ai parametri chimico-fisici di circa 200 fitofarmaci, ed in particolare la solubilità nei più comuni solventi utilizzati in campo analitico (GC-MS ed LC-MS)e relative interazioni. Sono altresì disponibili metodiche di analisi multi componente con tecniche GC-MS ed LC- MS/MS. Per lo svolgimento delle suddette attività, la Lab. Instruments srl coinvolgerà i seguenti laboratori siti nel proprio stabilimento: laboratori preparativi con linee di preparazione, laboratorio controllo qualità linea di confezionamento e linea di conservazione operanti secondo le ISO EN 9000, ISO EN 14000, ISO Guide 30:1992/2008, 31:200, 34:2006, 35:2006 ed ILAC G13:2000 e laboratori di controllo qualità materie prime in ingresso e prodotti finiti operanti secondo UNI CEI EN IS/IEC e Proficiency testing (Guide ISO/IEC 43-1 e 43-2). In detti laboratori sono disponibili le seguenti apparecchiature : n.2 GC-MS a singolo quadrupolo, n. 1 GC-MS/MS a trappola ionica, n. 1 GC-HRMS magnetico, n. 2 LC-MS/MS a trappola ionica, n. 2 LC-MS/MS a triplo quadrupolo, n. 1 LC-HRMS magnetica, n. 12 GC capillari con detectors FID, NPD, ECD, TCD, PID completi di campionatori automatici; n. 8 HPLC con detectors UV, DAD, spettrofluorimetri, Elettrochimico, Conduttimetrico, con auto campionatori; bilnacie microanalitiche, picnometri, rifrattometri, etc. ma si rende necessario l eventuale acquisizione di un GC-MS/MS a triplo quadrupolo con risoluzione migliore di 0,4 amu e di un LC-MS a trappola orbitale per la corretta valutazione della diversa risposta strumentale tra i diversi detectors di spettrometria di massa. Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a-g: Lab. Instruments s.r.l., Castellana Grotte (BA) Attività a-b: Lab. Instruments s.r.l., Castellana Grotte (BA); ISPA-CNR Bari Attività c: Lab. Instruments s.r.l., Castellana Grotte (BA) Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. 59

60 Attività a-g Lab. Instruments s.r.l.: preparazione dei materiali di riferimento, sviluppo, allestimento miscele, inclusione in matrici, controllo qualità. Attività a-b Lab. Instruments s.r.l.: sviluppo e validazione delle metodiche analitiche e realizzazione del sistema di qualità ed approntamento della documentazione relativa all intero processo ai fini della eventuale certificazione di prodotto e di processo; validazione delle metodiche e confronto tra le diverse tipologie analitiche nel campo della Spettrometria di Massa. ISPA-CNR Bari: validazione delle metodiche e confronto tra le diverse tipologie analitiche nel campo della Spettrometria di Massa (triplo quadrupolo e high resolution), con la collaborazione di personale della Lab. Instruments. Attività c Lab. Instruments s.r.l.: certificazione del materiale di riferimento (miscela). OR 3 STRUMENTI CORRETTIVI INNOVATIVI PER LA RIMOZIONE DI METABOLITI MICROBICI INDESIDERATI NEL VINO OS3.1: Messa a punto di un prototipo per la rimozione dell ocratossina A (OTA) nel vino mediante la tecnica del ripasso continuo su vinacce/buccette Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: ISPA CNR, Industrie Fracchiolla srl) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Reperimento di vinacce esenti da OTA e di partite di mosti/vini naturalmente contaminate da OTA (RI) Attività a - Individuazione di lotti di mosto/vino naturalmente contaminati da OTA (RI) Tre lotti di mosto/vino contaminati con OTA a concentrazioni tra 1 e 10 µg/l saranno identificati mediante analisi HPLC di campioni spia. La ricerca dei lotti contaminati da OTA sarà eseguita in cantina su partite sospette e/o vendemmiate dopo le piogge. In assenza di lotti contaminati naturalmente (in presenza cioè di condizioni meteo che sfavoriscono la crescita di Aspergillus carbonarius sulle uve e il conseguente accumulo di OTA nei mosti/vini) si procederà alla contaminazione artificiale dei mosti/vini con estratti colturali di A. carbonarius. Le colture in vitro di A. carbonarius saranno preparate in laboratorio a partire da isolati fungini con elevato potenziale tossigeno e prelevati dalla collezione dell ISPA. I lotti di mosto/vino contaminati da OTA saranno utilizzati per l esecuzione delle prove di ripasso/rimozione dell OTA. Le analisi HPLC per l OTA, l allestimento delle colture in vitro di A. carbonarius e la contaminazione a livelli target dei lotti di mosto/vino saranno eseguite dall ISPA-CNR. Attività b - Individuazione di lotti di vinacce esenti da contaminazione da OTA (RI) Le partite di vinacce esenti da contaminazione da OTA saranno identificate mediante l analisi HPLC di OTA di campioni spia. La ricerca delle partite esenti da OTA sarà eseguita in cantina. I campioni di vinacce saranno analizzate per l OTA con un metodo HPLC sviluppato presso l ISPA-CNR per questa particolare matrice. Le partite di vinacce esenti da OTA saranno utilizzate per le prove di stabilizzazione delle vinacce stesse, per le prove di ripasso/rimozione dell OTA e per le prove mirate ad aumentare la naturale attitudine delle vinacce di adsorbire l OTA. Attività c - Separazione delle componenti delle vinacce e verifica della loro efficacia nell adsorbire l OTA (RI) Le vinacce saranno sottoposte a separazione delle varie componenti (buccette, polpa, vinaccioli etc.) al fine di identificare il/i componenti che hanno la più elevata capacità di adsorbire l OTA. Le diverse frazioni ottenute saranno testate in laboratorio per classificare la loro capacità di adsorbire l OTA. Per la separazione delle buccette dai vinaccioli si prevede di acquistare un apparecchiatura dedicata. La ulteriore separazione dei componenti delle vinacce sarà eseguita nei laboratori dell ISPA-CNR. 60

61 Task Stabilizzazione delle vinacce (RI, SS) Attività a - Stabilizzazione delle vinacce a basse temperature e/o con solfitazione (RI) I campioni di vinacce e/o loro componenti saranno conservati fino a 30 giorni a basse temperature (-18 C, 5 C, 15 C, 20 C, 30 C) monitorando i parametri qualitativi e l eventuale sviluppo di contaminanti microbici (batteri, lieviti, funghi, ecc.). Analogamente campioni di vinacce saranno conservati a basse temperature con l aggiunta di piccole quantità di SO 2 (da 30 a 50 g/kg). I parametri qualitativi delle vinacce saranno monitorati in modo indiretto mediante la misura dei parametri qualitativi (acidità volatile, indice di colore, polifenoli totali, ph, ecc.) del mosto/vino ripassato sulle vinacce al termine del periodo di stabilizzazione. Per l analisi dei parametri qualitativi dei mosti/vini si utilizzerà una apparecchiatura disponibile commercialmente e da acquistare. La carica microbica sarà misurata utilizzando il parametro delle unità formanti colonie/g di vinaccia utilizzando substrati selettivi per l isolamento di lieviti, funghi e batteri. Attività b - Stabilizzazione delle vinacce in serbatoi sperimentali (SS) Le condizioni ottimali di conservazione delle vinacce, individuate con le attività descritte nell attività 6.1.2a, saranno sperimentate in serbatoi coibentati di piccole dimensioni appositamente progettati e costruiti dalle Industrie Fracchiolla. Questo studio di scale up è necessario per verificare l applicabilità delle condizioni scelte su serbatoi che, in dimensioni adeguate, dovrebbero poi essere utilizzati dalle cantine per conservare le vinacce incontaminate in attesa di essere utilizzate per detossificare mosti/vini. Saranno monitorati gli stessi parametri qualitativi e i contaminanti microbici descritti nell attività 3.1.2a. Le analisi per la misura dei parametri qualitativi e della carica microbica (attività a e b) saranno effettuate nei laboratori dell ISPA-CNR. Task Rimozione dell OTA dai mosti/vini mediante ripasso breve su vinacce o loro componenti esenti da OTA (RI, SS) Attività a - Prove di ripasso per la rimozione dell OTA (RI) Le prove di ripasso saranno effettuate sulle vinacce e loro componenti al fine di identificare la matrice con il migliore potere adsorbente l OTA. Le diverse prove di ripasso saranno condotte variando i parametri operativi (tempo di contatto mosto/vino-vinacce (statico e dinamico), rapporto tra vinacce e mosti/vini, incroci tra vinacce e mosti/vini diversi. La verifica dell efficacia del ripasso sulla rimozione dell OTA sarà eseguita monitorando le concentrazioni di OTA nei mosti/vini prima e dopo il ripasso su vinacce. Una volta ottimizzate le condizioni del ripasso saranno misurati i principali parametri qualitativi e sensoriali dei mosti/vini prima e dopo il ripasso. Attività b - Valutazione dei risultati e formulazione dei protocolli (SS) I risultati delle attività a-b e a saranno elaborati e valutati al fine di produrre protocolli per a) la stabilizzazione delle vinacce o loro componenti, b) le condizioni sperimentali per il ripasso breve dei mosti/vini contaminati da OTA, c) la gestione complessiva del processo di rimozione dell OTA finalizzata allo sviluppo di un prototipo per l esecuzione dell intero processo in automatico. La verifica sulle qualità organolettiche dei vini ripassati sarà eseguita anche mediante panel test. Task Sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo su vinacce e/o loro componenti (RI, SS) Attività a - Progettazione dell impianto prototipo (RI) I risultati ottenuti sulle condizioni ottimali di stabilizzazione delle vinacce e di ripasso per la rimozione dell OTA saranno utilizzati per la progettazione di un impianto prototipale costituito da: serbatoio per la stabilizzazione e conservazione delle vinacce; impianto per il ripasso in continuo su vinacce dei mosti/vini contaminati. Il serbatoio sarà completo di valvola doppio effetto CO 2 /SO 2, sistema di immissione di CO 2 /SO 2, preleva campioni a lancia retrattile, quadro elettrico con timer e termoregolatore, valvola motorizzata e sonda PT100, termometro digitale, finecorsa di sicurezza. L impianto per il ripasso in continuo sarà costituito da più ambienti di ripasso in serie. Gli ambienti sono riempiti di vinacce incontaminate e successivamente viene immesso il mosto/vino che attraversa i vari ambienti cedendo l OTA alle vinacce. Il ricambio delle vinacce nei diversi ambienti avverrà in controcorrente rispetto al flusso del mosto/vino. In 61

62 particolare, dopo il primo ripasso la vinaccia del primo ambiente viene eliminata e sostituita da quella del secondo ambiente che a sua volta viene sostituita da quella del terzo ambiente e così via. Attività b - Costruzione dell impianto prototipo (SS) Per la costruzione del prototipo si sfrutteranno le informazioni ottenute dalle attività nell ambito dei Task 3.1.2, e delle attività a, e, almeno in parte, le conoscenze tecniche e meccaniche della famiglia di vinificatori orizzontali del tipo a cappello sommerso, prodotti di punta dell azienda Fracchiolla s.r.l., un macchinario tecnologicamente avanzato. Questi particolari vinificatori, con opportuni accorgimenti e modifiche, potranno essere impiegati per sperimentare efficacemente le potenzialità enologiche del ripasso per la rimozione dell OTA. Le attività nell ambito dei Task e sono strettamente legate all epoca della vendemmia e vinificazione delle uve, mentre i Task e sono solo in parte legate a questi periodi. L attività per la progettazione e la costruzione dei serbatoi sperimentali di piccole dimensioni (Task 3.1.2) può iniziare subito dopo l eventuale approvazione del progetto mentre la progettazione e la costruzione dell impianto prototipale (Task 3.1.4) inizierà nel secondo anno del progetto in seguito ai risultati ottenuti durante il primo anno di attività (Task e 3.1.3). - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Le apparecchiature (HPLC con rivelazione a fluorescenza, sistemi di estrazione in fase solida) per la determinazione di OTA e per la determinazione della carica microbica della vinaccia (cappe sterili, incubatori, microscopi) sono disponibili presso l ISPA-CNR. L ISPA-CNR dispone delle necessarie conoscenze e competenze tecnico-scientifiche sulla problematica specifica della contaminazione delle uve/vini da OTA (metodiche analitiche per la determinazione di OTA, tecniche e metodologie per l isolamento l identificazione e la caratterizzazione di microrganismi della filiera vitivinicola, metodi per la prevenzione della contaminazione da OTA e per la decontaminazione fisica e biologica di OTA e altre micotossine). Per la misura dei parametri qualitativi dei mosti/vini ripassati sulla vinaccia sarà necessario acquistare una apparecchiatura specifica del tipo Tekno prodotto da Chema Italia (analizzatore enologico sequenziale) per la determinazione di acido acetico (acidità volatile), acido citrico, acido d-lattico, acido d-gluconico, acido l- lattico, acido malico, acido piruvico, acido tartarico, aldeide acetica, antociani, azoto alfa-amminico, azoto ammoniacale, calcio, catechiene, cloruri, colore, ferro, glicerina, glucosio/fruttosio, magnesio, polifenoli totali, potassio, rame, solforosa libera e totale. Per la separazione dei vinaccioli dalle buccette sarà necessario acquistare una apparecchiatura specifica del tipo Svinacciolo prodotto da Cenedese Engineering. Per la costruzione del prototipo si sfrutteranno almeno in parte le conoscenze tecniche e meccaniche della famiglia di vinificatori orizzontali del tipo a cappello sommerso, prodotti di punta dell azienda Fracchiolla s.r.l., un macchinario tecnologicamente avanzato. Industrie Fracchiolla prevede, inoltre, l acquisto di smerigliatrici, taglio plasma e saldatrici TIG. Sarà necessaria una consulenza enologica (Dr. Perrone Michelangelo, enologo) per alcune delle attività di RI e SS. Inoltre i partner di progetto si avvarranno di una prestazione d opera da parte di una azienda produttrice di uva che fornirà i mosti/vini, le vinacce, lo spazio e le strutture necessarie per alloggiare i serbatoi sperimentali e l impianto prototipo e parteciperà alle prove (di stabilizzazione, di ripasso e di funzionamento del prototipo). - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a-c: ISPA-CNR Bari; Azienda Agricola prestatrice d opera Attività a-b: ISPA-CNR Bari; Industrie Fracchiolla srl; Azienda Agricola Attività a-b: ISPA-CNR Bari; Industrie Fracchiolla; Azienda Agricola Attività a-b: ISPA-CNR Bari; Industrie Fracchiolla srl; Azienda Agricola 62

63 - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a-c ISPA-CNR Bari: analisi di OTA nei campioni di mosti/vini e vinacce. Attività a-b ISPA-CNR Bari : coordinare le attività finalizzate all ottenimento dei mosti/vini, delle vinacce, della separazione della vinaccia nei suoi componenti; coordinare le prove di stabilizzazione delle vinacce e dei ripassi; raccolta dei campioni da analizzare e analisi dei parametri qualitativi del mosto/vino nei campioni prelevati prima e dopo il ripasso sulle vinacce o loro componenti. Consulente enologo: organizzare insieme ai ricercatori dell ISPA le prove identificando i parametri da considerare e valutando la qualità organolettica e sensoriale dei mosti/vini dopo il ripasso sulle vinacce stabilizzate. Industrie Fracchiolla: progettare e costruire 12 serbatoi sperimentali coibentati di piccole dimensioni Consulente enologo: collaborare nella progettazione dei serbatoi sperimentali di stabilizzazione delle vinacce, Attività a-b ISPA-CNR Bari: coordinamento ed esecuzione delle prove di ripasso e raccolta dei campioni di mosti/vini da analizzare; analisi dell OTA e dei parametri qualitativi dei mosti/vini prima e dopo il ripasso. Consulente enologo: seguire, durante le prove di ripasso per identificare un protocollo di ripasso in continuo, la fase della fermentazione vinaria, pianificare i parametri operativi e come variarli per ottimizzare al meglio il ripasso, partecipare alla valutazione della qualità finale del vino. Industrie Fracchiolla: assistenza tecnica nella gestione dei serbatoi sperimentali coibentati di piccole dimensioni e per le prove di ripasso dinamiche. Attività a-b Industrie Fracchiolla: progettazione e realizzazione dell impianto prototipale e assistenza tecnica per le prime prove di funzionamento. ISPA-CNR Bari: prove di funzionamento dell impianto prototipale. Consulente enologo: curare gli aspetti enologici per la progettazione dell impianto prototipale e partecipazione alle prove di funzionamento. OS3.2: Sviluppo di metodologie bio-molecolari per la decontaminazione/degradazione dell ocratossina A (OTA) nei mosti-vini Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: ISPA-CNR; IBBE-CNR) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Isolamento e caratterizzazione di popolazioni microbiche in grado di degradare l'ota (RI) Attività a - Individuazione dei campi e campionamento (RI) Si prevede di individuare dei vigneti rappresentativi dell areale di coltivazione delle varietà Negroamaro e/o Primitivo (cultivar notoriamente suscettibili alla contaminazione da OTA), 3 vigneti localizzati in zone ad alto rischio da OTA e 3 vigneti localizzati in zone esenti da rischio OTA. Per ciascun vigneto, alla vendemmia, saranno prelevati 2 campioni, ciascuno costituito da grappoli. La metà di questi campioni proverrà da grappoli inoculati artificialmente in campo con A. carbonarius, campioni sicuramente contaminati OTA, da confrontare/comparare con i campioni non inoculati provenienti sia da vigneti in zone a rischio OTA, sia da vigneti in zone esenti da rischio OTA. Questi campioni saranno successivamente micro vinificati e analizzati sia per il loro contenuto in OTA, sia mediante approccio metatrascrittomico. Per 63

64 ciascuna delle suddette tesi, si prevede di isolare la microflora nelle seguenti fasi: i) lavaggio degli acini; ii) mosto non fermentato; iii) mosto a media fermentazione alcolica; iv) mosto a fine fermentazione alcolica. Tutti i campioni prelevati saranno omogeneizzati e suddivisi in 3 sub-campioni destinati rispettivamente all analisi chimica, microbiologica e metatrascrittomica. Attività b - Analisi chimica (RI) Analisi chimica dei campioni per determinare la concentrazione di OTA sarà effettuata secondo le metodiche di estrazione e analisi HPLC utilizzando un protocollo messo a punto dall ISPA-CNR in precedenza. I risultati dell analisi del contenuto in ocratossina A nei diversi campioni e nelle diverse fasi della vinificazione saranno utili per l individuazione dei campioni più interessanti da sottoporre all analisi metatrascrittomica (attività a-c). Nel caso di risultati che evidenziano una riduzione del contenuto in OTA durante la fermentazione si effettueranno analisi supplementare per la ricerca dei prodotti di degradazione, principalmente ocratossina α (OT-α). Attività c - Analisi microbiologica (RI) Le popolazioni microbiche presenti nei campioni di UVA/mosto selezionati sulla base dell attività 3.2.1b saranno accresciute su terreni liquidi selettivi rispettivamente per lieviti (SABORAUD addizionati con ampicillina), batteri (PCB addizionato con cicloesimide) e funghi (DRBC, DG18, DRYES, CREAD, PCNB), addizionati con OTA o preparati con OTA come unica fonte di carbonio. In ciascuna delle suddette tesi verrà verificata l eventuale degradazione della tossina ed in caso positivo, il microbiota associato verrà isolato su piastra ed i singoli isolati verranno caratterizzati per la loro eventuale capacità degradativa su substrati aventi ocratossina A come fonte primaria di carbonio. Gli isolati dotati di capacità detossificante verranno ulteriormente caratterizzati a livello enologico e tecnologico, valutando la suddetta capacità degradativa in mosto addizionato con OTA. Task Identificazione di geni codificanti gli enzimi correlati alla degradazione di OTA in isolati microbici naturali (RI) Attività a - Messa a punto di metodiche estrazione di DNA e RNA dai campioni di mosto (RI) Dai campioni considerati selezionati per l analisi metatrascrittomica sarà estratto DNA genomico e RNA totale. Nell ambito delle attività saranno definite metodologie e tecniche per l estrazione di acidi nucleici dai campioni, successiva rimozione dell rrna ribosomale dall RNA totale con conseguente arricchimento della frazioni di mrna. A tal fine verranno considerate diverse metodiche (cattura di rrna tramite biglie magnetiche, arricchimento della frazione poliadenilata con oligo-dt, digestione di rrna). La frazione arricchita di mrna così ottenuta sarà convertita in cdna che sarà poi sottoposto a sequenziamento direzionale in modo da ottenere le sequenze nucleotidiche corrispondenti agli RNA di partenza. Attività b - Sequenziamento massivo del cdna (RI) Si prevede di effettuare un analisi bioinformatica delle sequenze disponibili di geni con documentata capacità di degradazione dell OTA allo scopo di identificare strumenti molecolari (primer specifici) per l'amplificazione selettiva dei suddetti geni bersaglio mediante saggi RT-PCR. I geni amplificati costituiranno una collezione genica specifica che sarà analizzata mediante sequenziamento massivo. Il sequenziamento massivo delle cdna ottenuto verrà condotto mediante l utilizzo di tecnologie di Next Generation Sequencing (Roche/454, Illumina SOLEXA; oppure ABI s SOLid) che permettono il sequenziamento diretto del cdna senza la necessità del clonaggio. Un ulteriore vantaggio è rappresentato dall alto numero di reads ottenibile in un unica corsa su queste nuove piattaforme di sequenziamento e il conseguente abbassamento del costo per base sequenziata. Verranno ottimizzate le strategie di sequenziamento con l obiettivo di ottenere la massima resa di prodotto mediante l utilizzo di tecnologie e metodologie innovative e che possono rappresentare in futuro delle metodologie di riferimento nel settore. Attività c - Analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento (RI) Quest attività è rappresentata dall analisi bioinformatica dei dati prodotti nell ambito delle attività a-b e mediante l applicazione di un idoneo workflow di analisi bioinformatica, da sviluppare e mettere a punto nell ambito del progetto, in grado di filtrare i dati di sequenza prodotti in base a parametri di qualità e poi sottoporli ad una serie di analisi bioinformatiche per ottenere informazioni sulla composizione del profilo trascrittomico delle comunità microbiche presenti nei campioni ambientali considerati nello studio. Inoltre si 64

65 prevede di sviluppare un workflow bioinformatico innovativo per a) l analisi comparativa dei metatrascrittomi dei campioni considerati, b) successiva annotazione funzionale delle sequenze di cdna e c) conseguente predizione del grado della struttura e dell attività enzimatica delle proteine espresse dalla comunità microbica dei campioni analizzati. Particolare attenzione verrà posta a quelle attività enzimatiche coinvolte nelle fermentazioni in cui vi è stato una significativa degradazione di OTA. Il software bioinformatico prodotto potrà essere successivamente utilizzato in altri contesti applicativi. Inoltre, si verificherà la presenza dei geni codificanti gli enzimi presubilmente correlati alla degradazione dell OTA negli isolati microbici naturali selezionati (attività c). Task Espressione dei geni identificati e valutazione dell'attività di degradazione di OTA (RI) Attività a - Espressione biotecnologica del gene/i identificati (RI) Almeno un gene (identificato nell ambito dell attività 3.2.2c) per ognuna delle classi di geni con documentata attività degradativa dell OTA verrà inserito in opportuno vettore plasmidico ed espresso in lievito (S. cerevisiae) e/o batterio (E.coli, Lactobacillus spp). Attività b - Selezione e uso biotecnologico degli enzimi identificati (RI) Gli enzimi che dall analisi comparata risulteranno potenzialmente coinvolti della degradazione dell OTA saranno selezionati e valutati per una eventuale capacità di degradazione dell OTA in vitro e durante il processo fermentativo. La selezione e l utilizzo di tali enzimi verranno valutati anche tenendo in considerazione la disponibilità commerciale, i costi ed eventuali ricadute sulla qualità dei vini ottenuti. Inoltre si otterrà un ceppo/i di lievito o batterio ricombinante esprimenti il gene/i codificante l enzima selezionato che verrà valutato sia per la capacità di degradare l OTA sia per le proprietà enologiche. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente L ISPA dispone delle necessarie conoscenze e competenze tecnico-scientifiche sulla problematica specifica della contaminazione delle uve/vini da OTA (metodiche analitiche per la determinazione di OTA, tecniche e metodologie classiche e molecolari per l isolamento l identificazione e la caratterizzazione di microrganismi della filiera vitivinicola, metodi per la prevenzione della contaminazione da OTA e per la decontaminazione fisica e biologica di OTA e altre micotossine). Presso l ISPA è particolarmente rilevante l attività che comprende l isolamento, la collezione e lo studio della biodiversità microbica di specie di interesse agroalimentare e agroindustriale, utilizzando tecniche di identificazione morfo - tassonomica e molecolare e studi biochimici. La conservazione della biodiversità delle popolazioni microbiche di interesse agroalimentare garantisce il mantenimento di un importante patrimonio genetico originale di microrganismi non variati da cause artificiali e la disponibilità di biorisorse importanti per le numerose applicazioni di tipo bio-tecnologico. A tale riguardo presso l ISPA è stata costituita una collezione di circa esemplari (Collezione ITEM) microbici associati alla produzione di più di un centinaio di diversi metaboliti dotati di diversa attività biologica. E disponibile un catalogo della collezione anche su internet al sito La collezione è stata riconosciuta da organizzazioni internazionali quali ECCO (Organizzazione Europea delle Collezioni di Colture Cellulari) e WFCC (Federazione Mondiale delle Collezioni di Colture Cellulari). Inoltre verranno condivise dai partner di ricerca ISPA le importanti esperienze accumulate nel tempo in materia di estrazione di acidi nucleici da matrici complesse quali cereali, uva e terreno. Nei laboratori dell ISPA sono disponibili strumentazioni per la determinazione della carica microbica della vinaccia (cappe sterili, incubatori, microscopi), per la caratterizzazione bio-molecolare dei ceppi isolati (workstation per estrazione DNA, Sequenziatore Automatico ABI Prism 3100, sistemi di Real- Time PCR, etc.) per la determinazione di OTA (HPLC con rivelazione a fluorescenza, sistemi di estrazione in fase solida). Le analisi di trascrittomica verranno condotte su una piattaforma di sequenziamento di terza generazione (Next Generation Sequencing) che si prevede di acquistare nell ambito del progetto. L IBBE CNR, al fine di eseguire l attività c, prevede di acquistare 2 sistemi di storage di tipo DAS da 24TB cadauno. 65

66 - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a: ISPA-CNR Lecce; ISPA-CNR Bari Attività b: ISPA-CNR Bari Attività c: ISPA-CNR Bari; ISPA-CNR Lecce Attività a: ISPA-CNR Lecce Attività b: ISPA-CNR Bari Attività c: IBBE-CNR Bari; ISPA-CNR Bari Attività a-b: ISPA-CNR Lecce - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a - ISPA-CNR Bari e Lecce. Individuazione dei vigneti rappresentativi e campionamento delle uve. Attività di micro vinificazione e campionamento dei mosti. Attività b - ISPA-CNR Bari. Applicazione delle metodiche di estrazione ed analisi HPLC per determinare la concentrazione di ocratossina nei diversi campioni. Attività c - ISPA-CNR Bari e Lecce. Selezione e valutazione delle popolazioni microbiche per la loro capacità degradativa nei confronti dell ocratossina. Attività a - ISPA-CNR Lecce. Messa a punto di metodologie e tecniche per l esrazione di acidi nucleici dai campioni, rimozione dell rrna con conseguente arricchimento dellla frazione di mrna, conversione inn cdna. Attività b - ISPA-CNR Bari. Identificazione di strumenti molecolari (primer specifici) per l'amplificazione selettiva dei geni con documentata capacità degradative mediante saggi RT-PCR per costituire una collezione genica specifica che verrà analizzata mediante deep sequencing. Attività c - IBBE-CNR Bari e ISPA-CNR Bari. Sviluppo di un idoneo workflow per l analisi bioinformatica dei dati prodotti in grado di fornire informazioni sulla qualità delle reads prodotte e sulla composizione del profilo trascrittomico delle comunità microbiche presenti nei campioni considerati. Attività a-b - ISPA-CNR Lecce. Valutazione dell attività degradativa dell OTA in vitro e durante il processo fermentativo degli enzimi identificati. Ottenimento dell isolato/i ricombinante/i esprimente il gene/i codificante l enzima selezionato. OR 4 STRUMENTI PREVENTIVI E CORRETTIVI INNOVATIVI PER LA RIDUZIONE DEL RISCHIO DI CONTAMINAZIONE DA MICRORGANISMI INDESIDERATI, MICOTOSSINE E INSETTI NEL FRUMENTO. OS4.1: Messa a punto di metodiche per il trattamento di cariossidi di frumento con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata per prevenire la contaminazione da microrganismi indesiderati e l'infestazione da insetti Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: ISPA-CNR; CDP s.r.l.) 66

67 - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Uso di ozono per prevenire lo sviluppo di insetti, batteri alterativi, funghi tossigeni e loro metaboliti tossici (RI) Attività a - Ottimizzazione dei parametri sperimentali con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata (RI) Verrà utilizzato un generatore di ozono gassoso ed uno di acqua ozonizzata per l ottimizzazione dei parametri sperimentali (tempi di contatto, concentrazioni di ozono, temperatura di trattamento) al fine di ottenere un efficace riduzione dell infestazione da insetti (Tignole, Sitophilus granarius, Trogoderma granarium, Tribolium confusum, Rhyzopertha dominica) e contaminazione da funghi tossigeni (Fusarium e Aspergillus), batteri alterativi (Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, B. licheniformis) e micotossine (deossinivalenolo, ocratossina A, tossine T-2 e HT-2) senza alterare la qualità del frumento e delle farine. Verrà determinata la mortalità degli insetti e la riduzione della carica microbica e dei livelli di micotossine. Attività b - Valutazione dell'effetto del trattamento con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata sulla qualità delle cariossidi (RI) Verranno valutati i seguenti parametri: colore, odore, acidi grassi, trigliceridi, proteine, zuccheri, vitamine prima e dopo i due differenti trattamenti con ozono e dopo il trattamento in serie. Attività c - Definizione della migliore tecnologia e del miglior processo (RI) In base ai risultati delle attività precedenti si individuerà una best practice che detterà le linee per la progettazione del prototipo e per il suo corretto utilizzo mediante la stesura di un protocollo tecnico. Task Progettazione e realizzazione del generatore di ozono gassoso e/o acqua ozonizzata (RI, SS) Attività a - Progettazione del prototipo (RI) In base ai risultati delle attività svolte nel Task verrà progettato un prototipo per l impiego di ozono gassoso o acqua ozonizzata o che utilizzi entrambi i tipi di trattamenti. Durante la fase di progettazione del prototipo verrà posta particolare attenzione ai seguenti aspetti: - progettazione del sistema di miscelazione del prodotto in modo da consentire all ozono di entrare in contatto con tutta la massa da trattare; - progettazione di sistemi di sicurezza interfacciati con il generatore in modo da bloccare la generazione di ozono nel caso in cui la concentrazione di ozono nell ambiente di lavoro superi i livelli previsti dalle normative vigenti; - progettazione di sistemi di abbattimento dell ozono in modo da evitare l emissione di ozono nell ambiente; - progettazione di un interfaccia tra i sistemi di misura della concentrazione di ozono in acqua e il generatore in modo da tenere costanti le concentrazioni di ozono desiderate in acqua. Attività b - Realizzazione del prototipo (SS) Verrà realizzato un prototipo su scala semi-industriale in grado di generare ozono gassoso e/o acqua da testare presso l Azienda C.D.P. Il prototipo di impianto ad ozono sarà dimensionato in relazione alla cubatura delle cariossidi di frumento che l Azienda intende sottoporre al trattamento. In merito al trattamento con ozono delle acque utilizzate nella fase di condizionamento delle granaglie da sottoporre a molitura, il dimensionamento del prototipo sarà effettuato in base alla qualità dell acqua (durezza, ph, presenza di ammoniaca, ecc.) e alla portata necessaria. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente L ISPA-CNR ha notevole esperienza nelle analisi di micotossine, funghi tossigeni e batteri alterativi. Si avvarrà di un consulente per le analisi degli insetti. Per lo svolgimento delle attività l ISPA dispone di laboratori attrezzati per le analisi chimiche e microbiologiche nei prodotti agroalimentari. Tra le principali strumentazioni disponibili per le attività, compatibili con gli impegni richiesti dal progetto proposto e dagli 67

68 altri in contemporaneo svolgimento, si possono elencare: sistemi per cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC e UPLC), cromatografo liquido-spettrometro di massa (LC-MS), spettrometro FT-NIR, sequenziatori di DNA e sistemi di sequenziamento PCR. L ISPA-CNR prevede di acquistare componenti e attrezzature per la realizzazione del prototipo di generatore di ozono per svolgere le prove sperimentali per prevenire la contaminazione da microrganismi indesiderati e l'infestazione da insetti nel frumento, che verrà utilizzato, dopo opportuna implementazione, per svolgere le prove sperimentali presso l azienda. - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a: ISPA-CNR Bari; Attività b: ISPA-CNR Bari; C.D.P. Altamura (BA) Attività c: ISPA-CNR Bari; C.D.P. Altamura (BA) Attività a: M.G. di Narducci Lucia Capurso (BA) - Consulente Attività b: C.D.P Altamura (BA) - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a - ISPA-CNR Bari: ottimizzazione dei parametri sperimentali - M.G. di Narducci Lucia: analisi degli insetti Attività b - ISPA-CNR Bari: analisi parametri di qualità - C.D.P.: analisi parametri di qualità Attività c - ISPA-CNR Bari: definizione best practices - C.D.P.: definizione best practices Attività a - ISPA-CNR Bari: attività di supporto al consulente M.G. di Narducci Lucia per la progettazione del prototipo. - C.D.P.: attività di supporto al consulente M.G. di Narducci Lucia per la progettazione del prototipo Attività b - ISPA-CNR Bari: acquisto componenti e attrezzature per il prototipo - C.D.P.: acquisto componenti e attrezzature per il prototipo - M.G. di Narducci Lucia: Realizzazione del prototipo OR 5 - STRUMENTI DI CONTROLLO INNOVATIVI PER LA DETERMINAZIONE DI CONTAMINANTI IN CEREALI E DERIVATI OS5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: ISPA-CNR; Lab. Instruments srl) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Individuazione delle sottoclassi di fitofarmaci, studio dell effetto matrice (frumento) sull analisi strumentale di fitofarmaci, di solubilità, stabilità ed allestimento delle aliquote da destinare al proficiency test (RI) 68

69 Attività a Individuazione delle sottoclassi di fitofarmaci, studio dell effetto matrice (frumento) sull analisi strumentale di fitofarmaci, di solubilità, stabilità ed interazioni tra medium e soluzione di fitofarmaci (RI) Tra i fitofarmaci d interesse previsti dalla ISO EN verranno individuati, mediante indagine bibliografica, tra i seguenti fitofarmaci: 2,4-D, Amidosulfuron, Dichlorprop-P, Fenoxaprop-P, Florasulam, Fluroxypyr, Glyphosate, Iodosulfuron Methyl Sodium, Mcpa, Mecoprop-P, Pendimethalin, Sulfosulfuron, Bentazone, Carfentrazone-Ethyl, Dicamba, Diflufenican, Flupyrsulfuron Methyl, Isoproturon, Metsulfuron, Propoxycarbazone, Thifensulfuron, Tribenuron, Azoxystrobin, Epoxiconazole, Fenpropidin, Fenpropimorph, Kresoxim-Methyl, Prochloraz, Propiconazole, Spiroxamine, Tebuconazole, Trifloxystrobin, Carbendazim, Carboxin, Chlorothalonil, Cyproconazole, Difenoconazole, Fludioxonil, Fluoxastrobin, Flutriafol, Guazatine, Mancozeb, Metconazole, Picoxystrobin, Prothioconazole, Pyraclostrobin, Triadimenol, Triticonazole, quelli statisticamente più utilizzati, più rilevati nella matrice frumento e rappresentativi delle diverse classi chimiche. Saranno quindi classificati in funzione di studi effettuati sulla compatibilità reciproca e stabilità nel medium frumento. Saranno effettuate studi e prove inerenti i limiti di quantificazione degli analiti in matrice (LOQs) al fine di quantificare il rapporto segnale-rumore della matrice stessa. Attività b - Allestimento di CRM in matrice frumento in aliquote da sottoporre ai partecipanti il proficiency test (RI) L approvvigionamento di CRM in matrice frumento a titolo noto sarà effettuato da produttori accreditati ed inseriti nel data base internazionale COMAR. Nell eventualità che i CRM in matrice frumento disponibili sul mercato non contenessero un adeguato e rappresentativo numero di analiti (inerenti la ricerca statistica effettuata), si provvederà alla fortificazione (spiked) con i fitofarmaci mancanti. Verranno allestite una serie di aliquote di miscele di fitofarmaci in matrice frumento (fortificata o non), da sottoporre ai partecipanti il proficiency test. Tali miscele saranno prima conservate in appositi congelatori e su esse saranno effettuare nel tempo: prove di stabilità, omogeneità, etc al fine di determinare il tempo di scadenza o di potenziale utilizzo di dette miscele. L allestimento di suddette miscele di fitofarmaci in matrice frumento permetterà l istituzione di una serie di analisi comparative che metteranno a confronto le tecniche tradizionali targeted d indagine (LC-QqQ) versus le innovative tecniche di spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS Orbitrap). Task Sviluppo e confronto di metodiche di rivelazione basate sull uso di spettrometri di massa ad alta risoluzione (HRMS: untargeted analisys) e spettrometri a triplo quadrupolo (QqQ: targeted analisys) (RI, SS) Attività a - Sviluppo e validazione di una metodica untargeted di analisi multi residuale di pesticidi in frumento basata sull utilizzo di spettrometri di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS Orbitrap) e confronto con metodica tradizionale con tecniche (LC-QqQ ). Il crescente sviluppo di apparecchiature nel campo della spettrometria di massa permette di sviluppare metodiche che soddisfino le suddette richieste. L alta sensibilità raggiungibile e la possibilità di effettuare uno screening su un elevato numero di analiti introduce nuovi aspetti diagnostici e predittivi nell analisi quali-quantitativa di routine in relazione alla gestione del rischio correlata alla individuazione di molecole nuove nella procedura analitica di controllo. Saranno effettuate estrazione e purificazione, da matrici frumento, in conformità alla ISO EN ed alla SANCO/10684/2009. Sarà sviluppata una nuova metodica untargeted che utilizzi tecniche quali U-HPLC accoppiata ad uno spettrometro ad alta risoluzione a tecnologia Orbitrap in grado di utilizzare la massa accurata per il rapido riconoscimento di tutti i fitofarmaci presenti nel campione sottoposto a controllo. I risultati ottenuto saranno posti a confronto con quelli ottenuto con metodica tradizionale (targeted analisys) basata sull uso di tripli quadrupoli (UPLCQqQ) e normalmente utilizzati in laboratori accreditati ISO EN Attività b - Validazione della metodica sviluppata mediante prove intra-laboratorio (SS) La validazione intra-laboratorio della metodica sviluppata verrà effettuata mediante analisi di materiali di riferimento (CRM) e di produttori accreditati ed inseriti nel data base internazionale COMAR. 69

70 Saranno individuati laboratori pubblici e privati accreditati ISO EN per la prova di screening di residui di fitofarmaci nella matrice frumento. Sarà istituito un sistema di conduzione di prove valutative interlaboratorio in conformità ai requisiti della ISO/IEC (Proficiency testing). Saranno utilizzate le aliquote di miscele di fitofarmaci (CMR) allestite nell attività a ai fini dell istituzione di un confronto interlaboratorio tra tecniche innovative di spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC HRMS-Orbitrap) e tecniche di spettrometria di massa convenzionali generalmente in uso (LC-QqQ). Sarà prodotto un confronto statistico, in conformità alla ISO 13528:2005 Statistical method for use in proficiency testing by interlaboratory comparison dei dati analitici ottenuti dai vari laboratori selezionati ed accreditati ISO Per il disegno del protocollo di validazione si farà riferimento alle linee guida contenute nel documento DG Sanco N / Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Per lo svolgimento delle suddette attività, la Lab. Instruments srl coinvolgerà i seguenti laboratori siti nel proprio stabilimento: laboratori preparativi con linee di preparazione, laboratorio controllo qualità linea di confezionamento e linea di conservazione operanti secondo le ISO EN 9000, ISO EN 14000, ISO Guide 30:1992/2008, 31:200, 34:2006 ed ILAC G13:2000 e laboratori di controllo qualità materie prime in ingresso e prodotti finiti operanti secondo UNI CEI EN IS/IEC e Proficiency testing (Guide ISO/IEC 43-1 e 43-2). In detti laboratori sono disponibili le seguenti apparecchiature : n.2 GC-MS a singolo quadrupolo, n. 1 GC-MS/MS a trappola ionica, n. 1 GC-HRMS magnetico, n. 2 LC-MS/MS a trappola ionica, n. 2 LC-MS/MS a triplo quadrupolo, n. 1 LC-HRMS magnetica, n. 12 GC capillari con detectors FID, NPD, ECD, TCD, PID completi di campionatori automatici; n. 8 HPLC con detectors UV, DAD, spettrofluorimetri, Elettrochimico, Conduttimetrico, con auto campionatori; bilnacie microanalitiche, picnometri, rifrattometri, etc. ma si rende necessario l eventuale acquisizione di un GC-MS/MS a triplo quadrupolo con risoluzione migliore di 0,4 amu e di un LC-MS a trappola orbitale per la corretta valutazione della diversa risposta strumentale tra i diversi detectors di spettrometria di massa. - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a-g: Lab. Instruments s.r.l., Castellana Grotte (BA) Attività a: ISPA-CNR Bari Attività b: Lab. Instruments s.r.l., Castellana Grotte (BA); ISPA-CNR Bari Attività c: Lab. Instruments s.r.l., Castellana Grotte (BA) - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici) Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Le attività di preparazione dei materiali di riferimento, sviluppo, allestimento miscele, inclusione in matrici, controllo qualità, sviluppo e validazione delle metodiche analitiche e realizzazione del sistema di qualità ed approntamento della documentazione relativa all intero processo ai fini della eventuale certificazione di prodotto e di processo, verranno svolte presso i laboratori della Lab. Instruments s.r.l. Le attività relative alla validazione delle metodiche verranno svolte in parte presso i laboratori dell ISPA- CNR Bari. Attività a-g: Lab. Instruments s.r.l.: tutte le attività. Attività a-b: Lab. Instruments s.r.l.: tutte le attività 70

71 ISPA-CNR Bari: partecipazione alla validazione Attività c Lab. Instruments s.r.l.: tutte le attività OS5.2: Messa a punto di una metodica multi-micotossina in cereali e derivati e produzione di materiali di riferimento. Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: ISPA-CNR; Lab. Instruments srl) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Produzione di materiali di riferimento (farine di frumento e mais) multi-micotossina (RI, SS) Attività a - Selezione di campioni di frumento e mais (RI) Verrà effettuato uno screening di campioni di frumento e mais per selezionare materiali non contaminati da micotossine e naturalmente contaminati almeno da una famiglia di micotossine quali: aflatossine, ocratossina A, deossinivalenolo, tossine T-2 e HT-2, zearalenone e fumonisine B 1 e B 2 (solo per farina di mais) a livelli uguali o maggiori dei limiti massimi ammissibili. Attività b - Allestimento di colture fungine (Fusarium, Aspergillus) su frumento e mais (RI) Verranno allestite colture fungine (Fusarium, Aspergillus) su frumento e mais per la preparazione di cereali altamente contaminati. I livelli di contaminazione delle singole micotossine nelle colture verranno determinati mediante metodiche cromatografiche (LC-MS/MS) precedentemente validate. Attività c - Preparazione di farine di frumento e mais contaminate ai livelli desiderati (RI) Verranno preparate farine di frumento e mais contaminate dalle principali micotossine sottoposte a regolamentazione in EU (aflatossine B 1, B 2, G 1, G 2, ocratossina A, deossinivalenolo, tossine T-2 e HT-2, zearalenone), a livelli prossimi ai limiti massimi ammissibili. La farina di mais conterrà inoltre fumonisine B 1 e B 2. Per ottenere farine contaminate ai livelli desiderati si procederà con la miscelazione di materiali altamente contaminati (colture fungine) e i materiali naturalmente contaminati o non contaminati selezionati nell attività 5.2.1a. I livelli di contaminazione delle singole micotossine nei materiali finali verranno confermati mediante analisi con metodiche LC-MS/MS precedentemente validate. Attività d - Studio di omogeneità (RI) Sulle farine di frumento e mais preparate nell attività 5.2.1c verrà condotto uno studio di omogeneità della contaminazione per tutte le micotossine considerate. Attività e - Studio di stabilità (RI) Verificata la omogeneità dei materiali, si procederà con lo studio della stabilità. A tal fine le farine verranno analizzate per tutte le micotossine a intervalli di tempo di 1, 3, 6, 12 mesi, durante i quali verranno conservate a temperature di -20, 4, 25 C. Attività f - Certificazione dei valori di contaminazione delle singole micotossine mediante proficiency test (SS) La certificazione dei valori di contaminazione delle singole micotossine verrà efettuata mediante proficiency test. Le principali fasi di questa attività riguarderanno: reclutamento dei laboratori, preparazione dei questionari, aloquitazione e distribuzione dei materiali, raccolta ed elaborazione dei risultati. Task Sviluppo di metodiche multi-analita LC-MS(MS) per micotossine in cereali e prodotti derivati (RI, SS) Attività a - Sviluppo di una procedura di estrazione (RI) Nel corso di questa attività verrà sviluppata una procedura di estrazione che garantisca recuperi soddisfacenti di tutte le micotossine considerate, ovvero: aflatossine, ocratossina A, fumonisine, tricoteceni, zearalenone, acetil derivati del deossinivalenolo, glicosil derivati di tricoteceni e zearalenone, fumonisine nascoste. A tale 71

72 scopo verranno saggiate e confrontate diverse miscele di solventi estraenti e tecniche di estrazione (agitazione, omogeneizzazione ad alta velocità, estrazione con microonde). Attività b - Sviluppo di procedure di purificazione degli estratti (RI) Pe la purificazione degli estratti verranno valutate differenti tecniche sull uso di colonnine ad immunoaffinità multi-anticorpo e colonnine per estrazione in fase solida. Attività c - Implementazione di un sistema per estrazione in fase solida (SPE) on line (RI) Se compatibile con la tecnica selezionata per la purificazione delgi estratti, si valuterà la possibilità di implementare un un sistema per estrazione in fase solida (SPE) on line basato su cartucce rigenerabili per ridurre i tempi e i costi dell analisi. Attività d - Studio dell effetto matrice (RI) L effetto matrice sulla ionizzazione degli analiti verrà valutato in tutti i materiali considerati per lo sviluppo del metodo, mediante confronto di rette di calibrazione costruite in fase mobile e in matrice e valutazione statistica delle differenze tra le rette. Questo consentirà di valutare la necessità di utilizzare curve di calibrazione standard o in matrice. Verrà inoltre valutato l uso di standard marcati con isotopo C 13 per la compensazione dell effetto matrice. Attività e - Sviluppo e confronto di metodiche di rivelazione basate sull uso di spettrometri di massa a triplo quadrupolo (LC-MS/MS) e ad alta risoluzione (LC-HRMS) (RI) Per la rivelazione simultanea di tutte le micotossine di interesseverranno sviluppate e ottimizzate metodiche strumentati basate sull utilizzo di strumentazione LC-MS/MS e LC-HRMS. Tali metodiche verranno confrontate in termini di sensibilità, selettività, effetto matrice, conformità ai requisiti normativi. Tali specifiche verranno valutate per tutte le matrici considerate per lo sviluppo dei metodi allo scopo di individuare l approccio migliore per ogni specifica problematica. In questa fase verrà inoltre studiato l impiego della sorgente ionica DART (Direct Analysis in Real Time) per lo sviluppo di metodiche di screening rapido. Attività f - Validazione intra-laboratorio della metodica analitica sviluppata in tutte le matrici di interesse (SS) La validazione intra-laboratorio delle metodiche analitiche sviluppata in tutte le matrici di interesse (cereali quali frumento e mais, prodotti a base di cereali quali snacks e/o cereali per colazione) comprenderà: determinazione dei valori di recupero e ripetibilità a diversi livelli di contaminazione, valutazione del range di linearità, determinazione dei limiti di rivelabilità in matrice, confronto con metodiche analitiche validate, analisi di materiali di riferimento certificati (preparati come descritto nel Task 5.2.1) - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Per l espletamento delle suddette attività ci si avvarrà dell esperienza comprovata del personale dell ISPA- CNR nello sviluppo e validazione di metodiche per la determinazione di micotossine in matrici agroalimentari. L ISPA-CNR è membro del Network di Eccellenza Europeo MoniQA, sulla armonizzazione dei metodi di analisi per il controllo di qualità dei prodotti, e del CEN (Comitato Europeo di Standardizzazione) per i metodi di analisi di contaminanti alimentari. Nell ambito del MoniQA lispa sta coordinando un Proficiency Test per la verifica dei metodi multi-micotossina attualmente in uso a cui partecipano circa 70 laboratori di ricerca o di analisi a livello globale. L ISPA ha inoltre coordinato altri progetti europei (STM, Standards, Measurements and Testing) per la preparazione di materiali di riferimento e studi interlaboratorio per la validazione di metodi di analisi di micotossine. Per la determinazione dei livelli di micotossine in tutte le fasi della preparazione dei materiali di riferimento e per lo sviluppo delle metodiche analitiche ci si avvarrà in parte della strumentazione presente nei laboratori dell ISPA-CNR (cromatografo liquido accoppiato a spettrometro di massa a triplo quadrupolo) e sarà necessario acquisire un sistema per SPE on line, e un cromatografo liquido-spettrometro di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) dotato di sorgenti di ionizzazione ESI, APCI, DART. Il nuovo spettrometro di massa sarà utilizzato nel progetto anche per le attività di cui al Task per la determinazione di allergeni nel vino. 72

73 - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a-e: ISPA-CNR Bari Attività f: Lab. Instruments s.r.l., Castellana Grotte (BA) Attività a-e: ISPA-CNR Bari Attività f: ISPA-CNR Bari; Lab. Instruments s.r.l., Castellana Grotte (BA) - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a-e - ISPA-CNR Bari: tutte le attività. Attività f - Lab. Instruments s.r.l.: organizzazione del proficiency test (reclutamento dei laboratori partecipanti, preparazione e distribuzione dei materiali. Attività a-e - ISPA-CNR Bari: tutte le attività. Attività f - ISPA-CNR Bari: validazione dei metodi in tutte le matrici testate. - Lab. Instruments s.r.l.: analisi di conferma dei materiali di riferimento certificati. OS5.3: Messa a punto di una metodica analitica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati (RI, SS) Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: Bonassisalab srl; Università degli Studi di Foggia, Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex DiSACD) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Sviluppo di una metodica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati (RI, SS) Attività a - Messa a punto di un protocollo di estrazione simultanea di micotossine e fitofarmaci (RI) L obiettivo di questa attività è mettere a punto un protocollo di estrazione solido-liquido (individuare il solvente ottimale ed il giusto rapporto solvente/campione per il maggior recupero di pesticidi e micotossine nei cereali) che soddisfi il Regolamento CE n. 401/2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari ed i criteri del documento della DG. SANCO per i fitofarmaci. Nel corso di questa attività si effettueranno prove di estrazione a partire da campioni di frumento artificialmente contaminati con fitofarmaci e micotossine appartenenti alle segueti categorie: - composti polari (acetate); - composti apolari (DDT); - composti ad elevato PM (deltametrina); - composti fosforati (clorpirifos metile); - composti alogenati (miclobutanile); - carbammati (methomil); - composti azotati polari (cimoxanil); - composti ureici (lufenuron); - composti aromatici (clofentezine); - aflatossine totali (B1, B2, G1, G2); - ocratossina A; - deossinivalenolo; - fumonisine; - zearalenone; - tricoteceni. Verranno preparate 9 combinazioni di solventi (a base di acetonitrile, metanolo, acqua) da testare per determinare la miglior resa di estrazione in grado di garantire il rispetto delle prescrizioni legislative di recupero per i pesticidi e le micotossine. Individuata la miglior combinazione di solventi saranno effettuate 10 ripetizioni allo scopo di verificare la conformità delle percentuali di recupero ottenute con i requisiti normativi. 73

74 Attività b - Ottimizzaione delle condizioni analitiche strumentali e costruzione di rette di calibrazione per ciascun analita (RI) L obiettivo di questa attività è di ottenere la miglior sensibilità di risposta delle strumentazioni LC-MS/MS e GC-MS/MS per tutte le molecole sottoposte ad indagine. Verranno allestite soluzioni standard di agrofarmaci e micotossine da utilizzare per l ottimizzazione dei parametri strumentali (separazione cromatografica, condizioni di ionizzazione, energie di collisione, dwell time). Per la costruzione di rette di calibrazione per tutti i fitofarmaci e delle micotossine necessarie per la quantificazione dei contaminanti considerati si procederà come segue: - preparazione di 6 miscele contenenti 100 principi attivi di pesticidi ciascuna più 1 miscela contenente tutte le micotossine; - analisi delle 7 miscele (5 repliche) per ogni livello di concentrazione; - realizzazione di una curva di calibrazione per ognuno dei principi attivi. Attività c - Verifica delle prestazioni del metodo mediante analisi di materiali di riferimento (SS) Obiettivo dell attività è la verifica delle prestazioni del metodo con l utilizzo di materiali certificati e/o a titolo noto. Saranno effettuate analisi con campioni certificati (eg. FAPAS) e/o partecipazione a circuiti interlaboratorio. Attività d - Validazione della metodica sviluppata in cereali e derivati (SS) Obiettivo dell attività è valutare le performance del metodo affinché rispettino le specifiche riportate nella norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 e le prescrizioni ACCREDIA (ex SINAL) e del Regolamento CE n. 401/2006 per la ricerca dei pesticidi e delle micotossine nei cereali e prodotti derivati. In particolare verranno valutaio i seguenti parametri: - ripetibilità; - riproducibilità; - selettività (il grado di selettività verrà determinato eseguendo una prova di linearità a due punti sulle matrici prese in considerazione per la fase di recupero. Nel caso in cui ci sia una interferenza di matrice la curva presenterà dei problemi di linearità indicando una bassa selettività); - limite di rilevabilità e limite di quantificazione; - intervallo di lavoro ed intervallo di linearità; - precisione; - sensibilità; - incertezza di misura (verrà calcolata con l'equazione di Horwitz); - accuratezza o esattezza (verrà effettuata attraverso l Iscrizione del Laboratorio a circuiti interlaboratorio che siano organizzati in maniera conforme alla ISO Guide 43-1: 1997, ed alla guida ILAC G 13: 2000 per le prove accreditate). - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Il laboratorio Bonassisa ha una vocazione storica nello sviluppo e messa a punto di metodi analitici innovativi per il monitoraggio in campo agro-alimentare, clinico ed ambientale. La ricerca è orientata al settore della sicurezza alimentare, con lo sviluppo di metodi per la determinazione di xenobiotici (analisi di micotossine, pesticidi, metalli pesanti, fitormoni, ammine biogene), e del monitoraggio della qualità, che prevede la tracciabilità ed il controllo di processo e di prodotto. L attività scientifica è rivolta allo sviluppo di metodi analitici innovativi per il monitoraggio di xenobiotici in campo alimentare ed ambientale e per tale motivo il laboratorio ha incrementato la strumentazione con l acquisto di tripli quadrupoli (HPLC-GC) capaci di rilevare in maniera molto sensibile piccole quantità di microinquinanti. La Bonassisalab srl è un laboratorio accreditato SINAL n 0328, conforme alle norme UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005. Nel 2001 ha ottenuto l accreditamento per l'analisi multiresiduale e la determinazione di 140 principi attivi (POP 02/004); tale prova ha visto l'utilizzo del GC con rivelatore ECD-NPD e dell HPLC con rivelatore UV. Il laboratorio è riuscito ad ottenere la conferma dell'accreditamento SINAL ogni anno sulla metodica multiresiduale con un incremento del numero di principi attivi determinati grazie anche alle nuove strumentazioni adottate. Le ultime prove accreditate risalgono al: 2007 accreditamento prova sull'analisi multiresiduale per la determinazione di 260 principi attivi utilizzando GC-ECD-NPD, HPLC-UV e GC-MS detector; 2008 accreditamento prova sull'analisi multiresiduale per la determinazione di 435 principi attivi utilizzando l'hplc-ms-ms triplo quadrupolo e GC-MS. Ulteriori competenze del laboratorio sono attestate da: -Validazione COOP Italia per la ricerca di fitofarmaci e nitriti-nitrati su matrici ortofrutticole (N.041); - Istituto Sperimentale per la patologia vegetale (ISPaVe) inserimento nella rete dei laboratori per Programma interregionale Agricoltura e qualità Misura 2; controllo dell impiego di fitofarmaci in agricoltura (Prot N. 4312); -Regione Puglia laboratorio selezionato per lo svolgimento di analisi dei residui dei prodotti fitosanitari (BUR n /06/02); -Laboratorio approvato dal circuito QS per il monitoraggio di residui di fitofarmaci in prodotti ortofrutticoli. Per quanto riguarda la determinazione delle micotossine nei 74

75 cereali e derivati, il laboratorio è riuscito ad ottenere il riconoscimento SINAL di alcune metodiche quali: Metodica per la determinazione dell ocratossina A in cereali e derivati; Metodo per la determinazione delle aflatossine B1 e totali (B1, B2, G1, G2) in mais, riso, grano e derivati, crusca e caffè con LC-MS. Attrezzature già disponibili: sistema HPLC triplo quadrupolo 1200/6430; 2 sitemi GC/MS-MS 7890 A + triploquod 7000 A; sitema 1200 HPLC + triplo quadrupolo 6410 A. La Bonassisalab, per l esecuzione delle attività di progetto, prevede di acquistare un HPLC triplo quadrupolo Agilent modello Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Le attività saranno svolte presso Bonassisalab s.r.l., Foggia - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a - Bonassisalab s.r.l: esecuzione attività tecnico-scientifica. - Università di Foggia, Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex DiSACD): verifica della congruità dei risultati e valutazione di eventuali variazioni ai protocolli sperimentali. Attività b - Bonassisalab: esecuzione attività tecnico-scientifica. Attività c - Bonassisalab: esecuzione attività tecnico-scientifica. - Università di Foggia, Ex DiSACD: verifica della congruità dei risultati e valutazione di eventuali variazioni ai protocolli operativi. Attività d - Bonassisalab: esecuzione attività tecnico-scientifica. - Università di Foggia, Ex DiSACD: verifica della congruità dei risultati e valutazione dei risultati. OS 5.4: Sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di micotossine in cereali e derivati Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: ISPA-CNR, Molini Tandoi Pellegrino spa) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Messa a punto di immunosaggi a polarizzazione di fluorescenza (FP) per la determinazione di OTA, DON e tossine T-2 e HT-2 in cereali e prodotti derivati (RI, SS) Attività a - Sintesi e isolamento di derivati fluorescenti (traccianti) delle micotossine (RI) L immunosaggio FP consente di quantificare le micotossine sulla base della competizione, in soluzione, tra le singole micotossine e un relativo derivato fluorescente (tracciante) nei confronti di un anticorpo monoclonale specifico. La sintesi dei traccianti, coniugati delle micotossine (OTA, DON, T-2 e HT-2) con derivati della fluoresceina, verrà effettuata attraverso reazioni di attivazione/protezione delle funzionalità caratteristiche delle micotossine e l utilizzo di spaziatori (linker), ove necessario. L identificazione e caratterizzazione dei coniugati ottenuti verrà realizzata mediante tecnica di conferma LC-MS/MS. I traccianti fluorescenti verranno isolati mediante HPLC semi-preparativa e successivamente caratterizzati per via spettrofluorimetrica e LC-MS/MS. 75

76 Attività b - Studio dell interazione tracciante-anticorpo e messa a punto di un metodo competitivo in soluzione (RI) Verranno valutate in soluzione l interazione tra anticorpi monoclonali specifici per le micotossine (OTA, DON, T-2 e HT-2) con i traccianti fluorescenti sintetizzati. Saranno saggiati sia anticorpi commercialmente disponibili che reperti attraverso le numerose collaborazioni che l ISPA-CNR ha con altri Enti di Ricerca in ambito nazionale e internazionale. Saranno ottimizzate le condizioni sperimentali (soluzioni tampone, ph, e tempi di incubazione) allo scopo di valutare la migliore combinazione anticorpo/tracciante da utilizzare per la messa a punto dell immunosaggio per la determinazione quantitativa delle stesse micotossine, in termini di sensibilità, intervallo di linearità e ripetibilità. Verrà inoltre valutata la cross-reattività degli anticorpi selezionati nei confronit di analoghi strutturali delle micotossine oggetto dello studio. Attività c Sviluppo di un protocollo di estrazione compatibile con l immunosaggio e valutazione delle performance analitiche dell immunosaggio FP (RI) Verranno messi a punto metodi di estrazione ad hoc per DON in farro, pasta di farro, crusca e farinaccio, OTA in frumento, crusca, farinaccio e pasta, T-2/HT-2 in crusca, farinaccio e pasta utilizzando solventi compatibili con la realizzazione dell immunosaggio, in termini di stabilità dell anticorpo e sensibilità del saggio. Verranno valutate le performance degli immunosaggi FP sviluppati in soluzioni a differente contenuto di solvente organico e per ogni singola matrice verrà determinata la massima quantità di matrice da sottoporre ad analisi che non determini una significativa variazione del segnale analitico (effetto matrice). Qualora necessario verranno messe a punto strategie di purificazione dell estratto da sottoporre all immunosaggio FP. Attività d Validazione intra-laboratorio dell immunosaggio FP (SS) La validazione dei metodi sviluppati verrà effettuata valutandone l accuratezza e la precisione attraverso la determinazione dei valori di recupero e delle deviazioni standard relative ad almeno tre livelli di contaminazione (basso, medio, alto) per ogni singola matrice. Inoltre sarà condotto uno studio comparativo, tra i metodi di polarizzazione di fluorescenza (FP) sviluppati e i metodi di riferimento (HPLC o LC-MS) analizzando campioni di ogni singola matrice naturalmente contaminati da micotossine. Infine, i protocolli analitici sviluppati saranno ottimizzati al fine di utilizzare un prototipo strumentale completamente automatico (European Patent Application No A3) già disponibile presso i laboratori dell ISPA- CNR per la realizzazione degli immunosaggi FP. Task Messa a punto di un saggio lateral flow (LF) per la determinazione di OTA in cereali e prodotti derivati (RI, SS) Attività a - Messa a punto di un saggio LF basato sull utilizzo dell aptamero per la determinazione di OTA in soluzione (RI) Il saggio LF verrà condotto su strip monouso su cui sarà adsorbito un aptamero a DNA (oligonucleotide sintetico disponibile commercialmente) con elevata affinità e specificità nei confronti dell OTA. La messa a punto dello strip si baserà sull ottimizzazione dei parametri sperimentali quali: materiale di supporto sul quale immobilizzare l aptamero, quantità di aptamero da immobilizzare, tampone e ph da utilizzare nel saggio, tracciante fluorescente, tempo di incubazione. Le condizioni sperimentali che forniranno i migliori risultati in termini di sensibilità, intervallo di linearità e ripetibilità verranno utilizzate per la messa a punto del saggio LF per la determinazione dell OTA in matrice. Attività b - Sviluppo di un protocollo di estrazione compatibile con il saggio LF e valutazione delle performance analitiche (RI) Verranno sviluppati metodi analitici ad hoc per l estrazione di OTA da frumento, crusca, farinaccio e pasta utilizzando solventi compatibili con la realizzazione del saggio LF in termini di stabilità dell aptamero e sensibilità del saggio. Saranno testati i seguenti parametri: solvente di estrazione, chiarificazione dell estratto mediante filtrazione e/o centrifugazione, ph del tampone da utilizzare per la diluizione dell estratto, volume di campione diluito da testare. Qualora necessario, verranno messe a punto strategie di purificazione dell estratto da sottoporre al saggio LF. In particolare verrà valutata la possibilità di impiegare colonnine per estrazione in fase solida (SPE) preparate utilizzando l aptamero per l OTA. 76

77 Attività c - Validazione intra-laboratorio del saggio LF (SS) La validazione dei metodi sviluppati verrà effettuata valutandone l accuratezza e la precisione attraverso la determinazione dei valori di recupero e delle deviazioni standard relative ad almeno tre livelli di contaminazione (basso, medio, alto) per ogni singola matrice. Inoltre sarà condotto uno studio comparativo, tra i metodi LF sviluppati e i metodi di riferimento (HPLC o LC-MS) analizzando campioni di ogni singola matrice naturalmente contaminati da OTA. Task Messa a punto di metodi di spettroscopia nel vicino infrarosso (FT-NIR) per la determinazione semi-quantitativa/qualitativa di DON e OTA in cereali e prodotti derivati (RI, SS) Attività a - Selezione di campioni di cereali e prodotti derivati naturalmente contaminati previa analisi con metodo analitico di riferimento (RI) Le attività riguarderanno la selezione di campioni di crusca e farinaccio naturalmente contaminati da DON e di frumento, crusca e farinaccio naturalmente contaminati da OTA da utilizzare per lo sviluppo di rette di calibrazione o di modelli discriminanti FT-NIR per la determinazione qualitativa e/o semi-quantitativa di tali micotossine. La selezione di almeno 100 campioni per tipologia di matrice verrà effettuata sulla base dei risultati ottenuti con metodo analitico di riferimento specifico per ogni micotossina in maniera tale da essere uniformemente distribuiti in un intervallo di concentrazione opportunamente definito. I campioni verranno suddivisi in due gruppi, uno verrà utilizzato per la calibrazione dei metodi FT-NIR (set di calibrazione), mentre l altro gruppo verrà impiegato per la validazione degli stessi (set di validazione). Attività b - Sviluppo di rette di calibrazione e di modelli discriminanti FT-NIR specifici per ciascuna micotossina e matrice selezionata (RI) Per quanto riguarda la determinazione qualitativa, verrà valutata la capacità della spettroscopia FT-NIR di classificare ed identificare campioni di crusca e farinaccio contaminati da DON e di frumento, crusca e farinaccio contaminati da OTA a differenti livelli. In particolare, sulla base del livello di tossina determinato con il metodo di riferimento, i campioni verranno suddivisi in tre classi: basso, medio e alto contenuto di micotossina e analizzati mediante FT-NIR per la calibrazione del metodo. Le variabili statistiche associate a tali modelli di calibrazione forniranno indicazioni sulla capacità degli stessi di discriminare i campioni in funzione del livello di contaminazione. Per quanto riguarda la determinazione semi-quantitativa, per ciascuna matrice, i dati ottenuti mediante spettroscopia FT-NIR e quelli relativi al contenuto di micotossina ottenuti mediante metodo di riferimento saranno processati con modello matematico PLS (Partial Least Squares). Le variabili statistiche ad esso associate forniranno indicazioni sulla precisione e accuratezza del metodo ed indicheranno la misura della capacità predittiva del modello di calibrazione. Attività c - Validazione (in-house) delle rette e dei modelli discriminanti FT-NIR (SS) I campioni appartenenti al set di validazione verranno analizzati mediante spettroscopia NIR. L applicazione dell analisi discriminante ai risultati ottenuti permetterà di attribuire l appartenenza del campione analizzato ad una classe (basso, medio e alto contenuto di micotossina) sulla base della similitudine tra lo spettro del campione e lo spettro medio delle classi. Le performance del metodo FT-NIR qualitativo verranno valutate sulla base delle percentuali di corretta classificazione dei campioni analizzati. L applicazione del modello matematico PLS (Partial Least Squares) ai risultati ottenuti permetterà di valutare precisione e accuratezza del metodo FT-NIR semi-quantitativo nella fase di validazione. Task Messa a punto di un metodo basato sul naso elettronico con tecnologia MOS per la determinazione di DON e OTA in cereali e prodotti derivati (RI, SS) Attività a - Calibrazione del naso elettronico per la classificazione di campioni di cereali e prodotti derivati a differente contenuto di DON e OTA (RI) I campioni di crusca e farinaccio naturalmente contaminati da DON e di frumento, crusca e farinaccio naturalmente contaminati da OTA selezionati nell ambito della Task 3.3.3a, saranno utilizzati per l addestramento (calibrazione) del naso elettronico con tecnologia MOS al riconoscimento del pattern di sostanze volatili correlate alla presenza di tali micotossine nelle matrici di interesse. Sulla base del livello di contaminazione determinato con il metodo di riferimento, i campioni verranno suddivisi in tre classi: basso, medio e alto contenuto di micotossina e analizzati mediante naso elettronico per la calibrazione del metodo. 77

78 Verrà valutata quindi la capacità del naso elettronico di classificare campioni contaminati da DON e OTA ai differenti livelli. Verranno quindi ottimizzate le condizioni sperimentali del naso elettronico al fine di migliorare le prestazioni del metodo (gas carrier, flusso, temperatura, umidità del gas, tempo di generazione dello spazio di testa, tempo di acquisizione della linea di base, tempo di iniezione, tempo totale di acquisizione dati, tempo di ritardo tra due campioni successivi, numero e tipologia di features da uilizzare per i segnali analitici). Saranno inoltre ottimizzate le condizioni sperimentali di preparazione del campione attraverso l ottimizzazione delle condizioni operative da applicare e la valutazione della possibilità di analizzare il campione tal quale o previo pre-trattamento. Le variabili statistiche associate a tali modelli di calibrazione forniranno indicazioni sulla capacità degli stessi di discriminare i campioni in funzione del livello di contaminazione. Attività b - Validazione (in-house) del metodo basato sul naso elettronico con tecnologia MOS (SS) I campioni naturalmente contaminati da DON e OTA appartenenti al set di validazione selezionati nell ambito della Task a verranno analizzati mediante naso elettronico con tecnologia MOS. L applicazione dell analisi discriminante (Discriminant Function Analysis) ai risultati ottenuti permetterà di attribuire l appartenenza del campione analizzato ad una classe (basso, medio e alto contenuto di micotossina). Le performance del metodo verranno valutate sulla base delle percentuali di corretta classificazione dei campioni analizzati Attività c - Caratterizzazione delle sostanze volatili correlate alla presenza del DON e OTA in cereali e prodotti derivati (RI) Verranno caratterizzate, mediante tecnica SPME-GC/MS, le componenti volatili presenti nei campioni di frumento, crusca e farinaccio la cui presenza e quantità risulterà correlabile al contenuto di micotossina. La tecnica SPME prevede l'impiego di una fibra in silice fusa opportunamente rivestita con un film di fase polimerica, che ha il compito di adsorbire selettivamente i composti organici volatili presenti nello spazio di testa del campione. Verranno selezionate le fibre (tipo di polimero e spessore), ottimizzati i tempi di esposizione della fibra e le modalità di preparazione del campione da sottoporre ad analisi dello spazio di testa e verranno ottimizzate le condizioni sperimentali del sistema GC/MS per il miglior riconoscimento delle sostanze volatili. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente L ISPA-CNR ha esperienza pluridecennale nello sviluppo e validazione di nuovi metodi di analisi chimicostrumentali e immunometrici e, più recentemente, di metodi basati su tecnologie innovative (polarizzazione di fluorescenza, aptameri, spettroscopia nell infrarosso, naso elettronico) per la determinazione di micotossine in varie matrici agroalimentari. In particolare, l ISPA ha sviluppato metodi ufficiali per la determinazione di micotossine in varie matrici alimentari e metodi innovativi basati sulla polarizzazione di fluorescenza per la determinazione del deossinivalenolo nel frumento e prodotti derivati e OTA nel vino, metodi basati sull uso di elettrodi screen-printed per la determinazione di OTA nel frumento, metodi basati sulla spettroscopia FT-NIR e sul naso elettronico per la determinazione del deossinivalenolo nel frumento. Inoltre l ISPA-CNR ha sviluppato un prototipo strumentale interamente automatizzato per effettuare immunosaggi FP già disponibile presso i laboratori dell ISPA-CNR che è oggetto di una proposta brevettuale in ambito europeo (European Patent Application No A3). L ISPA partecipa al progetto del 7 Programma Quadro CONffIDENCE per lo sviluppo di metodi rapidi ed economici per l analisi di contaminanti (leader del WP sulle micotossine), ed è il Laboratorio Indipendente per la validazione di metodi rapidi di analisi delle micotossine dell AOAC (Association of Official Analytical Chemists) International. Per lo svolgimento delle attività l ISPA dispone di laboratori per le analisi chimiche e immunoenzimatiche di prodotti agroalimentari. Tra le principali strumentazioni disponibili per le attività, compatibili con gli impegni richiesti dal progetto proposto e dagli altri in contemporaneo svolgimento, si possono elencare: sistemi per cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC e UPLC), cromatografo liquido-spettrometro di massa (LC-MS), spettrometro FT-NIR, naso elettronico con tecnologia MOS (Metal Oxide Semiconductors), lettori di polarizzazione di fluorescenza. L ISPA-CNR prevede di acquistare un cromatografo liquido ad alta risoluzione (UHPLC) provvisto di auto campionatore e rivelatori a serie di diodi e a fluorescenza da utilizzare al 100% nelle attività previste 78

79 nell ambito delle Task quale metodica di confronto, sia nella fase di sviluppo, sia nella fase di validazione dei metodi. Molini Tandoi Pellegrino SpA prevede di acquistare un sistema interamente automatizzato per effettuare immunosaggi FP. - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a-d: ISPA-CNR Bari; Molini Tandoi Pellegrino spa; SAFE WHEAT srl Bari (Consulente). Attività a-c: ISPA-CNR Bari. Attività a-c: ISPA-CNR Bari. Attività a-c: ISPA-CNR Bari. - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a-d - ISPA-CNR Bari si occuperà delle sintesi dei traccianti fluorescenti, della messa a punto e validazione degli immunosaggi. - Molini Tandoi Pellegrino spa collaborerà con ISPA-CNR allo sviluppo del protocollo analitico e alla validazione in-house degli immunosaggi. - SAFE WHEAT srl (Consulente) si occuperà della validazione degli immunosaggi FP sviluppati utilizzando il prototipo strumentale. Attività a-c - ISPA-CNR Bari si occuperà della messa a punto e della validazione del saggio LF. Attività a-c - ISPA-CNR Bari si occuperà della messa a punto e della validazione dei metodi FT-NIR. Attività a-c - ISPA-CNR Bari si occuperà della messa a punto del metodo basato sul naso elettronico con tecnologia MOS e della caratterizzazione delle sostanze volatili. OR 6 STRUMENTI INNOVATIVI PER LA PREVENZIONE DEL RISCHIO DI CONTAMINAZIONE DI PRODOTTI FRESCHI OS6.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per ridurre i rischi di alterazione da Pseudomonas spp. nelle mozzarelle Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex Dipartimento di Biologia e Chimica Agroforestale ed Ambientale DiBCA); Centro Latte Stasi srl, Molfetta, Bari; Agriplan srl) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Selezione di batteri lattici bio-conservanti (RI) Attività a - Screening di batteri lattici (LAB) non starter per attività anti-pseudomonas (RI) Preliminarmente sarà effettuato uno screening tra LAB non starter isolati da formaggi su terreni colturali spenti appartenenti a ciascuna delle colture da saggiare. Il saggio di inibizione sarà effettuato mediante il metodo well diffusion assay, impiegando come microrganismo indicatore un ceppo di Pseudomonas 79

80 fluorescens. I LAB selezionati saranno saggiati anche in condizioni di bassa temperatura per verificare la loro efficacia anche in condizioni che riproducono la shelf-life del prodotto. Attività b - Produzione di plantaricina e prove di attività anti-pseudomonas (RI) Le batteriocine sono sostanze di natura proteica o peptidica sintetizzate da LAB e che in genere hanno uno spettro di attività anti-microbica abbastanza limitato e specifico. Sarà pertanto avviata la produzione della batteriocina plantaricina, mediante coltivazione di Lactobacillus plantarum DC400. La plantaricina sarà purificata dal terreno colturale spento mediante una o più tecniche di cromatografia liquida. L attività anti- Pseudomonas sarà saggiata in vitro solubilizzando preventivamente la plantaricina in un tampone di Na 2 - EDTA, al fine di ampliarne lo spettro di azione ai batteri Gram-negativi. Il batterio lattico bio-conservante selezionato come sopra descritto e la plantaricina saranno impiegate nel Task Task Valutazione delle strategie di controllo di Pseudomonas spp. in condizioni di laboratorio (RI) Attività a - Valutazione dell attività anti-pseudomonas delle soluzioni sostitutive in condizioni di laboratorio (RI) Una soluzione acquuosa contenente 0,15% di NaCl sarà autoclavata e costituirà la base per la preparazione di 7 soluzioni, destinate a sostituire il liquido di governo, contenenti: sospensione cellulare di L. plantarum DC400 e Na 2 -EDTA (50 mm); plantaricina e Na 2 -EDTA; sospensione cellulare del batterio lattico selezionato nell attivià per l attività inibitoria nei confronti di P. fluorescens; MicroGARD (186); lisozima e Na 2 -EDTA (50 mm); estratto di limone; estratto di salvia; ed agente acidificante (ph ca. 4.0). L uso di Na 2 -EDTA nelle tesi in cui viene usato L. plantarum DC400 o la plantaricina o il lisozima è necessario per ampliare lo spettro di azione degli antimicrobici. MicroGARD è un bioconservante liofilizzato ottenuto dalla fermentazione del latte con propionibatteri, che non è mai stato impiegato nella produzione della mozzarella. Gli estratti di limone e di salvia contengono sostanze antimicrobiche naturali, ma la loro efficacia varia in funzione della casa produttrice. Ciascuna soluzione sarà inoculata con P. fluorescens (10 2 o 10 5 ufc/ml), al fine di confrontare l efficacia del batterio lattico bioconservante e della plantaricina con altre strategie di controllo parzialmente sperimentate in passato. Pertanto, il liquido di governo di due lotti di mozzarelle, uno prodotto mediante acidificazione diretta, l altro mediante l uso di starter commerciali, sarà usato per l isolamento di Pseudomonas spp. eventualmente presente in esso. La materia prima sarà sottoposta ad analisi multi-parametriche ed alla determinazione della carica di Pseudomonas spp.. Le mozzarelle di ciascun lotto saranno suddivise in 7 aliquote, ciascuna delle quali sarà testata usando le soluzioni sostitutive del liquido di governo sopraindicate. Le tesi saranno conservate per 14 gg a diverse temperature. Sulle mozzarelle saranno eseguite, al tempo 0 e dopo 7 e 14 gg, analisi chimico-fisiche, microbiologiche e sensoriali. Almeno una tesi sarà selezionata in base alla capacità di contenere il batterio alterativo al di sotto di 10 6 ufc/g dopo 14 gg e di mantenere inalterate le caratteristiche qualitative del prodotto. In fase di elaborazione dei risultati occorrerà tenere conto anche dei risultati delle analisi effettuate sul latte. Attività b - Elaborazione di un protocollo di monitoraggio di Pseudomonas spp (RI) Sarà elaborato un protocollo di monitoraggio, mediante Real Time PCR, dei LAB selezionati e di Pseudomonas spp. durante la shelf-life del prodotto, al fine di stabilire, usando strumenti di microbiologia predittiva, criteri per valutare, in tempo reale e prima della messa in commercio, la probabilità del verificarsi dell alterazione del prodotto durante la shelf-life. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Per lo svolgimento delle attività di sua competenza, il Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex DiBCA) potrà contare sulla pluriennale esperienza che i suoi ricercatori hanno nel campo della microbiologia e tecnologia degli alimenti. In particolare, una significativa parte dell attività di ricerca è dedicata alla qualità sensoriale, microbiologica e nutrizionale dei derivati lattiero-caseari, ed alla messa a punto di innovazioni di processo e/o prodotto esclusive di tale categoria di alimenti. Nello specifico dei formaggi a pasta filata, i ricercatori del DiSSPA (Ex DiBCA) vantano sei pubblicazioni su riviste internazionali censite dall ISI. L esperienza acquisita nel settore suddetto ha avuto una visibilità tale da 80

81 consentire la pubblicazione di sei capitoli su libri a divulgazione internazionale, in seguito all invito presentato dai relativi editori. Non meno importante è la linea di ricerca sull uso di antimicrobici naturali portata avanti dai ricercatori di UNIBA- DiSSPA (Ex DiBCA), testimoniata da cinque pubblicazioni su riviste internazionali censite dall ISI. Attrezzature già disponibili: cabina a flusso laminare, autoclave verticale, termostati, sistemi per cromatografia liquida, sistema per gas cromatografia, sistema per Real Time PCR, apparecchi per elettroforesi mono- e bi-dimensionale, mini-impianto per la caseificazione. Attrezzature da acquistare: bagno termostatico ad acqua, omogeneizzatore a lame, agitatore magnetico riscaldante, agitatore per provette vortex, incubatore con sistema di agitazione ( shaking incubator ), conta colonie modulare, micropipette automatiche mono-canale e multi-canale, sistema per la conservazione e catalogazione di colture batteriche congelate, detector per cromatografia. Centro Latte Stasi per lo svolgimento delle attività può contare su un laboratorio chimico e microbiologico dotato di strumentazione di base. Le attività svolte presso il laboratorio aziendale saranno coordinate di un Dottore veterinario altamente qualificato, il quale sarà altresì in stretto contatto con i ricercatori UNIBA- DiSSPA (Ex DiBCA) per quanto riguarda le attività da svolgersi presso UNIBA - DiSSPA (Ex DiBCA). L impresa inoltre conta di impegnare almeno una unità di personale che collaborerà con i ricercatori UNIBA- DiSSPA (Ex DiBCA) allo svolgimento delle analisi che, per mancanza di strumentazione, non potranno essere fatte nel laboratorio dell azienda. Centro Latte Stasi prevede di implementare le attrezzature del laboratorio con l acquisto di un apparecchiatura multiparametrica per eseguire rapidamente analisi su matrici alimentari. La società Agriplan srl. dispone al suo attivo di una lunga e comprovata esperienza nel settore dei servizi alle imprese per la ricerca e l innovazione nell agroalimentare, disponendo sia di un proprio staff tecnico che della disponibilità di esperti del settore. - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a-b: Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex Dipartimento di Biologia e Chimica Agroforestale ed Ambientale DiBCA); Agriplan srl, Bari Attività a: Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA); Centro Latte Stasi srl, Molfetta, Bari; Agriplan srl, Bari Attività b: Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA); Agriplan srl, Bari - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): screening di batteri lattici (LAB) non starter per attività anti-pseudomonas. - Agriplan srl: elaborazione dati derivanti dalle sperimentazioni di laboratorio. Attività b - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): produzione di plantaricina. - Agriplan srl: elaborazione dati derivanti dalle sperimentazioni di laboratorio. Attività a - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): valutazione dell attività anti-pseudomonas delle soluzioni sostitutive in condizioni di laboratorio. - Centro Latte Stasi srl: valutazione dell attività anti-pseudomonas delle soluzioni sostitutive in condizioni di laboratorio. Analisi chimiche, microbiologiche e sensoriali del prodotto, del suo confezionamento e dello stoccaggio in apposite celle a temperature diverse. - Agriplan srl: redazione del protocollo biotecnologico per l implementazione nel ciclo produttivo aziendale. 81

82 Attività b - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): elaborazione di un protocollo di monitoraggio di Pseudomonas spp. Agriplan srl si occuperà della elaborazione dati derivanti dalle sperimentazioni di laboratorio e redazione del protocollo biotecnologico per l implementazione nel ciclo produttivo aziendale. La società si avvarrà della consulenza dello Studio Tecnico Associato dei Dr Agr. FABRIZIO DE CASTRO e Dr Agr. PIERNICOLA TONDO. OS6.2 - Impiego di compost e strategie agronomiche innovative per ridurre il contenuto di metalli pesanti nelle produzioni orticole da consumo fresco Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: ISPA-CNR; Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti (DiSSPA) (Ex DiBCA) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Individuazione e valutazione di differenti compost idonei all impiego come substrati di coltivazione e/o ammendanti in orticoltura (RI) Attività a - Individuazione e valutazione di differenti compost idonei all impiego come substrati di coltivazione e/o ammendanti in orticoltura (RI) Verranno individuati, presso impianti di compostaggio presenti sul territorio, 10 compost commerciali. Tutti i compost commerciali selezionati dovranno essere in accordo con le vigenti norme di commercializzazione (D.L. n. 75 del 29 aprile 2010). Su ciascun compost sarà verificata l assenza di fitotossicità e verranno determinate le proprietà fisiche e chimiche. L assenza di fitotossicità sarà determinata mediante saggi di fitotossicità (bioassay). Per tale scopo saranno utilizzate 3 specie spia - Lepidium sativum (crescione), Lactuca sativa (lattuga) e Solanum licopersicon (pomodoro) i cui semi pregerminati saranno posti in piastre Petri su carta bibula imbibita con l estratto ottenuto dai compost. Le piastre saranno poste in condizioni ambientali controllate (27 C e % di umidità relativa) per 24 h. La presenza o assenza di fitotossicità sarà verificata in funzione dell Indice di Germinazione. Tutti i parametri biometrici saranno misurati mediante acquisizione con scanner Epson Perfection V700 ed elaborazione dell immagine con apposito software (WinRhizo, Régent Instruments, Canada). Le principali proprietà fisiche dei compost (conducibilità elettrica, densità apparente, porosità totale, densità specifica, capacità per l aria, capacità per l acqua, acqua facilmente disponibile, acqua di riserva e acqua non disponibile) saranno determinate con il metodo della cassetta tensiometrica (Eijkelkamp Agrisearch Equipment-Giesbeck, the Netherlands) in accordo con le norme europee di standardizzazione (EN 13041, 1999). La caratterizzazione chimica riguarderà, oltre che il ph, la determinazione degli elementi maggioritari e in tracce con particolare attenzione rivolta ai metalli pesanti. Tale determinazione sarà effettuata mediante spettroscopia di fluorescenza di raggi X (XRF) e spettroscopia di emissione atomica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES). I campioni da sottoporre alle analisi ICP-OES saranno preventivamente sottoposti a digestione acida assistita da microonde. Questa attività consentirà di individuare 2 compost con caratteristiche idonee ad essere utilizzati nelle successive prove agronomiche. Task Screening varietale su pomodoro da mensa e lattuga (RI) Attività a - Screening varietale su cultivar di pomodoro allevate senza suolo su substrato a base di compost (RI) I compost individuati saranno utilizzati come substrato per la coltivazione senza suolo in serra di pomodoro da mensa. Il confronto avverrà con un substrato costituito dal miscuglio torba: perlite (1:3 v/v). Verranno individuate 4 cultivar scelte tra quelle più diffuse al momento della prova. Le piante saranno allevate, in verticale, in vasi da 10 L posti su canalette in allumino, all interno di una serra in ferro e polimetacrilato dotata di impianti di condizionamento ambientale. La soluzione nutritiva, completa di tutti i macro e microelementi, sarà distribuita mediante sistema a goccia. Al fine di garantire l ottimale nutrizione idrica e minerale della pianta, la gestione della fertirrigazione avverrà mediante l ausilio di sonde di lettura dell umidità del substrato ECH 2 O EC-5 Moisture Sensor (Decagon Device) in grado di attivare in automatico 82

83 le pompe di irrigazione. La prova sarà predisposta secondo un modello sperimentale a blocchi randomizzati con 3 ripetizioni. Sui frutti di pomodoro, alla raccolta saranno determinati i solidi solubili totali, l acidità titolabile, la sostanza secca ed il contenuto di Na, K, Mg e Ca tramite cromatografia ionica. La determinazione della concentrazione di metalli pesanti negli organi vegetali (foglie, radici e frutti) sarà effettuata, previa dissoluzione acida assistita da microonde del campione, mediante spettroscopia di emissione al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES o ICP-MS) o voltammetria di stripping anodico, a seconda del metallo e delle concentrazioni da rilevare. L attività consentirà di valutare l attitudine ad accumulare metalli pesanti delle diverse cultivar e nei diversi organi della pianta. Attività b - Screening varietale su cultivar di lattuga allevate senza suolo su substrato a base di compost (RI) I due compost individuati nella task saranno utilizzati come substrato anche per la coltivazione senza suolo in serra di lattuga. Anche in questo caso sarà previsto un substrato di confronto costituito dal miscuglio torba: perlite (1:3 v/v). Per la lattuga verranno individuate 6 cultivar scelte tra quelle più diffuse al momento della prova. Le piante saranno allevate in vasi da 5 L posti su canalette in allumino, in serra dotata di impianti di condizionamento ambientale. La soluzione nutritiva, completa di tutti i macro e microelementi, sarà distribuita mediante sistema a goccia. Anche per la lattuga la gestione della fertirrigazione avverrà mediante l ausilio di sonde di lettura dell umidità del substrato ECH 2 O EC-5 Moisture Sensor (Decagon Device) in grado di attivare in automatico le pompe di irrigazione. Verranno realizzate due prove agronomiche in due momenti. La prova sarà predisposta secondo un modello sperimentale a blocchi randomizzati con 3 ripetizioni. Sul materiale vegetale raccolto saranno misurati il contenuto di sostanza secca e il tenore di nitrati (determinato con cromatografia ionica). La determinazione della concentrazione di metalli pesanti negli organi vegetali (foglie e radici) sarà effettuata, previa dissoluzione acida assistita da microonde del campione, mediante spettroscopia di emissione al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES o ICP-MS) o voltammetria di stripping anodico, a seconda del metallo e delle concentrazioni da rilevare. L attività consentirà di valutare l attitudine ad accumulare metalli pesanti delle diverse cultivar di lattuga e valutarne le quantità e la distribuzione nei diversi organi della pianta. Task Confronto tra sistemi di coltivazione (terreno vs. senza suolo) sull accumulo di metalli pesanti in pomodoro e lattuga (RI) Attività a - Coltivazione di pomodoro con sistema senza suolo e su terreno ammendato con compost (RI) In questa attività, la cultivar di pomodoro che avrà accumulato la minore concentrazione di metalli pesanti nei frutti sarà utilizzata in prove di coltivazione senza suolo e su terreno. Nel primo caso, il sistema senza suolo utilizzato sarà realizzato con le stesse modalità dell attività a. Nel secondo, la sperimentazione sarà condotta su terreno in serra all interno di mesocosmi (costituiti da contenitori in polietilene) riempiti con terreno e ammendati con i due compost individuati nella task Ogni mesocosmo riceverà una sola tipologia di compost. Le quantità di compost che saranno utilizzate per ammendare il terreno saranno definite in funzione del contenuto e delle esigenze in nutrienti delle orticole, oltre che delle eventuali disposizioni legislative in termini di distribuzione dei compost. Il suolo impiegato nella sperimentazione sarà caratterizzato per quanto riguarda la composizione chimica degli elementi maggioritari e in tracce (XRF e ICP-OES), nonché per la mineralogia (diffrazione di raggi X XRD) e i principali parametri chimico-fisici (ph, contenuto di carbonio organico, conducibilità, tessitura, capacità di scambio cationico, calcare totale, basi di scambio, metalli assimilabili). Tali determinazioni saranno effettuate sul terreno sia prima che dopo l aggiunta del compost. La disponibilità dei metalli pesanti, eventualmente apportati al suolo con il compost, verrà valutata mediante estrazioni sequenziali con reagenti dotati di capacità estraente crescente (metodo BCR o simili, da scegliere in base alle caratteristiche del terreno). La concentrazione dei metalli pesanti (Pb, Cd, Cr, Co, Ni, Zn, Cu e Mn) effettivamente assorbiti dalle piante sarà misurata sia sugli organi vegetali (radici, foglie e frutti) che sul percolato, mediante spettroscopia di emissione al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES o ICP-MS) o voltammetria di stripping anodico, a seconda del metallo e delle concentrazioni da rilevare. 83

84 Risultato di questa attività sarà il confronto dell accumulo di metalli pesanti in pomodoro allevato con due sistemi di coltivazione al fine di verificare i vantaggi del senza suolo e di valutare la trasferibilità dei risultati dai sistemi di coltivazione senza suolo a quelli tradizionali su terreno. Attività b - Coltivazione di lattuga con sistema senza suolo e su terreno ammendato con compost (RI) Le due cultivar di lattuga che avranno accumulato la minore concentrazione di metalli pesanti nella porzione edule saranno utilizzate in prove di coltivazione senza suolo e su terreno. Le relative analisi saranno condotte con le stesse modalità previste nell attività a. Risultato di questa attività sarà il confronto dell accumulo di metalli pesanti in lattuga allevata con due sistemi di coltivazione al fine di verificare i vantaggi del senza suolo e di valutare la trasferibilità dei risultati dai sistemi di coltivazione senza suolo a quelli tradizionali su terreno. Task Sviluppo di tecniche innovative per ridurre l accumulo di metalli pesanti in pomodoro e lattuga (RI) Attività a - Effetto della tecnica dell innesto erbaceo sul contenuto di metalli pesanti in frutti di pomodoro da mensa (RI) Piante di pomodoro appartenenti alla cultivar che si sarà caratterizzata per aver accumulato più metalli pesanti nel corso della prova di screening varietale (Attività 6.2.2a ) saranno innestate su due portainnesti tra quelli presenti sul mercato (Beaufort', He Man', Maxifort, Energy, KNVF, PG 3, Abaco, CLX 3798, e Arnold ). Le piante saranno allevate sia senza suolo che su terreno utilizzando i protocolli sperimentali già testati per entrambi i sistemi nella precedente attività (6.2.3.a). Sarà inoltre previsto un testimone non innestato. La valutazione dell accumulo di metalli pesanti nelle piante di pomodoro sarà effettuata secondo le modalità già descritte nelle precedenti attività. Risultato di questa attività sarà di individuare il portainnesto di pomodoro da mensa idoneo a garantire un prodotto edule a ridotto contenuto di metalli pesanti. Attività b - Influenza della gestione della soluzione nutritiva (nutrizione azotata/ph) sull accumulo di metalli pesanti in piante di lattuga (RI) Piante di lattuga delle due cultivar che avranno evidenziato il maggior accumulo di metalli pesanti nel corso della prova di screening varietale (Attività a) saranno allevate in vaso con la tecnica già descritta ed alimentate con soluzioni nutritive con lo stesso livello di macro e micronutrienti, ma con diversa gestione della nutrizione azotata attraverso specifici rapporti tra le forme azotate in modo da realizzare condizioni di ph diversificate per studiare le relazioni tra l assorbimento delle forme di azoto e quello dei metalli pesanti. In questo esperimento sarà utilizzato il compost in cui sarà stato riscontrato il più elevato contenuto di metalli pesanti e nelle stesse quantità previste nella prova di confronto terreno/senza suolo (Attività b). Risultato di questa attività sarà di individuare una strategia nella gestione della soluzione nutritiva in sistemi di coltivazione senza suolo finalizzata alla riduzione del contenuto di metalli pesanti in due cultivar di lattuga. Attività c - Valutazione dei processi che portano ad un ridotto accumulo di metalli pesanti in piante di pomodoro e lattuga mediante analisi con luce di sincrotrone Piante di pomodoro e lattuga che hanno evidenziato il maggior accumulo di metalli pesanti ed allevate con le tecniche innovative descritte in a e b potranno essere studiate con raggi X di sincrotrone per valutare i processi che hanno permesso di ridurre l accumulo di metalli pesanti, in confronto con le piante allevate con metodi tradizionali. In particolare, le piante in oggetto saranno congelate rapidamente in azoto liquido ed analizzate, a seconda che si tratti di foglie, radici o frutti mediante microscopia di fluorescenza di raggi X di sincrotrone (µ-xrf), µ-xrf confocale o tomografia di fluorescenza di raggi X (CT-XRF) per determinare la distribuzione degli elementi traccia nei vari organi delle piante. Tale determinazione permetterà di valutare il modo in cui le piante sono in grado di assorbire e immagazzinare i metalli traccia all'interno dei vari organi. Nelle analisi di fluorescenza di raggi X, i raggi incidenti sul campione saranno focalizzati ad una dimensione di µm mediante una lente policapillare. Muovendo il campione così irraggiato sarà possibile ottenere mappe bidimensionali di distribuzione elementare per i vari metalli pesanti in esame. Questo approccio è particolarmente utile per analizzare aree di interesse nelle foglie. Per studiare le radici o i frutti sarà invece necessario ricorrere a tecniche di imaging tridimensionale come la fluorescenza di raggi X confocale o la 84

85 microtomografia. Nelle analisi di fluorescenza confocale, i raggi X incidenti sul campione saranno focalizzati ad una dimensione di µm mediante una lente policapillare, così come i raggi X di fluorescenza emessi da volumi microscopici di materia all'interno del campione saranno convogliati verso il detector mediante un'altra lente policapillare specifica. Negli esperimenti di microtomografia di fluorescenza di raggi X, il campione verrà opportunamente ruotato e traslato all'interno di un raggio incidente di circa10-20 µm, prodotto da una lente capillare e i raggi X di fluorescenza prodotti, saranno raccolti da un detector posizionato a 90 rispetto al raggio incidente. In questo modo, si otterranno dei sinogrammi elementari (mappe x, ) che, dopo un'appropriata ricostruzione, saranno trasformati in tomogrammi elementari (mappe x,z), che daranno informazioni sulla distribuzione dei vari elementi all'interno di una sezione virtuale del campione. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Presso l ISPA-CNR sono presenti germinatoi, impianti di coltivazione senza suolo, serre e pieno campo (ubicati presso l Azienda Sperimentale La Noria Mola di Bari) dotati delle automazioni necessarie alla gestione della coltivazione (preparazione, controllo e automazione della erogazione delle soluzioni nutritive) ed alla misura dei parametri climatici ambientali, oltre che laboratori per le determinazioni dei parametri chimico-fisici di substrati, delle soluzioni nutritive e dei prodotti eduli. La competenza scientifica è comprovata dalla pubblicazione di articoli scientifici su riviste italiane e internazionali, capitoli di libro e monografie relative alle specie orticole, progetti regionali, nazionali e internazionali riguardanti la qualità dei prodotti orticoli e il compostaggio di materiali alternativi. Presso il Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex DiBCA) dell Università degli Studi di Bari sono disponibili tutte le attrezzature per la preparazione dei campioni e le strumentazioni per le analisi di metalli in tracce. Inoltre, il DiSSPA (Ex DiBCA) dispone di appropriate conoscenze nell analisi di metalli pesanti, anche con raggi X di sincrotrone, in suoli, compost e vegetali come dimostrano le numerose pubblicazioni scientifiche prodotte su prestigiose riviste internazionali e la partecipazione a progetti nazionali e internazionali riguardanti lo studio di elementi traccia nell ambiente e nel sistema suolo-pianta. - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Tutte le attività saranno localizzate presso le strutture dell ISPA-CNR di Bari e del DiSSPA dell Università degli Studi di Bari, ad ecezione dell Attività c che è localizzata solo presso il DiSSPA. - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a - ISPA-CNR Bari: Identificazione e raccolta compost, caratterizzazione fisica (conducibilità elettrica, densità apparente, porosità totale, densità specifica, capacità per l aria, capacità per l acqua, acqua facilmente disponibile, acqua di riserva e acqua non disponibile), saggi biologici - Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex DiBCA): Caratterizzazione chimica dei compost: determinazione di ph e degli elementi maggioritari e in tracce, con particolare attenzione rivolta ai metalli pesanti tra cui Cromo (Cr), Cobalto (Co), Nichel (Ni), Zinco (Zn), Rame (Cu), Piombo (Pb), Cadmio (Cd) e Manganese (Mn). Attività a - ISPA-CNR Bari: prove agronomiche su pomodoro da mensa coltivato senza suolo. Caratterizzazione qualitativa dei frutti (solidi solubili totali, l acidità titolabile, la sostanza secca ed il contenuto di Na, K, Mg e Ca). Produzione. 85

86 - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): Determinazione di metalli pesanti : Cr, Co, Ni, Zn, Cu, Pb, Cd e Mn in radici, foglie e frutti. Attività b - ISPA-CNR Bari: prove agronomiche su cultivar di lattuga coltivata senza suolo. Caratterizzazione qualitativa (sostanza secca e nitrati). Produzione. - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): determinazione di metalli pesanti: Cr, Co, Ni, Zn, Cu, Pb, Cd e Mnin radici e foglie. Attività a - ISPA-CNR Bari: prove agronomiche su pomodoro da mensa coltivato senza suolo e su terreno. Caratterizzazione qualitativa dei frutti (solidi solubili totali, acidità titolabile, sostanza secca ed contenuto di Na, K, Mg e Ca). Produzione. - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): caratterizzazione mineralogica e chimicofisica del terreno. Valutazione della disponibilità dei metalli pesanti nel suolo prima e dopo l aggiunta di compost.determinazione di metalli pesanti: Cr, Co, Ni, Zn, Cu, Pb, Cd e Mn in radici, foglie e frutti. Attività b - ISPA-CNR Bari: Prove agronomiche su cultivar di lattuga coltivata senza suolo e su terreno. Caratterizzazione qualitativa (sostanza secca e nitrati). Produzione. - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): determinazione di metalli pesanti: Cr, Co, Ni, Zn, Cu, Pb, Cd e Mn in radici e foglie. Attività a - ISPA-CNR Bari: prove agronomiche su pomodoro da mensa innestato su terreno e senza suolo. Caratterizzazione qualitativa dei frutti (solidi solubili totali, l acidità titolabile, la sostanza secca ed il contenuto di Na, K, Mg e Ca). Produzione. - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): Determinazione di metalli pesanti: Cr, Co, Ni, Zn, Cu, Pb, Cd e Mn in radici, foglie e frutti. Attività b - ISPA-CNR Bari :Prove agronomiche su cultivar di lattuga coltivata su terreno e senza suolo. Caratterizzazione qualitativa (sostanza secca e nitrati). Produzione. - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): Determinazione di metalli pesanti: Cr, Co, Ni, Zn, Cu, Pb, Cd e Mn in radici e foglie. Caratterizzazione del terreno. Attività 6.2.4c - Università degli Studi di Bari - DiSSPA (Ex DiBCA): Analisi di diversi organi di pomodoro e lattuga mediante luce di sincrotrone OR 7 - STRUMENTI DI CONTROLLO INNOVATIVI PER LA DETERMINAZIONE DI METALLI PESANTI E MICRORGANISMI PATOGENI IN PRODOTTI FRESCHI OS7.1: Sistemi innovativi per la diagnosi rapida di metalli pesanti in prodotti freschi Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: Università del Salento, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali DiSTeBA (Ex Dipartimento di Ingegeneria dell Innovazione DII); ISPA-CNR; Biotecgen s.r.l.) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Messa a punto di sistemi innovativi per la rivelazione di metalli pesanti in matrici alimentari mediante la spettroscopia ATR-FTIR e microbilance piezoelettriche (RI, SS) Attività a - Spettroscopia IR su prodotti freschi (RI) Le bande d assorbimento IR di gruppi ligandi subiscono un notevole spostamento dei rispettivi massimi passando dalla forma libera a quella complessata con metalli pesanti. Pertanto verrà utilizzata la spettroscopia IR per studiare la presenza di alcuni dei principali metalli pesanti (nichel, cobalto, piombo, cadmio e cromo) nei prodotti ortofrutticoli freschi (pomodoro, lattuga). Nella fase iniziale della ricerca tale 86

87 approccio sarà utilizzato per studiare i complessi tra i diversi ioni metallici tossici e specifiche componenti chimiche degli alimenti (proteine, carboidrati, acidi grassi o componenti minoritarie come fibre e polifenoli). La presenza del metallo sarà rivelata inducendo un suo allontanamento dalla matrice alimentare mediante blando trattamento chimico e registrando i segnali differenziali originati dalla decomplessazione dei gruppi ligandi. In tal modo l acquisizione degli spettri differenziali darà utili informazioni sui principali siti di legame dei diversi metalli pesanti a specifiche componenti degli alimenti e rappresenterà un importante premessa per i successivi studi finalizzati all analisi quantitativa dei metalli e alla decontaminazione degli alimenti. Saranno studiate le cinetiche di rilascio di ciascun metallo pesante dai diversi prodotti alimentari in seguito a trattamento con acidi forti e deboli, chelanti e diverse concentrazioni saline, in modo da mettere a punto un idoneo trattamento per condurre l analisi spettroscopica in modalità differenziale. Prove analoghe di rilascio saranno condotte in funzione della temperatura. I risultati saranno: i) sviluppo di nuove strategie per l analisi qualitativa di ioni tossici (nichel, cobalto, piombo, cadmio, cromo) associati ai diversi ligandi presenti nelle matrici alimentari; ii) identificazione dei siti di accumulo preferenziali; iii) identificazione delle condizioni sperimentali che ne favoriscono il rilascio. Attività b - Spettroscopia IR su materiali idrofobici ad alta affinità per gli ioni metallici tossici (RI) Per ciascun metallo pesante (nichel, cobalto, piombo, cadmio, cromo) sarà analizzata la risposta spettroscopica nel range infrarosso indotta dall interazione con diversi materiali idrofobici naturali e sintetici. Tali materiali saranno utilizzati per la deposizione di film sottili su cristalli per riflettanza totale attenuata (ATR) inseriti in celle a flusso, che consentiranno il contatto tra lo strato attivo e il mezzo acquoso contenente gli analiti. Mediante spettroscopia ATR-FTIR differenziale sarà valutata la loro capacità di rispondere in maniera selettiva e sensibile alla presenza di ioni metallici nel mezzo acquoso. Per ciascun materiale saranno condotte prove di selettività (in maniera tale da discriminare qualitativamente i diversi metalli pesanti), sensibilità, stabilità, limite di rivelabilità, riproducibilità e rapidità della risposta, riutilizzabilità. Tali risultati consentiranno di sviluppare nuovi sistemi di sensing di ioni tossici in matrici acquose. I risultati saranno: i) selezione di materiali ad alta affinità e selettività per i metalli pesanti, idonei alla preparazione di strati attivi stabili da utilizzare in sensori chimici; ii) caratterizzazione chimico-fisica, mediante spettroscopia infrarossa, delle interazioni responsabili del sensing chimico; iii) sviluppo di sensori chimici a trasduzione ATR-FTIR. Attività c - Funzionalizzazione di cristalli di quarzo con specifici ligandi per l analisi degli ioni metallici con microbilance piezoelettriche (RI, SS) L attività si articolerà in due fasi: - Sviluppo di protocolli di trasferimento su cristalli di quarzo degli strati attivi selezionati (RI). Saranno condotte diverse prove di deposizione su quarzo dei migliori materiali selezionati mediante spettroscopia IR. Saranno utilizzate quattro principali tecniche di deposizione: casting, spin coating, Langmuir-Blodgett, Langmuir-Schafer. Per ciascun materiale selezionato sarà identificata la tecnica di deposizione ottimale e sarà analizzata la risposta piezoelettrica indotta dal legame con ciascun metallo anche in dipendenza del tipo e dello spessore del film. Tali risultati costituiranno un utile premessa per definire le prestazioni ottenibili da sensori piezolettrici da utilizzare come sistemi di analisi di specifici metalli pesanti estremamente economici e di semplice utilizzo. I risultati saranno: I) Sviluppo di protocolli sperimentali idonei al trasferimento su quarzo degli strati attivi selezionati per un utilizzo in microbilance piezoelettriche; II) Verifica delle prestazioni dei nuovi sensori anche in relazione ad alcune variabili sperimentali quali tipo e spessore del materiale depositato. - Verifica delle prestazioni di sensori piezoelettrici che utilizzano cristalli di quarzo opportunamente funzionalizzati (SS). Per ciascun metallo pesante saranno quindi individuati i parametri sperimentali ottimali in merito allo strato attivo, il relativo spessore e la tecnica di deposizione su quarzo piezoelettrico in grado di garantire le migliori prestazioni per l analisi di metalli pesanti in mezzo acquoso. Mediante l analisi di soluzioni standard e di campioni reali, il cui contenuto in metalli è noto, saranno condotte per ogni strato attivo depositato su quarzo prove di sensibilità per individuare il limite di rivelabilità, selettività per ciascun metallo pesante, stabilità nel tempo, rapidità di risposta, riutilizzabilità. I risultati saranno: I) Sviluppo di nuovi sensori piezoelettrici per la rivelazione di specifici metalli pesanti presenti in matrici alimentari; II) Verifica delle prestazioni e dell affidabilità dei nuovi sensori mediante analisi di campioni reali. 87

88 - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Tecniche microscopiche e spettroscopiche. Protocolli di estrazione di metalli pesanti da matrici alimentari. Tecniche di deposizione e caratterizzazione di film sottili per la preparazione di strati attivi. Tecniche microscopiche e spettroscopiche.tecniche di preparazione e deposizione di film sottili per la funzionalizzazione di cristalli di quarzo piezoelettrici. - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a: Università del Salento, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali DiSTeBA (Ex DII); ISPA-CNR Lecce. Attività b: Università del Salento, DiSTeBA (Ex DII); ISPA-CNR Lecce. Attività c: Università del Salento, DiSTeBA (Ex DII); Biotecgen s.r.l., Lecce - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a - Università del Salento Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali DiSTeBA (Ex DII); si occuperà delle misure di spettroscopia infrarossa. - ISPA-CNR Lecce studierà i principali siti di legame con i metalli pesanti e le condizioni sperimentali che modulano il rilascio di metalli pesanti dagli alimenti. Attività b - ISPA-CNR Lecce si occuperà della selezione e preparazione di materiali di origine naturale da destinare alla deposizione di strati attivi. - Università del Salento, DiSTeBA (Ex DII); si occuperà della deposizione dei film su cristalli ATR e dello studio della risposta ottica nel range infrarosso all interazione con i metalli. Attività c Università del Salento, DiSTeBA (Ex DII); svolgerà l attività in stretta collaborazione con Biotecgen s.r.l. che valuterà con attenzione le caratteristiche funzionali dei nuovi dispositivi da destinare all analisi di metalli tossici direttamente in azienda. OS7.2: Messa a punto di un prototipo per la diagnosi rapida di patogeni emergenti in molluschi bivalvi Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: Università degli Studi di Foggia, Dipartimento di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex PrIME, Laboratorio di Parassitologia); Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria Lab1 (ex attività Dipartimento MIDIM 1 ) e Lab2 (attività ex Dipartimento di Sanità Pubblica e Zootecnia DISPeZ); Bonassisalab srl) Task Allevamenti artificiali di molluschi edibili e spiking delle acque con protozoi zoonosici emergenti (RI) Attività a - Allestimento di acquari con molluschi esenti da contaminazione naturale di protozoi emergenti (RI) Un numero di esemplari di molluschi delle tre specie oggetto dell indagine (Mytilus galloprovincialis, Ostrea gigas, Tapes philippinarum) verrà acquistato da molluschicoltori della Regione ed un pool rappresentativo random (n. 60 per specie di mollusco) sarà esaminato tramite metodiche analitiche 1 Il Dipartimento di Medicina Veterinaria (già partner dell OS 7.2) svolgerà anche le attività di RI e SS che, in sede di presentazione del progetto, erano state affidate al Dipartimento di Clinica Medica, Immunologica e Malattie Infettive MIDIM dell Università degli Studi di Bari che non è più partner di progetto 88

89 molecolari di screening (totale analisi 540) per valutare un eventuale contaminazione naturale dagli agenti patogeni in esame (ossia Giardia, Cryptosporidium e Toxoplasma). Verificata l assenza nel campione rappresentativo di tali patogeni emergenti si procederà all allestimento di 36 acquari (di cui 27 per contaminazione e 9 controlli) contenenti acqua salata artificiale e tenuti a temperatura controllata. Per ciascuna specie di mollusco un numero rappresentativo di esemplari (n. minimo 300) provenienti da pool negativi ai tre agenti patogeni verranno collocati negli acquari. I molluschi verranno alimentati con mangimi tre volte la settimana e acclimatati per minimo 2 mesi circa prima dell infezione sperimentale. Attività b - Mantenimento in vitro dei ceppi di protozoi contaminanti (RI) Ceppi di cisti di Giardia, oocisti di Cryptosporidium e di Toxoplasma saranno acquisite da laboratori di riferimento e mantenute in vitro secondo protocolli standardizzati. In particolare, i trofozoiti di Giardia duodenalis saranno coltivati axenicamente in Keister s modified TYI-S-33 medium (ph 7.0) a 37 C, addizionato di bile bovina, siero fetale bovino, penicillina e streptomicina. Per la coltura di Cryptosporidium saranno utilizzate cellule HCT-8 coltivate in RPMI 1640 addizionato di siero fetale bovino, glutammina, sodio piruvato, penicillina e streptomicina. Le cellule verranno mantenute in fiasche per colture tissutali in atmosfera al 5% di CO 2 e 85% di umidità. Per Toxoplasma gondii le oocisti sono state labelled con anticorpi e I tachyzoiti contenute in camera di conta per quantificare lo spiking nei mitili nel range da oocisti e tachizoiti. Attività c - Contaminazione degli acquari (RI) Gli acquari contenenti i molluschi delle 3 specie oggetto di studio verranno contaminati con concentrazioni note e crescenti (10, , ) di cisti/oocisti purificate. Per ciascuna specie di mollusco saranno previsti gruppi di allevamenti di controllo (3 per specie). Task Rilevazione e quantificazione degli agenti patogeni nei molluschi contaminati e messa a punto di protocolli standardizzati mediante Real Time PCR (RI) Attività a - Trattamento campioni da analizzare (RI) Un numero significativo di molluschi (n. 60) sarà prelevato da ciascun acquario contaminato a 1, 7 e 14 giorni post contaminazione (p.c.) e da ciascun acquario controllo. Saranno prelevati quindi un totale di 6480 esemplari. I 60 esemplari di ciascun acquario verranno suddivisi in 2 pool da 30; da ciascun esemplare sarà aspirata l emolinfa, e rimossi il tratto gastrointestinale e le branchie. Verranno così ottenuti 3 sub-pool (emolinfa, ghiandole gastriche e branchie) per un totale di 648 macro-campioni da analizzare (6subpoolx36 acquari=216x3 tempi p.c.=648). Per tutti i campioni verranno previste almeno 6 aliquote; ciascuna aliquota verrà quindi sottoposta a congelazione a -20 C. Attività b - Determinazioni qualitative (RI) Una aliquota di 432 campioni (6 subpools x 24 acquari x 3 tempi p.c.) sarà sottoposta in doppio ad Immunofluorescenza diretta mediante Merifluor kit test (Meridian Diagnostic) per la rilevazione (screening) di cisti di Giardia e oocisti di Cryptosporidium da UNIBA-Lab1. Una seconda aliquota di 216 campioni (6 subpools x 12 acquari x 3 tempi p.c.) verrà analizzata da UNIBA-Lab2 e sarà sottoposta in doppio ad immunofluorescenza mediante anticorpi monoclonali (MAb) diretti contro oocisti di T. gondii. Quindi in questa fase, verranno complessivamente effettuate 1296 analisi (di cui 864 analisi per Giardia/Cryptosporidium e 432 per Toxoplasma). Attività c - Determinazioni quantitative e messa a punto di protocolli per Real Time (RI) La terza, la quarta, la quinta e la sesta aliquota, ognuna di 216 campioni (6 subpools X 12 acquari X 3 tempi p.c.), verrà trasferita ai 4 laboratori per le prove molecolari che consistono nella:- estrazione del DNA mediante kit commerciali; - amplificazione del DNA di Giardia (UNIBA-Lab1), Cryptosporidium parvum (UNIFG) e Cryptosporidium hominis (Bonassisalab) e Toxoplasma (UNIBA-Lab2) mediante Real Time PCR. Ciascun laboratorio, per la messa a punto del protocollo finale, avrà la necessità di provare, sui 216 campioni da analizzare in doppio, almeno 3 diversi protocolli con 3 diversi parametri di reazione e concentrazioni dei reagenti; inoltre, per ciascuno protocollo, saranno valutate diverse coppie di primers specifiche per i tre differenti agenti patogeni al fine di ottenere i protocolli migliori in termini di resa, sensibilità e specificità. Ogni laboratorio, pertanto, per la messa a punto del protocollo finale effettuerà

90 analisi. Per ciascun patogeno sarà individuato il protocollo che fornirà il valore più elevato di sensibilità e specificità per ciascuna matrice biologica ai diversi tempi e alle diverse concentrazioni di microrganismi impiegati. Alla fine dovranno essere messi a punto 4 protocolli di Real Time PCR, uno per ciascun LAB e quindi uno specifico per ogni patogeno. I protocolli messi a punto costituiranno la base di partenza per la messa a punto della piattaforma diagnostica miniaturizzata. Task Messa a punto della piattaforma (RI) Attività a Messa a punto della piattaforma (RI) L attività prevede di dimostrare che la piattaforma real-time PCR, così come sviluppata dal consulente STMicroelectronics ed adattata ai protocolli messi a punto dai 4 laboratori partner della ricerca, è il sistema adatto alla rivelazione e quantificazione di acidi nucleici (DNA o RNA) in esame in quanto a sensibilità, specificità e precisione. Il sistema di real-time PCR permette l'identificazione di una singola sequenza nucleotidica per ogni pozzetto, ma si prevede di includere nella miscela di reazione due sonde, legate a due differenti fluorofori, per realizzare una tecnica di real-time PCR quantitativa multipla. Verrà analizzata in tempo reale l'amplificazione del materiale genetico, adattando i protocolli messi a punto dai 4 laboratori al nuovo sistema dal punto di vista dei volumi di reazione, fluorofori da utilizzare e protocolli termici. In questo modo si ridurranno i tempi di analisi, i costi e le possibilità di contaminazioni, inoltre aumenteranno la portata e l'automazione della tecnica. Task Costruzione del prototipo e verifica dello strumento (SS) Attività a. - Sviluppo prototipale e verifica da parte del consulente (SS) In questa fase verranno realizzati 4 prototipi. Verrà utilizzato un chip in silicio, materiale particolarmente adatto per la realizzazione dei cicli termici, caratterizzato da eccellenti proprietà termiche, che consentono un rapido trasferimento di calore alla miscela di reazione con cui è a contatto e un'ottima uniformità di temperatura all'interno della miscela stessa. Poiché le tecniche di produzione del lab-on-chip sono simili a quelle utilizzate per i circuiti integrati, è possibile utilizzare tutto il know-how e le linee di produzione preesistenti dell'azienda consulente (STMicroelectronics). Lo strumento di ciclatura termica, illuminazione e detection sarà sviluppato come sistema all-in-one e sarà completamente indipendente e modulare. Saranno utilizzate tecnologie USB o Bluetooth di connessione per permettere il funzionamento e l analisi dei dati anche in remoto. Attività b - Controverifica da parte dei laboratori partner nella ricerca (SS) Ognuno dei 4 laboratori partner nella ricerca (UNIFG, UNIBA-Lab1, UNIBA-Lab2 e Bonassisalab) riceverà un prototipo che testerà per la controverifica analizzando gli stessi campioni che avevano già analizzato nel WP3, però con strumentazione di laboratorio standard. Il materiale da impiegare saranno le aliquote già in precedenza fornite e disponibili nei diversi laboratori. Considerando che su 1 chip è possibile analizzare 2 campioni in doppio + controlli positivi e negativi ogni laboratorio disporrà di 108 chips per l analisi dei 216 campioni già in precedenza analizzati con strumentazioni standard di laboratorio. Attività c - Analisi dei risultati e valutazione statistica (SS) Dal confronto delle coppie di risultati verranno controverificate le funzionalità dei prototipi dai 4 Laboratori di ricerca. I risultati parziali ottenuti saranno elaborati, mentre i risultati finali saranno editati e analizzati statisticamente con una significatività minima del 95%. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente L Azienda e tutti i Partners possiedono il know-how e la strumentazione di base per la messa a punto dei protocolli di realtime. 90

91 - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a-c Università degli Studi di Foggia, Dipartimento di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell ambiente (Ex PrIME, Laboratorio di Parassitologia) Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria Lab1 (ex attività del MIDIM) e Lab 2 (attività ex Dipartimento di Sanità Pubblica e Zootecnia DISPeZ) Attività a-c Università degli Studi di Foggia, Ex PrIME Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria Lab1 (ex attività del MIDIM) e Lab 2 (attività ex Dipartimento di Sanità Pubblica e Zootecnia DISPeZ) Bonassisalab srl, Foggia Attività a Bonassisalab srl, Foggia STMicroelectronics (sede di Lecce, Consulente) Attività a-c Bonassisalab srl, Foggia STMicroelectronics (sede di Lecce, Consulente) - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a-c Università degli Studi di Foggia, Ex PrIME, Laboratorio di Parassitologia: acquisto molluschi, allestimento e mantenimento in laboratorio degli allevamenti di molluschi; analisi per valutare l assenza nei molluschi di contaminazione naturale dai 3 patogeni oggetto dell indagine; contaminazione degli acquari; Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria Lab1 (ex attività del MIDIM): allestimento di colture e mantenimento in vitro dei ceppi di Giardia duodenalis e Cryptosporidium spp.; Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria Lab 2 (attività ex DISPeZ): allestimento e mantenimento in vitro dei ceppi di Toxoplasma gondii. Attività a-c Università degli Studi di Foggia, Ex PrIME, Laboratorio di Parassitologia: prelievi e standardizzazione di protocolli di RealTime PCR per Giardia duodenalis nei propri laboratori; Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria Lab1 (ex attività del MIDIM): analisi di screening di Giardia e Cryptosporidium; prelievi e standardizzazione di protocolli di RealTime PCR per Cryptosporidium parvum nei propri laboratori; Bonassisalab srl: standardizzazione di protocolli di RealTime PCR per Cryptosporidium hominis nei propri laboratori; Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria Lab 2 (attività ex DISPeZ): analisi di screening di Toxoplasma; standardizzazione di protocolli di RealTime PCR per Toxoplasma gondii nei propri laboratori. Attività a Università degli Studi di Foggia, Ex PrIME, Laboratorio di Parassitologia; Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria Lab1 (ex attività del MIDIM) e Lab 2 (attività ex DISPeZ); Bonassisalab srl: trasferimento delle informazioni su protocolli, reagenti e metodiche di sample preparation ulitizzati nei laboratori. - STMicroelectronics (sede di Lecce, Consulente): messa a punto della piattaforma, specifica per applicazioni di food detection; trasferimento delle informazioni su protocolli, reagenti e metodiche di 91

92 sample preparation ulitizzati nei laboratori; test e implementazione di protocolli sul sistema Real Time PCR sviluppato; eventuale modifica dei protocolli stessi per adattarli alle caratteristiche dello strumento. Attività 7.2.4a-c - Università degli Studi di Foggia, Ex PrIME, Laboratorio di Parassitologia; Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria Lab1 (ex attività del MIDIM) e Lab 2 (attività ex DISPeZ); Bonassisalab srl: controverifica della efficienza dei prototipi attraverso il confronto dei risultati delle analisi effettuate con il prototipo ed i risultati delle analisi degli stessi campioni determinati con strumentazioni da laboratorio standard; - STMicroelectronics (sede di Lecce, Consulente): costruzione di 4 prototipi e verifica delle funzionalità sulla base di protocolli stabiliti e confronto con i risultati ottenuti da strumentazione di laboratorio standard. OS7.3: Sviluppo di sistemi di allerta rapidi per la presenza di patogeni Gram Positivi (Listeria) e negativi (Salmonella) in tagli bovini prima della destinazione d uso Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: ISPA-CNR; Ciullo Carni srl; Biotecgen srl) - Attività di RI e SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifici Task Analisi bioinformatica e progettazione e sperimentazione di DNA arrays (RI) Attività a - Ricerca in banca dati e disegno di sonde specifiche (RI) Sarà effettuato l allineamento multiplo di sequenze geniche in GenBank utilizzando ClustalW, su un centinaio di ceppi di patogeni e specie vicine, e sarà effettuata una ricerca per aggiornare i lavori pubblicati in precedenza per rilevare nuovi polimorfismi nelle sequenze presenti nei database (rpob, inva, ipab, tyv, prt, listeriolisina, aro-a e pho-a). Saranno studiati diversi geni non utilizzati in precedenza adatti al differenziamento tra ceppi patogeni e non patogeni, e regioni oligonucleotidiche da sfruttare nei DNA microarrays. Sarà consultato il sito di raccolta delle regioni uniche ( batteriche e dei ceppi per mappare le differenze cromosomiche e plasmidiche e differenze nei geni cse1, cse2, cse3, cse4, cas1, cas2 (endonucleasi e enzimi del sistema antivirale CRISPR). Gli allineamenti multipli costituiranno una raccolta multimediale utile per altri ricercatori nel campo della diagnostica. I primers saranno testati sui vetrini per le proprietà fisicochimiche di ibridazione con gli amplificati di PCR, per evidenziare eventuali regioni di binding aspecifico. Attività b - Analisi e messa a punto di analisi di PCR su colture pure per validare i primers (RI) Saranno effettuate test di amplificazione PCR con i primers disegnati sulle sequenze specifiche utilizzando DNA estratto dalle specie patogene (su una collezione di ceppi) e specie non patogene (ceppoteca acquisita, L. innocua, L. ivanovii, L. welshimeri, L. seeligeri, enterobatteri), per verificare che non diano luogo ad amplificati di PCR non-specifici (di dimensione simile o diversa). Eventuali modifiche saranno effettuate nella scelta delle regioni e nella composizione delle basi nucleotidiche, tenendo conto di necessarie differenze di sequenza dal controllo di amplificazione interno (plasmide) presente nelle PCR per evidenziare l avvenuta reazione di amplificazione. Il protocollo di PCR sarà ottimizzato nei suoi elementi (percentuale di magnesio, temperatura di annealing, ecc.). Attività c - Analisi di ibridazione risultato di PCR (RI) Nel corso di questa attività verrà effettuata una analisi di ibridazione delle sonde oligonucleotidiche mediante microarray per la rilevazione del risultato di PCR. L amplificazione PCR in Real-Time con primers multipli sarà in grado di rilevare, identificare e differenziare i microrganismi dei due patogeni da individuare. Saranno messi a punto ed ottimizzati metodi diversi di amplificazione del DNA (esponenziale o lineare) da sfruttare per la marcatura e la detection specie-selettiva, usando o primers fluorescenti oppure primers padlock da circolarizzare con reazione rolling cyrcle amplification (RCA), forniti di tags LDR-ZIP per l utilizzo su piattaforma OpenArray. Le sequenze individuate saranno adattate ad un DNA microarrays per effettuare una identificazione dei patogeni su vetrino (chip), e saranno messi a punto i metodi di rilevamento del segnale mediante lettura della fluorescenza o altra proprietà fisico-chimica (sprettroscopia Raman, gold nanoparticles). 92

93 Attività d - Sequenziamento di prodotti di amplificazione PCR per verificare i risultati (RI) Obiettivo dell attività è il disegno di nuovi primers e sonde specifiche per i patogeni considerati e il test dell efficienza a seguito di una nuova reazione di PCR in multiplex effettuata su colture pure. L analisi troverà conferma all interno dell attività c - nel test effettuato tramite ibridazione con microarray e nel sequenziamento dei prodotti di amplificazione ottenuti. Task Analisi su Matrice Complessa (RI) Attività a - Messa a punto di un protocollo di estrazione di DNA batterico da campioni contaminati artificialmente (RI) Messa a punto di un protocollo di estrazione di DNA batterico da campioni contaminati artificialmente (ottimizzazione dell applicazione di kit commerciali dopo valutazione del metodo migliore, su campionamento diretto e su pre-arricchimento in coltura liquida). Saranno messi a punto ed ottimizzati metodi per l estrazione del DNA privo di inibitori enzimatici (sangue, emoglobina). Attività b - Messa a punto di protocolli di preparazione degli estratti batterici (RI) Gli estratti batterici saranno preparati con un kit a elevata efficienza e i protocolli saranno modificati seguendo le valutazioni sui risultati ottenuti. La separazione del DNA sarà effettuata mediante beads magnetizzate (Solulink) e immobilizzazione delle biglie con DNA carrier specie-specifico. Attività c - Analisi comparativa con metodiche di biologia classica, e selezione del brodo di coltura idoneo per recuperare cellule anche stressate delle due specie patogene (RI) Campioni alimentari contaminati con batteri patogeni saranno testate in uno studio interlaboratorio tra ISPA- CNR e Biotecgen. Metodiche di prearricchimento in coltura liquida saranno applicate per aumentare la quantità di DNA batterico e per effettuare le analisi dei ceppi. Cellule vitali ma non coltivabili saranno saggiate su vari terreni di coltura con proprietà rivitalizzanti e in presenza di coliformi e altri batteri normalmente presenti sulle carni con capacità di inibire la crescita dei patogeni nel terreno. Si prevede di incubare una serie di tamponi di campionamenti da carni e ambientali in coltura liquida (prearricchimento) a diverse ore di crescita, per ottenere una serie di concentrazioni crescenti. Attività d - Definizione dei limiti di rilevabiltà del metodo (RI) La sensibilità del metodo di PCR sarà valutata, misurando il limite di rilevazione e la soglia di utilizzo, corrispondente ad almeno una unità contaminante in 25 g di campione, o 1-10 copie di DNA bersaglio per reazione. Si misurerà la frequenza di risultati positivi a varie concentrazioni di acidi nucleici bersaglio in presenza di specie patogene e non patogene. L accuratezza analitica e diagnostica del metodo PCR sarà determinata. Si valuterà il livello di positività della reazione di PCR usando ceppi batterici bersaglio e nonbersaglio (non patogeni). La selettività della PCR sarà testata per l inclusività (rilevazione di DNA di batteri patogeni di ceppi differenti) ed esclusività (assenza di positività di una serie di ceppi non bersaglio). Task Messa a punto di sistemi di rilevamento dei patogeni tramite protein chip biosensori, DNA microarrays, e immunosensori Lateral flow (RI, SS) Attività a - Selezione di anticorpi e target genomici per Salmonella spp. e Listeria monocytogenes (RI) In questa attività sarà valutata la selettività e l affinità degli anticorpi per i batteri patogeni di interesse. Si eseguirà pertanto, una ricerca degli anticorpi disponibili sul mercato per poter effettuare delle prove di caratterizzazione comparativa con l obiettivo di selezionare l anticorpo che presenta le proprietà migliori. I test che si eseguiranno per la caratterizzazione degli anticorpi monoclonali e/o policlonali prevederanno l esecuzione di diverse prove: SDS-PAGE seguita da Western blotting e quindi da immunoblotting per studiare la selettività degli anticorpi. A riguardo verranno utilizzati estratti proteici di vari ceppi di Salmonella e Listeria da confrontare con estratti proteici derivanti da diverse specie di batteri appartenenti ad altri generi. ELISA Sandwich. Le micropiastre per ELISA a 96 pozzetti saranno attivate con anticorpi policlonali verso Salmonella e Listeria alla concentrazione di 20 ug/ml in PBS, incubate per una notte a 4 C, quindi saturate con PBS contenente BSA 1% a 4 C per 2 ore. Per il dosaggio verranno utilizzate sospensioni batteriche 93

94 standard e di controllo negativo incubandole con gli anticorpi presenti nelle piastre per 1 ora a 37 C. Dopo un ulteriore lavaggio saranno dispensati 100 ul/pozzetto degli anticorpi monoclonali prodotti o acquistati e la piastra verrà incubata per 1 ora a 37 C. Dopo un ulteriore lavaggio saranno dispensati 100 ul/pozzetto di anticorpo secondario coniugato con per ossidasi di rafano e verrà effettuata un incubazione al buio per 30 min a 25 C. La rivelazione colorimetrica verrà effettuata mediante substrato cromogeno per perossidasi (HRP) leggendo la densità ottica a 492 nm con un lettore a micropiastre. Attività b - Selezione di superfici idonee di microarrays per il biosensore e messa a punto di un protocollo per l immobilizzazione degli anticorpi (RI) A tale scopo verrà sviluppato un sistema protein chip per il rilevamento di Salmonella e Listeria. Questo dispositivo prevede l utilizzo di vetrini da microscopio opportunamente funzionalizzati, su cui verranno immobilizzati anticorpi di cattura anti-analita, in una matrice ordinata di celle o spots, disposti in righe e colonne mediante sistemi robotizzati in grado di stampare molecole su supporti rigidi planari, in modalità rapida e con elevata riproducibilità. Per lo sviluppo del protein chip verranno selezionate superfici idonee, presenti in commercio, per l immobilizzazione degli anticorpi sul vetrino. Saranno inoltre valutate diverse strategie per l immobilizzazione dell anticorpo di cattura in maniera orientata, mediante saturazione del vetrino con proteina A o G, allo scopo di ottimizzare il legame con l analita. Il vetrino così stampato verrà ibridato con diluizioni scalari di analita (in cfu/ml del batterio in esame). L interazione anticorpo immobilizzato-antigene verrà successivamente rilevata mediante emissione della fluorescenza, in seguito ad ibridazione con un secondo anticorpo anti-analita marcato con fluorocromi. Tale dispositivo sarà impiegato per il rilevamento di diversi patogeni, oltre a Listeria monocytogenes e Salmonella typhimurium, saranno utilizzati Escherichia coli O157:H7, e L. innocua, valutando una soglia di rivelabilità intorno a 10 2 cfu/ml. La sensibilità del protein chip verrà ulteriormente ottimizzata con l aumento del rilevamento del segnale mediante coniugazione dell anticorpo rivelatore con Quantum dots mediante sistema biotina-streptavidina, che emettano fluorescenza in maggiore coerenza rispetto ai QD classici (miglioramento delle proprietà delle nanoparticelle) e/o applicazioni della FRET, da realizzare nell attività c. Per effettuare l analisi qualitativa rapida dei patogeni, sarà messo a punto anche un dispositivo immunosensore basato sul Lateral flow (Biotecgen srl). L analisi con tale mezzo avviene ponendo a contatto una superficie assorbente di nitrocellulosa con il campione opportunamente trattato, sottoposto ad una separazione cromatografica lungo il gradiente del solvente. Attualmente l esigenza di una diagnosi esatta e tempestiva, sia in campo medico che agroalimentare, ha portato allo sviluppo di numerosi kit immunocromatografici rapidi basati sul lateral flow (LF) per la rilevazione di batteri patogeni, tossine e virus. La positività/negatività del test è rivelata dalla comparsa sulla suddetta superficie di bande colorate e pertanto risulta facilmente eseguibile anche da personale non specializzato. In una prima fase verranno valutate le superfici di nitrocellulosa, presenti in commercio, per lo sviluppo del sistema del biosensore. Pertanto, saranno selezionati i materiali più opportuni e le procedure di attivazione della superficie stessa al fine di ottimizzare il legame con gli anticorpi di cattura. Inoltre verrà considerata la porosità delle membrane di nitrocellulosa in relazione alla dimensione delle particelle rivelatrici utilizzate (Quantum dots, particelle in lattice colorate, nanoparticelle di oro colloidale). Il sistema LF presenta al presente lo svantaggio di una bassa sensibilità. Le analisi svolte mediante questi kit fanno sempre riferimento ai gold standard rappresentati, per la maggior parte dei casi, dalle analisi colturali. Attualmente il limite di rivelabilità raggiunto con questa metodologia per alcuni patogeni è di circa cfu/ml. Il sistema lateral flow che si intende sviluppare sarà combinato alla tecnologia dei Quantum dots oppure alle nanoparticelle di oro colloidale permettendo di innalzare la sensibilità del sistema fino a renderlo in grado di diagnosticare la presenza di bassissime quantità di analita presenti in matrici alimentari. Pertanto, sarà valutata la soglia di rilevamento o sensibilità del metodo, la rapidità, e la facilità di esecuzione del test per la rivelazione circa la presenza/assenza del contaminante batterico (antigene). Attività c - Selezione di strategie per la rilevazione dei patogeni (RI) In questa fase verrà messa a punto una metodica per la coniugazione degli anticorpi monoclonali con le particelle.allo scopo di aumentare la sensibilità del sistema immunocromatografico verranno studiati diversi approcci per la coniugazione di sonde ed anticorpi. Gli anticorpi policlonali e monoclonali verranno coniugati in modo diretto od indiretto con Quantum Dot, particelle in lattice colorate ed oro colloidale. Si studierà la possibilità di posizionare su due epitopi ravvicinati un quantum dot (donore) ed una molecola 94

95 fluorescente (Cy5, accettore) e di sfruttare la reazione di fluorescence resonance energy transfer (FRET). Sarà valutato anche il metodo di marcatura Duo-Link, che permette una amiplificazione successiva al legame dell anticorpo con l antigene, per aumentare il segnale di oltre 100 volte. Coniugazione diretta. Per il metodo diretto verranno utilizzate particelle funzionalizzate presenti in commercio in grado di legarsi covalentemente ai gruppi amminici dell anticorpo. Coniugazione indiretta. Verrà eseguita mediante il sistema streptavidina-biotina utilizzando particelle rivelatrici coniugate con streptavidina ed anticorpi biotinilati. A tale scopo verrà sviluppata una metodica di biotinilizzazione degli anticorpi. Attività d - Messa a punto di una metodica per il trattamento del campione biologico (RI) Per il trattamento del campione biologico da saggiare sul test e del metodo ottimale di rilevamento del segnale saranno confrontati protocolli diversi, tamponi di estrazione, concentrazioni diverse di soluti, SDS, BSA, facilitatori della reazione, sali, sostanze proteggenti la struttura terziaria degli anticorpi, e saranno comparati diversi metodi di rilevamento del segnale, confrontandoli con il metodo di quantificazione del segnale di fluorescenza e il relativo rumore di fondo. Per la messa a punto di tamponi idonei volti a migliorare l omogeneità di distribuzione del campione lungo la superficie saranno confrontati protocolli diversi, tamponi di estrazione, concentrazioni diverse di soluti, SDS, BSA, sali, glicerolo, e altri composti come da protocolli già in uso. Attività e - Analisi della sensibilità e specificità e validazione del saggio con il campione biologico (SS) Comparazione del limite di sensibilità dei DNA microarrays con le metodiche immunologiche di protein chips ed il Lateral flow assay (LFA) e valutazione del livello di avanzamenti in termini scientifici rispetto a quanto già pubblicato. Si arriverà ad una stima di convenienza di uso rispetto alla Real Time PCR, misurata in ufc/ml. A conclusione della fase sperimentale, si effettueranno prove sul limite di rivelabilità dei principali metodi messi a punto, ossia i DNA arrays, i protein chips e gli LFA. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente - Elementi componenti, risultati già disponibili: alcuni anticorpi commerciali già testati per specificità e sensibilità; DNA arrays con alcune sonde già testate. Protocolli di esecuzione di analisi molecolari, ibridazione di DNA arrays e Protein chips. Metodi di rilevamento del segnale, diverse tecniche di marcatura (fluorescenza FRET, anticorpi e prodotti di PCR) e tecniche di amplificazione del segnale (padlock probes, anticorpi abbinati a oligonucleotide, tags a dendrimero e Rolling Circe Amplification). - Expertise dei partners, dell azienda consulente e del personale ISPA-CNR: microbiologia, coltura in terreni selettivi; Ceppoteca da utilizzare per gli esperimenti (ceppi ambientali e ceppi standard di riferimento); Disegno di primers e sonde oligonucleotidiche specie-specifiche PCR quantitativa Protein chips, metodiche di preparazione e applicazioni antigene-anticorpo DNA arrays, metodiche e applicazioni per l identificazione di sequenze e amplificati PCR; Real-Time PCR già testata almeno per una coppia di primers specie-specifici. - Attrezzature già disponibili: Laser Scanner Affymetrix, Spot Array 24 (Perkin Elmer), SOLiD next-gen sequencer (Applied Biosystems), Microscopio confocale Zeiss, Real-Time PCR 7500 Applied Biosystems. - Attrezzature da acquistare: Fotocamera CCD Evolve. - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Attività a-d: ISPA-CNR Lecce Attività 7.3.2a-d: ISPA-CNR Lecce; Ciullo Carni srl Attività a: ISPA-CNR Lecce Attività b: ISPA-CNR Lecce; Biotecgen srl Attività c: ISPA-CNR Lecce; Biotecgen srl, Lecce; Ciullo Carni, Taurisano (LE) Attività d: ISPA-CNR Lecce; Biotecgen srl, Lecce; Ciullo Carni, Taurisano (LE) Attività e: ISPA-CNR Lecce; Biotecgen srl, Lecce; SME (consulente); Ciullo Carni, Taurisano (LE) 95

96 - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Il Distretto Agro-alimentare Regionale DARe scrl, in qualità di soggetto attuatore, fornirà supporto alle attività di ricerca e sviluppo, curando la gestione tecnico-scientifica e coordinando i diversi soggetti coinvolti nel presente Obiettivo Specifico. Attività a-d - ISPA-CNR Lecce: eseguirà studi molecolari e disegno di nuove primers e sonde specifiche per i patogeni considerati. - Ciullo Carni eseguirà analisi e test di PCR. Attività a-d - ISPA-CNR Lecce: messa a punto metodiche (fissare i limiti di individuazione dei patogeni attraverso il protocollo messo a punto; si prevede di incubare una serie di tamponi di campionamenti da carni e ambientali in coltura liquida prearricchimento- a diverse ore di crescita, per ottenere una serie di concentrazioni crescenti). - Ciullo Carni: campionamenti, fase sperimentale. Attività a-e - Biotecgen affiancherà ISPA-CNR Lecce nella messa a punto di analisi mediante protein chips e di saggi utilizzanti anticorpi specie-specifici. - SME (Consulente) affianca Biotecgen e ISPA-CNR Lecce nella valutazione della sensibilità dei metodi e nel confronto tra la metodica microbiologica standard con le analisi innovative messe a punto (protein chips e dosaggi utilizzanti anticorpi specie-specifici) OR8 SCALE UP INDUSTRIALE DEGLI STRUMENTI PREVENTIVI, DI CONTROLLO E CORRETTIVI MESSI A PUNTO NEL PROGETTO OS8.1: Scale up degli strumenti preventivi messi a punto nel progetto (VINO / FRUMENTO / MOZZARELLA) Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: Università degli Studi di Foggia, Dipartimento di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex DiSA); ISPA-CNR; Cantine D Alfonso del Sordo srl; Cantele srl ISPA-CNR; C.D.P. srl Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex DiBCA); Centro Latte Stasi srl; Agriplan srl, Bari) - Attività di SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Sperimentazione su scala industriale di un protocollo biotecnologico che minimizzi lo sviluppo di lieviti di B. bruxellensis e che riduca la presenza di etilfenoli nel vino (SS) L applicazione dei risultati ottenuti su scala pilota nell OR1 sarà vagliata sul sistema reale. Il protocollo pianificato per minimizzare lo sviluppo di B. bruxellensis e di ridurre la produzione e la presenza di etilderivati in vino sarà testato su volumi industriali. Tale approccio permetterà di affrontare radicalmente il problema agendo a livello dei tre punti critici: i) inibizione dello sviluppo di B. bruxellensis in vino, ii) inibizione della produzione di etil-derivati, iii) diminuzione degli etilfenoli prodotti presenti nel vino. Il protocollo sarà testato secondo i disciplinari delle D.O.C. prodotte dalle aziende coinvolte, e saranno monitorati e quantificati sia B. bruxellensis che etil-derivati e relativi precursori. L identificazione e la quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino saranno realizzati con la tecnica real time PCR implementata nell attività a. La quantificazione degli etil-derivati e precursori in vino sarà effettuata mediante metodi cromatografici implementati nell attività b. Sarà valutata, quindi, la qualità globale del prodotto fornito mediante analisi di routine (etanolo, acido totale, acido volatile, acido malico, ph, acido lattico, glucosio, fruttosio e zuccheri riducenti), analisi dei composti responsabili della qualità sensoriale del vino mediante analisi sensoriale e tecniche cromatografiche per la determinazione quantitativa di ammine 96

97 biogene ed ocra tossina A. L ampio spettro di analisi realizzate in questa attività di sviluppo sperimentale sono funzionali a valutare la portata complessiva dell innovazione biotecnologica implementata. Task Sperimentazione su scala industriale di un prototipo per il trattamento delle cariossidi di frumento con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata al fine di prevenire/ridurre la contaminazione da microrganismi indesiderati e l infestazione da insetti (SS) L applicazione dei risultati ottenuti su scala pilota nell OR4 sarà valutata su scala semi-industriale. Il personale dell Azienda C.D.P. sarà formato dalla ditta che realizzerà il prototipo all utilizzo dello stesso, in collaborazione con l ISPA-CNR. Il prototipo verrà utilizzato in azienda per verificare a livello semiindustriale l efficacia dello stesso nel prevenire/ridurre lo sviluppo di insetti, batteri alterativi, funghi tossigeni e micotossine nelle cariossidi di frumento. A tale scopo verranno ottimizzati i parametri sperimentali (tempi di contatto, concentrazioni di ozono, temperatura di trattamento) senza alterare la qualità del frumento e delle farine. Verrà determinata la mortalità degli insetti e la riduzione della carica microbica e dei livelli di micotossine prima e dopo il trattamento con ozono e/o acqua ozonizzata e trattamenti in serie. Verranno valutati i parametri qualitativi colore, odore, acidi grassi, trigliceridi, proteine, zuccheri, vitamine delle cariossidi prima e dopo i due differenti trattamenti con ozono e dopo il trattamento in serie. Verranno inoltre verificati i costi di esercizio e la semplicità di utilizzo dei trattamenti. Task Sperimentazione su scala industriale di un protocollo biotecnologico che riduca i rischi di alterazione da Pseudomonas spp su latti di origine e storia tecnologica diversa (SS) Verrà valutata l attività anti-pseudomonas delle soluzioni sostitutive in condizioni aziendali. A tale scopo, una soluzione di acqua contenente 0,15% di NaCl autoclavata costituirà la base per la preparazione di soluzioni, destinate a sostituire il liquido di governo, contenenti: sospensione cellulare di L. plantarum DC400 e Na 2 -EDTA (50 mm); plantaricina e Na 2 -EDTA; sospensione cellulare del batterio lattico selezionato nell attività per l attività inibitoria nei confronti di P. fluorescens; MicroGARD ; lisozima e Na 2 -EDTA (50 mm); estratto di limone; estratto di salvia; ed agente acidificante (ph ca. 4.0). Le differenti soluzioni saranno inoculate con Pseudomonas fluorescens a diversi valori di densità cellulare (compresi tra 10 2 e 10 5 ufc/ml). Le prove saranno effettuate con mozzarella prodotta sia mediante acidificazione diretta sia mediante l impiego di starter commerciali. Le mozzarelle saranno conservate per 14 gg a differenti temperature: 4 C; 8 C; 8 C (1 h), 12 C (1 h), 8 C (22 h), 12 C (1 h), 8 C (fino a 14 giorni). Quest ultima condizione ha lo scopo di simulare la vita reale del prodotto, il quale può subire un innalzamento termico (in questo caso ipotizzato pari a 4 C) nelle fasi del trasporto e distribuzione. La condizione di temperatura a 4 C è una condizione ideale, mentre a 8 C si avvicina maggiormente ad una situazione reale. Il prodotto sarà sottoposto, dopo 7 e 14 giorni, ad analisi chimico-fisiche, microbiologiche e sensoriali. Per quanto riguarda queste ultime, sarà definito un protocollo di analisi sensoriale con il quale saranno individuati il numero di campioni da analizzare, i parametri di giudizio, e la scala di punteggio per ciascun parametro. Il panel sarà composto da un minimo di 10 assaggiatori. Almeno una tesi sarà selezionata in base alla capacità di contenere il batterio alterativo al di sotto di 10 6 ufc/g dopo 14 gg e di mantenere inalterate le caratteristiche qualitative del prodotto. La tesi che avrà consentito di contenere il batterio alterativo al di sotto di 10 6 ufc/g dopo 14 gg sarà oggetto di uno scale-up aziendale. Sarà verificata l applicabilità su scala industriale del protocollo sperimentale dimostratosi più efficace. Potrà essere necessario adattare tale protocollo alle condizioni aziendali. Gli adattamenti saranno definiti in fase di sperimentazione e potranno essere diversi a seconda della soluzione individuata. Un adattamento sicuramente necessario sarà rappresentato dalla non sterilizzazione della soluzione sostitutiva del liquido di governo, dal momento che tale operazione non è applicata a livello aziendale. Inoltre, in questa fase non sarà prevista la simulazione della contaminazione del liquido di governo con Pseudomonas spp. Al termine della produzione, le mozzarelle (sia quelle prodotte con acidificazione diretta, sia quelle prodotte con starter commerciali) saranno conservate a bassa temperature nella soluzione sostitutiva per 14 giorni. Le mozzarelle saranno sottoposte, congiuntamente ad una mozzarella conservata nel liquido di governo normalmente impiegato in azienda (controllo), alla determinazione della densità cellulare di Pseudomonas spp. ed alla valutazione delle caratteristiche sensoriali, mediante panel test effettuato dopo 7 e 14 gg di conservazione. In una fase immediatamente successiva, sarà prevista la realizzazione di 2 test di assaggio ( consumer test ) eseguiti, direttamente all interno di punti vendita, su un campione rappresentativo di una popolazione di consumatori. Gli intervistati saranno invitati ad esprimere il proprio giudizio di gradimento, comparando la mozzarella-controllo con quella ottenuta con il liquido di governo innovativo. Ai consumatori saranno sottoposte a valutazione mozzarelle ottenute da tre tipologie di latte: 1) locale; 2) importato; 3) arricchito con 97

98 proteine. Contemporaneamente, il protocollo di monitoraggio di Pseudomonas spp. messo a punto nel corso dell attività b dell OS6.1 sarà validato su scala industriale. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Task Le strumentazioni a disposizione dei partner di ricerca, che saranno impiegati nelle attività progettuali, sono: cappa chimica, cappa microbiologica, centrifughe, ultracentrifuga, termostati, liofilizzatore, criotermostato, microscopi ottici a contrasto di fase, invertiti, ad epifluorescenza, microscopio confocale a 3 laser, spettrofotometri, microplate readers, termociclatori PCR, termociclatori Real Time PCR, apparati elettroforetici per acidi nucleici, transluminatore, sequenziatore per acidi nucleici, apparati elettroforetici per proteine, VersaDoc Gel Imaging System, fermentatore da banco modulare, fermentatori per cellule vegetali e microrganismi, microvinificatori, FPLC-HPLC UV/visibile e a fotodiodi, gascromatografo, gascromatografo a spettrometria di massa. Task L ISPA-CNR ha notevole esperienza nelle analisi di micotossine, funghi tossigeni e batteri alterativi. Si avvarrà di un consulente per le analisi degli insetti. Per lo svolgimento delle attività l ISPA dispone di laboratori attrezzati per le analisi chimiche e microbiologiche nei prodotti agroalimentari. Tra le principali strumentazioni disponibili per le attività, compatibili con gli impegni richiesti dal progetto proposto e dagli altri in contemporaneo svolgimento, si possono elencare: sistemi per cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC e UPLC), cromatografo liquido-spettrometro di massa (LC-MS), spettrometro FT-NIR, sequenziatori di DNA e sistemi di sequenziamento PCR. Task Per lo svolgimento di tali attività, il Dipartimento delle Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex DiBCA) potrà contare sulla pluriennale esperienza che i suoi ricercatori hanno nel campo della microbiologia e tecnologia degli alimenti. In particolare, una significativa parte dell attività di ricerca è dedicata alla qualità sensoriale, microbiologica e nutrizionale dei derivati lattiero-caseari, ed alla messa a punto di innovazioni di processo e/o prodotto esclusive di tale categoria di alimenti. I ricercatori del DiSSPA (Ex DiBCA) vantano un buon record di pubblicazioni su riviste internazionali e capitoli di libri a divulgazione internazionale sia sui formaggi a pasta filata, sia sull uso di antimicrobici naturali. Il Centro Latte Stasi per lo svolgimento delle attività, può contare sull esperienza di un Dottore veterinario altamente qualificato. La società Agriplan srl. dispone al suo attivo di una lunga e comprovata esperienza nel settore dei servizi alle imprese per la ricerca e l innovazione nell agroalimentare, disponendo sia di un proprio staff tecnico che della disponibilità di esperti del settore. - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Task Azienda Vinicola Cantele srl, Guagnano (Lecce) Cantine d Alfonso del Sordo srl, San Severo (Foggia) Task C.D.P. srl, Altamura (Bari) Task Università degli Studi di Bari, DiSSPA (Ex DiBCA), Bari; Centro Latte Stasi srl, Molfetta (Bari) Bari; Agriplan srl, Bari 98

99 - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Task Università degli Studi di Foggia: Sperimentazione in azienda di un protocollo biotecnologico che minimizzi lo sviluppo di B. bruxellensis che riduca la presenza di etilfenoli nel vino (analisi molecolari). ISPA-CNR Lecce: Sperimentazione in azienda di un protocollo biotecnologico che minimizzi lo sviluppo di B. bruxellensis e che riduca la presenza di etilfenoli nel vino (analisi cromatografiche). Azienda vinicola Cantele srl: Sperimentazione in azienda di un protocollo biotecnologico che minimizzi lo sviluppo di B. bruxellensis e che riduca la presenza di etilfenoli nel vino (realizzazione vinificazioni e pratiche enologiche). Cantine d Alfonso del Sordo srl: Sperimentazione in azienda di un protocollo biotecnologico che minimizzi lo sviluppo di B. bruxellensis e che riduca la presenza di etilfenoli nel vino (realizzazione vinificazioni e pratiche enologiche). Task ISPA-CNR Bari: Ottimizzazione dei parametri sperimentali per prevenire/ridurre lo sviluppo di insetti, batteri alterativi, funghi tossigeni e micotossine nelle cariossidi di frumento; analisi dei batteri alterativi, funghi tossigeni e micotossine nelle cariossidi di frumento prima e dopo i trattamenti. - M.G. di Narducci Lucia & C. (Consulente): Formazione del personale dell azienda all utilizzo del prototipo generatore di ozono; analisi degli insetti. - C.D.P. srl: Sperimentazione in azienda e analisi dei parametri di qualità delle cariossidi prima e dopo i trattamenti. Task Il DiSSPA (Ex DiBCA) sarà impegnato nelle seguenti attività: analisi microbiologiche delle mozzarelle, valutazione dell influenza della materia prima sulla densità cellulare di Pseudomonas spp. in mozzarella Affiancamento dell impresa nell implementazione del protocollo biotecnologico innovativo per il controllo delle alterazioni da Pseudomonas spp. Centro Latte Stasi sarà impegnato nelle analisi chimico-fisiche e sensoriali della mozzarella e nello sperimentare su scala industriale il protocollo biotecnologico innovativo per il controllo di Pseudomonas spp. La società Agriplan coordinerà l attività di analisi sensoriale nelle sue fasi di pianificazione, attuazione e reporting, occupandosi in particolare della scelta degli assaggiatori, dell organizzazione dei panel test, della predisposizione dei questionari di valutazione, dell organizzazione dei dati e dell emissione del report di analisi. Nell attuazione dei consumer test ed elaborazione dei dati si avvarra della consulenza dello Studio Tecnico Associato dei Dr Agr. FABRIZIO DE CASTRO e Dr Agr. PIERNICOLA TONDO. OS8.2: Scale up degli strumenti di controllo messi a punto nel progetto (VINO / FRUMENTO / CARNI) Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: e Università degli Studi di Foggia, Dipartimento di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex DiSACD); Azienda Vitivinicola Incoronata; Cooperativa Lavorazione Prodotti Agricoli ISPA-CNR; Molini Tandoi Pellegrino spa ISPA-CNR; Ciullo Carni srl) Task Applicazione in condizioni operazionali della metodica basata sul biosensore doppio (SS) Questa attività prevedrà la valutazione delle potenzialità del biosensore doppio sviluppato nell OR2 nelle analisi di routine di glucosio e alcool in uva e vino. Le prestazioni saranno valutate nelle aziende partner mediante un controllo intensivo e simultaneo di glucosio ed alcool effettuato su differenti materie prime e prodotti durante tutte le fasi di trasformazione. Le prestazioni della metodica saranno verificate mediante la valutazione del tempo di start-up in condizioni operazionali, tempo necessario all allestimento del protocollo di analisi con biosensore doppio e fibra da 99

100 microdialisi. Saranno valutate, quindi, le prestazioni in termini di numero di campioni analizzabili giornalmente, nel rispetto delle esigenze dei processi di trasformazione, e di valutazione della riproducibilità tra operatori durante le sedute di analisi delle matrici reali. In parallelo saranno condotte le analisi classiche operanti in azienda per la determinazione di glucosio ed alcool, ed i risultati saranno confrontati statisticamente con quelli ottenuti con il biosensore. Le attività verranno svolte in un arco temporale di 18 mesi. Task Applicazione in condizioni operazionali della metodica analitica per la determinazione di ocratossina A (SS) Le conoscenze e le modalità analitiche innovative sviluppate nell OR2 saranno trasferite al laboratorio di controllo dell azienda. Le attività che verranno svolte durante questo periodo saranno in parte simili alle attività c dell OS2.1 ma attuate esclusivamente dal personale addetto sotto la supervisione dell ente di ricerca. In questa fase verrà valutata l efficacia della metodica analitica nella determinazione accurata dell OTA in condizioni quasi completamente automatizzate. Oltre al tempo necessario ad allestire la metodica, saranno valutati i parametri di prestazione, quali recupero, riproducibilità e precisione, mediante l analisi di numerosi campioni reali, effettuate durante tutte le fasi del processo vitivinicolo. Sarà anche valutata la velocità di campionamento e la riproducibilità tra operatori durante le sedute di analisi delle matrici reali. In parallelo saranno condotte le analisi classiche operanti in azienda, basate su saggi immunoenzimatici per la determinazione dell OTA, ed i risultati saranno confrontati statisticamente con quelli ottenuti con la metodica analitica. Task Validazione dell immunosaggio FP (SS) La validazione degli immunosaggi sviluppati verrà effettuata attraverso uno studio interlaboratorio tra i due partner (ISPA-CNR e Molini Tandoi Pellegrino srl) per valutare i valori di accuratezza e precisione dei metodi utilizzando sia campioni artificialmente contaminate, sia campioni naturalmente contaminati da micotossine. In particolare lo studio verrà effettuato per la determinazione di almeno due micotossine (da decidere) in almeno due matrici (da decidere). Verranno determinati i valori di recupero e delle deviazioni standard relative ad almeno tre livelli di contaminazione (basso, medio, alto) sia per i campioni artificialmente contaminati, sia per quelli naturalmente contaminati utilizzando il prototipo strumentale completamente automatico già disponibile presso i laboratori dell ISPA-CNR e che l azienda intende acquistare. Task Verifica dell efficacia dei metodi innovativi a biosensori/biochips (SS) Tali attività si porranno, in senso temporale, in maniera trasversale e non consequenziale rispetto alle attività di ricerca dell OS 7.3. Si studieranno i diversi processi di trasformazione ai quali le materie prime in entrata vengono sottoposte. Verranno individuati i punti critici e strategici in corrispondenza dei quali sarà necessario effettuare le analisi con le metodologie innovative in oggetto. I risultati ottenuti saranno comparati con quelli ottenibili attraverso le tecniche di microbiologia classica. Sarà infine implementato nel ciclo produttivo il metodo di detection sviluppato. Nello specifico si svolgeranno le seguenti attività: a) analisi del processo industriale e definizione di un piano di campionamento; b) comparazione tra differenti metodi di campionamento, metodo diretto e prearricchimento overnight; c) valutazione dell efficacia di campionamento e isolamento di batteri presenti sulle superfici della filiera; d) implementazione in azienda della metodologia per effettuare le analisi molecolari sui campionamenti ed implementazione dei metodi di detection sviluppati all interno del ciclo produttivo aziendale; e) valutazione dei risultati e della sensibilità dei nuovi metodi, comparati con la sensibilità del metodo tradizionale; f) valutazione dell efficacia e sensibilità dei metodi ed analisi innovative implementati confrontate con la metodica microbiologica standard durante tutta la filiera di trasformazione delle carni. Le prove saranno articolate in un doppio campionamento sulle carni e sull ambiente, e un set di campionamenti processati con metodo microbiologico ed un set di campionamenti processati con biosensori. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente Task Task Il gruppo di ricerca ha una grande esperienza nel campo della validazione di metodi analitici per il monitoraggio di sostanze di interesse alimentare, consolidata da numerose collaborazioni con enti pubblici 100

101 ed aziende private operanti nel settore del controllo di qualità e sicurezza alimentare. Da parte loro, anche le aziende hanno esperienza nei controlli di qualità e sicurezza dell intero processo produttivo di cantina, attuati, con metodi classici, nei rispettivi laboratori di analisi chimiche, fisiche e sensoriali. Task L ISPA-CNR ha esperienza pluridecennale nella validazione di nuovi metodi di analisi chimico-strumentali e immunometrici per la determinazione di micotossine in varie matrici agroalimentari. L ISPA-CNR ha esperienza in organizzazione di studi interlaboratorio secondo le linee guida AOAC (Association of Official Analytical Chemists) International ed è Laboratorio Indipendente per la validazione di metodi rapidi di analisi delle micotossine dell AOAC International. Per lo svolgimento delle attività l ISPA dispone di laboratori per le analisi chimiche e immunoenzimatiche di prodotti agroalimentari. Tra le principali strumentazioni disponibili si possono elencare: sistemi per cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC e UPLC), cromatografo liquido-spettrometro di massa (LC-MS), spettrometro FT-NIR, naso elettronico con tecnologia MOS (Metal Oxide Semiconductors), lettori di polarizzazione di fluorescenza. L azienda dispone di laboratori di controllo qualità attrezzato per svolgere analisi merceologiche e chimiche. Task Attrezzature a disposizione: Microscopio Zeiss Axoscope, ad immersione, 1000x, lettore a fluorescenza dotato di filtri. Da dotare di Camera CCD Evolve per quantificazione dei fotoni. Misurazioni riproducibili e confrontabili tra letture differenti. Vetrini per la preparazione dei biosensori. Protocollo di preparazione dei biosensori già sperimentato e validato: Trasferimento Tecnologico da ISPA-CNR a Ciullo Carni. Addestramento da parte di SME a personale Ciullo carni per i campionamenti già iniziato. Altro materiale è acquisibile da fornitori in loco (Schott per i vetrini, marcatori in fluorescenza da Invitrogen, Amersham e Anaspec). Anticorpi (Abcam). Sonde oligonucleotidiche (MWG; Invitrogen; Primm). - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Task Task Az. Vitivincola Incoronata, Borgo Incoronata (Foggia) - Cooperativa Lavorazione Prodotti, Corato (Bari) Task ISPA-CNR Bari - Molini Tandoi Pellegrino spa, Corato (Bari) Task Ciullo Carni srl, Taurisano (Lecce) - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Task Task L Università degli Studi di Foggia (Ex DiSACD), l Azienda Vitivincola Incoronata e la Cooperativa Lavorazione Prodotti saranno impegnati contemporaneamente nell attività dell Obiettivo Specifico. Task ISPA-CNR Bari: organizzazione dello studio interlaboratorio e preparazione dei campioni; partecipazione allo studio di validazione. - Molini Tandoi Pellegrino srl: partecipazione allo studio interlaboratorio. Task ISPA-CNR Lecce: comparazione tra differenti metodi di campionamento, metodo diretto e prearricchimento overnight; valutazione dei risultati e della sensibilità dei nuovi metodi, comparati 101

102 con la sensibilità del metodo tradizionale; affiancamento presso la Ciullo Carni srl nell esecuzione dei campionamenti e delle analisi molecolari. Ciullo Carni: esecuzione dei campionamenti; valutazione dei risultati e della sensibilità dei nuovi metodi, comparati con la sensibilità del metodo tradizionale. OS8.3: Scale up degli strumenti correttivi messi a punto nel progetto (VINO) Soggetto attuatore: D.A.Re. s.c.r.l (Soggetti Partner: ISPA-CNR; Fracchiolla srl) - Attività di SS necessarie per la realizzazione di ciascun obiettivo specifico Task Validazione in cantina dei protocolli di stabilizzazione delle vinacce, di ripasso dei mosti/vini e di gestione complessiva del processo di detossificazione (SS) I protocolli di stabilizzazione delle vinacce e di ripasso dei mosti/vini sulle stesse saranno validati in cantina utilizzando sia i serbatoi sperimentali che l impianto prototipale. Per attestare il mantenimento delle caratteristiche organolettiche dei mosti/vini dopo il ripasso si prevede di caratterizzare almeno 5 profili sensoriali di mosti/vini. Saranno eseguite almeno 5 prove di stabilizzazione delle vinacce o loro componenti su serbatoi-vinificatore. Saranno validati i parametri messi a punto con le prove eseguite nell attività Campioni di vinacce saranno prelevati a tempi prestabiliti per un periodo massimo di 30 gg e analizzati per la composizione microbica. Contemporaneamente saranno eseguiti i ripassi misurando le caratteristiche organolettiche dei mosti/vini prima e dopo i ripassi. L impianto prototipale in continuo sarà validato eseguendo almeno 3 processi di decontaminazione utilizzando lotti di mosti/vini naturalmente contaminati. In assenza di tali lotti si procederà alla contaminazione artificiale utilizzando estratti colturali da A. carbonarius.principale responsabile dell accumulo di OTA nelle uve. - Eventuali conoscenze, moduli, elementi componenti, risultati già disponibili in azienda o acquisibili commercialmente L ISPA dispone delle necessarie conoscenze e competenze tecnico-scientifiche sulla problematica specifica della contaminazione delle uve/vini da OTA (metodiche analitiche per la determinazione di OTA, tecniche e metodologie per l isolamento l identificazione e la caratterizzazione di microrganismi della filiera vitivinicola, metodi per la prevenzione della contaminazione da OTA e per la decontaminazione fisica e biologica di OTA e altre micotossine). Sarà inoltre necessaria laconsulenza enologica del Dr. Perrone Michelangelo. Inoltre i partner di progetto si avvarranno di una prestazione d opera da parte di una azienda produttrice che collaborerà alla fase di validazione del prototipo. - Localizzazione delle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Task Industrie Fracchiolla srl, Adelfia (Bari) ISPA-CNR Bari - Impegno dei singoli co-proponenti (soggetti attuatori/partner) e di eventuali soggetti terzi in relazione alle attività in cui si articolano i singoli Obiettivi Specifici Task ISPA-CNR Bari: coordinare e partecipare a tutte le attività di validazione, eseguire i campionamenti, le analisi chimiche, microbiologiche e sensoriali. Industrie Fracchiolla srl: assistenza tecnica sui serbatoi e sull impianto prototipale durante le prove di validazione 102

103 Consulenza enologica: collaborare con l ISPA al coordinamento delle attività di validazione, tra cui valutazione dell analisi dei parametri qualitativi e sensoriali dei vini, e vigilare sul corretto uso dei serbatoi e dell impianto prototipale. 8.3 Tempistica OR OR1 OS 1.1 OR 2 OS 2.1 OS 2.2 OS 2.3 OR 3 OS 3.1 OS 3.2 Mesi Attività A1.1.1.a A1.1.1.b A1.1.2.a A1.1.2.b A1.1.2.c A1.1.2.d A1.1.3.a A1.1.3.b A1.1.3.c A2.1.1.a A2.1.1.b A2.1.1.c A2.1.2.a A2.1.2.b A2.1.2.c A2.2.1.a A2.2.1.b A2.2.1.c A2.2.1.d A2.2.2.a A2.2.2.b A2.2.2.c A2.3.1.a A2.3.1.b A2.3.1.c A2.3.1.d A2.3.1.e A2.3.1.f A2.3.1.g A2.3.2.a A2.3.2.b A2.3.2.c A3.1.1.a A3.1.1.b A3.1.1.c A3.1.2.a A3.1.2.b A3.1.3.a A3.1.3.b A3.1.4.a A3.1.4.b A3.2.1.a A3.2.1.b 103

104 OR 4 OS 4.1 OR 5 OS 5.1 OS 5.2 OS 5.3 OS 5.4 OR 6 OS 6.1 OS 6.2 A3.2.1.c A3.2.2.a A3.2.2.b A3.2.2.c A3.2.3.a A3.2.3.b A4.1.1.a A4.1.1.b A4.1.1.c A4.1.2.a A4.1.2.b A5.1.1.a A5.1.1.b A5.1.2.a A5.1.2.b A5.2.1.a A5.2.1.b A5.2.1.c A5.2.1.d A5.2.1.e A5.2.1.f A5.2.2.a A5.2.2.b A5.2.2.c A5.2.2.d A5.2.2.e A5.2.2.f A5.3.1.a A5.3.1.b A5.3.1.c A5.3.1.d A5.4.1.a A5.4.1.b A5.4.1.c A5.4.1.d A5.4.2.a A5.4.2.b A5.4.2.c A5.4.3.a A5.4.3.b A5.4.3.c A5.4.4.a A5.4.4.b A5.4.4.c A6.1.1.a A6.1.1.b A6.1.2.a A6.1.2.b A6.2.1.a A6.2.2.a A6.2.2.b A6.2.3.a 104

105 OR 7 OS 7.1 OS 7.2 OS 7.3 OR 8 OS 8.2 OS 8.3 A6.2.3.b A6.2.4.a A6.2.4.b A6.2.4.c A7.1.1.a A7.1.1.b A7.1.1.c A7.2.1.a A7.2.1.b A7.2.1.c A7.2.2.a A7.2.2.b A7.2.2.c A7.2.3.a A7.2.4.a A7.2.4.b A7.2.4.c A7.3.1.a A7.3.1.b A7.3.1.c A7.3.1.d A7.3.2.a A7.3.2.b A7.3.2.c A7.3.2.d A7.3.3.a A7.3.3.b A7.3.3.c A7.3.3.d A7.3.3.e T8.1.1 T8.1.2 T8.1.3 T8.2.1 T8.2.2 T8.2.3 T8.2.4 T ) SCHEDA DEI COSTI AMMISSIBILI (Autogenerata dal sistema SIRIO) 10) ARTICOLAZIONE DEI COSTI PER LE ATTIVITA PREVISTE Indicare per ciascun obiettivo realizzativo l articolazione dei costi. OR 1 OS1.1 Strumenti preventivi innovativi per la riduzione del rischio di microrganismi alteranti in uva e vino ATTIVITA' P S/A C FT SG AC TOTALE RI SS

106 TOTALE OR OR 2 OS2.1 OS2.2 OS2.3 Strumenti di controllo innovativi per la determinazione di contaminanti in uva e vino ATTIVITA' P S/A C FT SG AC TOTALE RI SS RI SS RI SS TOTALE OR OR 3 OS3.1 OS3.2 OR 4 OS4.1 Strumenti correttivi innovativi per la rimozione di metaboliti microbici indesiderati nel vino ATTIVITA' P S/A C FT SG AC TOTALE RI SS RI SS TOTALE OR Strumenti preventivi e correttivi innovativi per la riduzione del rischio di contaminazione da microrganismi indesiderati, micotossine e insetti nel frumento ATTIVITA' P S/A C FT SG AC TOTALE RI SS TOTALE OR OR 5 OS5.1 OS5.2 OS5.3 OS5.4 Strumenti di controllo innovativi per la determinazione di contaminanti in cereali e derivati ATTIVITA' P S/A C FT SG AC TOTALE RI SS RI SS RI SS RI SS TOTALE OR OR 6 OS6.1 OS6.2 OR 7 Strumenti innovativi per la prevenzione del rischio di contaminazione di prodotti freschi ATTIVITA' P S/A C FT SG AC TOTALE RI SS RI SS TOTALE OR Strumenti di controllo innovativi per la determinazione di metalli pesanti e microrganismi 106

107 patogeni in prodotti freschi OS7.1 OS7.2 OS7.3 ATTIVITA' P S/A C FT SG AC TOTALE RI SS RI SS RI SS TOTALE OR OR 8 OS8.1 OS8.2 OS8.3 SCALE UP INDUSTRIALE degli strumenti preventivi, di controllo e correttivi messi a punto nel progetto ATTIVITA' P S/A C FT SG AC TOTALE RI SS RI SS RI SS TOTALE OR TOTALE PROGETTO RICERCA Legenda P: Personale S/A: Strumenti e attrezzature C: Servizi di consulenza F/T: Fabbricati e terreni SG: Spese generali AC: Altri costi di esercizio 11) VERIFICA DELL ESITO DEL PROGETTO DI RICERCA 11.1 Verifica intermedia I criteri tecnici che si intendono adottare per il monitoraggio in itinere del progetto di ricerca sono schematizzati di seguito: Attività OBIETTIVI INTERMEDI PROVE DA SVOLGERE RISULTATI QUANTITATIVI ATTESI Mese Attività a Selezione di ceppi di Brettanomyces bruxellensis in vini pugliesi e validazione della metodica molecolare per l identificazione e quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino. Conte in piastra ed isolamenti in coltura pura. Validazione dei marcatori molecolari per la identificazione e quantificazione rapida di lieviti Brettanomyces in vino. Amplificazioni PCR. Amplificazioni qpcr. Sequenziamento di acidi nucleici. Analisi HRM. Collezione di biotipi di B. bruxellensis autoctoni. Identificazione e quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino mediante curve di calibrazione e monitoraggio di popolazioni modello in vino. Misurazione della popolazione contaminante (ufc/ml)

108 Attività b Ottimizzazione di un metodo basato sull applicazione del HPLC per la quantificazione degli acidi idrossicinnamici e dei corrispondenti vinil- ed etil-derivati in vino mediante un metodo HPLC. Analisi cromatografiche. Documento tecnico (report). Identificazione e quantificazione rapida di fenoli volatili (etil-derivati) e dei loro precursori in vino mediante metodiche cromatografiche, con aggiunte standard degli analiti in vino modello. 6 Attività a-c Studio sulla relazione tra sviluppo di B. bruxellensis, produzione di etilderivati, e diversi parametri chimicofisici specifici delle vinificazioni svolte presso le aziende proponenti. Definizione delle condizioni chimicofisiche ottimali di vinificazione. Microvinificazioni sperimentali. Amplificazioni qpcr. Analisi cromatografiche. Analisi chimico-fisiche del vino. Documento tecnico con studio della variazione dello sviluppo di B.bruxellensis, e della produzione di fenoli volatili (etil-derivati) in funzione dei parametri chimo-fisici delle vinificazioni aziendali. 8 Attività d Analisi del trascrittoma di un ceppo di B. bruxellensis accresciuto in mostovino. Analisi di genomica funzionale per la definizione del trascrittoma del lievito B. bruxellensis in vivo (direttamente nel sistema mosto-vino) mediante tecnologie di sequenziamento massivo parallelo o Next Generation Sequencing (NGS). Espressione genica relativa dei geni del lievito B. bruxellensis in vivo (direttamente nel sistema mosto-vino). 11 Attività a Protocollo di gestione delle risorse microbiche per la riduzione di B. bruxellensis e di fenoli volatili (etil-derivati) da esso prodotti. Definizione di regimi di gestione delle risorse microbiche in grado di ridurre la problematica in esame. Microvinificazioni sperimentali (circa 360 test). Amplificazioni qpcr (circa 750 test). Corse cromatografiche (circa 1200 test). Documento tecnico (report, piano sperimentale). Documento tecnico con studio della variazione dello sviluppo di lieviti B. bruxellensis, e della produzione di fenoli volatili (etil-fenoli), in funzione documento tecnico operativo (protocollo, disciplinare aziendale). 16 Attività b-c Protocollo di utilizzo delle scorze cellulari di lieviti per la riduzione dei fenoli volatili (etilderivati) prodotti da B. bruxellensis in vino. Definizione di regimi di gestione del coadiuvante tecnologico in analisi. Microvinificazioni sperimentali (circa 120 test). Corse cromatografiche (circa 500 test). Documento tecnico (report, piano sperimentale). Riduzione del 75% dei fenoli volatili (etil-derivati) nel vino. Documento tecnico con studio dell utilizzo delle pareti cellulari di lieviti per la riduzione dei fenoli volatili (etil-derivati) in vino

109 Attività a-b Messa a punto del metodo per l estrazione e purificazione con MEPS dell OTA e sua quantificazione in cromatografia liquida con rivelazione a fluorescenza. Prove per l ottimizzazione del metodo per l estrazione/purificazione separazione, e quantificazione di OTA. Inoltre, saranno eseguite analisi di almeno 20 campioni reali bianchi al fine di valutare la selettività del metodo Determinazione di: - Recupero - Linearità di risposta - Selettività - Precisione - Limite di rivelabilità Metodo analitico ottimizzato basato sulla estrazione/purificazione dell OTA in campioni reali del settore viti-vinicolo, mediante tecnologia MEPS, facilmente interfacciabile con un sistema classico di cromatografia liquida e rivelatore a fluorescenza Risultati: - Recupero: % per concentrazioni di 1-10 µg/kg; % per concentrazioni inferiori a 1 µg/kg. - Linearità di risposta: r > 0,999 - Selettività: t R,analisa + 2.5% < t interferente < t R,analisa - 2.5% - Precisione: 100-rsd > 95% - Limite di rivelabilità < 0.1 µg/kg 9 Attività a-b Sviluppo del biosensore doppio per la quantificazione simultanea di glucosio ed alcool. Prove per la realizzazione del biosensore amperometrico doppio per la quantificazione simultanea di glucosio ed alcool. Determinazione di: - Riproducibilità di fabbricazione: calcolata come 100-RSD, dove RSD è la deviazione standard relativa della risposta di 20 biosensori testati con la stessa soluzione standard di analita. - Tempo di risposta: tempo impiegato dal biosensore a fornire un segnale di risposta all analita pari al 95 % di quello finale (t 95 ) - Selettività: calcolata come 100 (1-S I /S A ), dove S I ed S A sono rispettivamente i segnali di risposta dei possibili interferenti di matrice e dell analita alla concentrazione fisiologica Prototipo di biosensore doppio. Saranno preparati con la tecnologia ottimizzata almeno 20 biosensori. Risultati: - Riproducibilità di fabbricazione: 100-RSD > 80% - Tempo di risposta: t 95 < 5 secondi - Selettività: 100 (1-S I /S A ) > 99.9% 10 Attività a Sviluppo di una metodica per la simultanea estrazione e parziale purificazione di allergeni di latte e di uovo da campioni di Saranno testati tubi da dialisi a differente cut-off (3 e 10 KDa) e colonnine ad esclusione dimensionale per un idonea estrazione e purificazione delle proteine Almeno due proteine allergeniche isolate e parzialmente purificate 4 109

110 vino chiarificati d interesse. Attività b Messa a punto di un protocollo di digestione enzimatica e purificazione della miscela di proteine da analizzare con controllo qualitativo da effettuare mediante analisi elettroforetica Saranno testati singoli enzimi e/o miscele di enzimi e diversi rapporti substrato/enzima ed identificata la combinazione migliore ai fini della produzione di un maggior numero di peptidi specifici per ciascuna proteina. La verifica della resa di digestione sarà condotta tramite analisi elettroforetica sui digeriti ottenuti. Resa di digestione 50% 12 Attività c Sviluppo di un metodo basato su separazione cromatografica ed analisi in spettrometria di massa per l analisi della miscela di peptidi derivanti dall idrolisi enzimatica della miscela di proteine di latte e uova previamente purificate Saranno testate diverse condizioni per l analisi cromatografica quali la scelta della colonna cromatografica più idonea per la separazione multi peptidica e opportuno gradiente di eluizione al fine di ottenere picchi isolati da interferenti di matrice. Almeno due peptidi identificati per ciascun allergene alimentare con un accuratezza 5 ppm. Limite di rivelabilità per ciascuna proteina allergenica 10 ppm. 30 Attività a Sintesi ed isolamento di addotti e/o derivati fluorescenti degli allergeni e/o preparazione di biochip di oro modificati Sintesi dei traccianti di ciascuna proteina con opportune molecole fluorescenti (derivati della fluoresceina). Identificazione e caratterizzazione dei coniugati fluorescenti mediante tecnica di conferma LC-MS(MS) e purificazione con HPLC semi-preparativa. Coniugazione delle proteine di interesse o dei relativi anticorpi specifici con orocolloidale. Immobilizzazione della proteina o dell anticorpo selezionato su un chip d oro opportunamente modificato tramite specifica reazione di derivatizzazione. Almeno un derivato fluorescente (tracciante) degli allergeni d interesse e/o un addotto con oro-colloidale e/o biochip di oro modificato. 12 Attività b Sviluppo di un immunosaggio FP e/o saggio immunocromatografico (LFD o dipstick) e/o immunosaggio basato su tecnologia SPR per la determinazione di allergeni in soluzione Messa a punto di un immunosaggio FP e/o saggio immunocromatografico (LFD o dipstick) e/o immunosaggio basato su tecnologia SPR per la determinazione di allergeni in soluzione. Messa a punto di almeno un immunosaggio FP e/o SPR e/o LFD con soluzioni standard di proteine di latte e/o uovo

111 Attività a Studio delle caratteristiche chimicofisiche dei fitofarmaci individuati nella ISO EN Raccolta dati sperimentali e determinazione dei rispettivi Rt, in una ipotesi di metodica standard, ovvero nelle stesse condizioni operative. Individuazione degli ioni (parent and product) caratterizzanti l analita. Calcolo di un indice di suscettibilità alla frammentazione per EI ed HESI rispettivamente in esperimenti d GC-MS e LC-MS/MS. Prove sperimentali con tecniche GC-FID/ECD/ NPD, GC-MS, HPLC- DAD/FL ed LC-MS/MS su ognuno di essi. Ricerca bibliografica dei parametri chimico-fisici ed analitici disponibili in letteratura (peso molecolare esatto, fattori di capacità, indici di Kovats, etc) su almeno 500 fitofarmaci. Redazione di una lista di almeno 500 fitofarmaci caratterizzati dal punto di vista chimico-fisico ed analitico con particolare riferimento ai Rt, ai PM esatti, al K ed ai limiti di rivelabilità LOD ed LOQ. 12 Attività b Allestimento di almeno 500 soluzioni madri di singoli fitofarmaci partendo da CRM s e determinazione quali/quantitative delle impurezze in esse contenute. Preparazione di soluzioni madre. Misure gravimetriche con relativo calcolo dell incertezza sul titolo di ognuna delle soluzioni madre. Determinazioni del titolo di ognuna mediante HPLC- DAD/FL e determinazione quali/ quantitativa delle impurezze con tecniche GC- MS ed LC-MS/MS Determinazione quali/ quantitativa delle impurezze dei solventi utilizzati tecniche di rifrattometria e HPLC/RID. Produzione di almeno 500 soluzioni madre da conservare in opportuni congelatori a - 20 C. Produzione di almeno 500 cromatogrammi in GC- FID/ECD/NPD, HPLC- DAD/FL, GC-MS e/o LC- MS/MS dei singoli fitofarmaci in soluzione. Determinazione del tenore d impurezze delle soluzioni madre prodotte e dei solventi. 18 Attività c Determinazione dei livelli di contaminazione da fitofarmaci nelle matrici bianche di vino mediante metodiche analitiche validate. Determinazione della inerzia chimica delle matrici bianche di vino rispetto ai fitofarmaci selezionati. Estrazione e purificazione con metodo QueChers di fitofarmaci da diverse matrici di vino e analisi in GC-MS/MS, LC-MS/MS ed LC-HRMS di eventuali contaminanti residui della matrice vino. Determinazione della stabilità intrinseca della matrice rispetto ad alcuni fitofarmaci rappresentativi delle singole classi chimiche mediante analisi comparativa nel tempo. Qualificazioni di 20 matrici bianche di vino campionato in territori diversi con relativo profilo quali - quantitativo di contaminanti. Risultati analitici determinanti l inerzia chimica della matrice vino rispetto agli analiti selezionati

112 Attività e Studi di stabilità ed omogeneità Allestimento di n vials, di soluzioni madre, soluzioni figlie, matrici bianche da conservare in appositi congelatori, sulle quali effettuare nel tempo le prove di stabilità, omogeneità, ecc. Analisi periodiche per la determinazione della shelf life della matrice bianca di vino mediante prove rifrattometriche e di cromatografia liquida e gassosa accoppiata a spettrometria di massa. Prove di stabilità della matrice bianca di vino. Acquisizione dati relativi alla stabilità, omogeneità, ecc. delle soluzioni madre e figlie prodotte secondo classificazione. Individuazione delle shelf life di dette soluzioni e delle matrici bianche di vino e determinazione del tempo di scadenza o di potenziale utilizzo di dette soluzioni. Produzione di certificati d analisi delle varie soluzioni nel tempo e comparazione dei dati ottenuti. 24 Attività f Creazione di opportune sottoclassi di fitofarmaci, in funzione delle caratteristiche chimico-fisiche e della risposta strumentale alle diverse tecniche separative e d analisi (GC o LC) da utilizzare come fortificanti delle matrici bianche. Studio dell interazione tra la matrice vino e le soluzione di fitofarmaci allestite. Allestimento di n vials, delle miscele di fitofarmaci fortificanti ed allestimento di n vials, delle miscele di fitofarmaci fortificate in matrice (Spiked) (CMR) da conservare in appositi congelatori e sulle quali effettuare nel tempo, le prove di stabilità, omogeneità, ecc. mediante prove rifrattometriche, e in HPLC-DAD-FL, GC- FID/ECD/NPD, GC-MS ed LC-MS/MS. Effettuazione di prove comparative di GC-MS, LC- MS in bassa risoluzione verso prove in alta risoluzione. Acquisizione dati relativi alla stabilità, omogeneità, etc. delle miscele di fitofarmaci fortificanti prodotte. Individuazione delle shelf life di dette miscele e determinazione del tempo di scadenza e del tempo di potenziale utilizzo di dette miscele. Acquisizione dati relativi alla stabilità, omogeneità, ecc. delle miscele di fitofarmaci fortificate (Spiked) prodotte. Individuazione delle shelf life di dette miscele e determinazione del tempo di scadenza e del tempo di potenziale utilizzo di dette miscele. Produzione di certificati d analisi, nel tempo, delle miscele di fitofarmaci (CMR) prodotte e comparazione dei dati ottenuti. Produzione di uno studio comparativo (report) tra le differenti tecniche spettrometriche in ad alta e bassa risoluzione. 30 Attività a Sviluppo di una nuova metodica multi residuale di pesticidi untargeted analysis nella matrice vino basata sull uso di spettrometri di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS a Estrazione e purificazione in conformità alla ISO EN Sviluppo di metodica spettrometrica d analisi delle miscele di fitofarmaci standard realizzate con metodiche untargeted Produzione di un confronto statistico (report) dei dati analitici ottenuti con le tecniche d analisi tradizionali targeted (UPLC-QqQ) utilizzate per lo screening mirato di fitofarmaci nella matrice vino e quelli derivanti dall applicazione del nuovo ed

113 tecnologia Orbitrap e confronto con una metodica tradizionale targeted analysis) basata sull uso di tripli quadrupoli (UPLCQqQ) (UPLC-HRMS Orbitrap) realizzate in house (ISPA). Analisi, con altra metodica già validata targeted (UPLC-QqQ), delle miscele di fitofarmaci standard realizzate. Prove (UPLC-QqQ) in house (Lab. Instruments ed ISPA) e laboratori correlati. innovativo approccio di spettrometria di massa ad alta risoluzione untargeted effettuato in UPLC-HRMS- Orbitrap. Attività b Allestimento, organizzazione, conduzione di prove valutative interlaboratorio in conformità ai requisiti della ISO/IEC tra i laboratori selezionati. Validazione intralaboratorio della metodica sviluppata. Allestimento di aliquote delle miscele di fitofarmaci (CMR) ai fini dell istituzione di un confronto interlaboratorio tra tecniche innovative di spettrometria di massa ad alta risoluzione (HR- Orbitrap) e tecniche di spettrometria di massa convenzionali generalmente in uso (QqQ). Analisi dei CRM secondo la Guida ISO EN (Proficiency test). Produzione di un confronto statistico (report), in conformità alla ISO 13528:2005 Statistical method for use in proficiency testing by interlaboratory comparison dei dati analitici ottenuti dai vari laboratori selezionati ed accreditati ISO Attività a-c Individuazione di partite di mosto/vino contaminate da OTA e di partite di vinacce esenti da OTA. Separazione delle componenti delle vinacce. Analizzare l OTA in partite di mosti/vini e di vinacce. Produzione in vitro di OTA utilizzando A. carbonarius. Separare le diverse componenti delle vinacce. Ottenimento di 10 partite di mosto/vino da 100 lt contaminate con 3 concentrazioni (elevata, media e bassa) di OTA tra 0,5 e 30 µg/kg. Ottenimento di 500 kg di vinacce omogenee, con livellli di OTA <30 µg/kg e separazione nelle varie componenti 24 Attività a-b Messa a punto delle condizioni ottimali per la stabilizzazione di vinacce/buccette. Progettazione e costruzione di serbatoi coibentati idonei per la conservazione delle vinacce Conservare per 30 gg piccole aliquote di vinacce a 5 diverse temperature e/o addizionate con SO 2. Monitorare la carica microbica delle vinacce durante la conservazione. Monitorare i parametri qualitativi di mosti/vini prima e dopo il ripasso su vinacce conservate per 30 gg. Protocollo per la stabilizzazione delle vinacce. Progettare e costruire piccoli serbatoi coibentati. Prove di stabilizzazione su lotti di vinacce conservati in serbatoi coibentati I valori medi di carica microbica delle vinacce stabilizzate non devono essere statisticamente diversi (p=0.05) dai valori medi di vinacce fresche. I valori dei parametri di qualità dei mosti/vini prima e dopo il ripasso su vinacce stabilizzate non devono essere statisticamente diversi (p=0.05). 12 serbatoi da 50 lt coibentati e idonei a conservare le vinacce mantenendo inalterate le caratteristiche qualitative

114 Attività a-b Messa a punto dei parametri di ripasso del mosto/vino su vinacce per la rimozione dell OTA Ripassare mosti/vini contaminati con OTA su vinacce o loro componenti variando i tempi di contatto, i rapporti quantitativi delle due matrici e le condizioni di mescolamento. Analizzare per l OTA tutti i campioni di mosto/vino prima e dopo il ripasso. Protocollo per la rimozione dell OTA Riduzione di almeno il 90% delle concentrazioni di OTA nei mosti/vini ripassati su vinacce o loro componenti. 27 Attività a-b Individuazione di vigneti rappresentativi di areali ad alto e basso rischio OTA. Prelievo di campioni di uva alla raccolta e microvinificazione degli stessi. Vini a diverso contenuto di OTA. Almeno 3 vigneti per ogni areale campionati alla raccolta per prove di micro vinificazione. Almeno 12 microvinificazioni da vigneti ad alto e basso rischio OTA e da campioni inoculati e non con A. carbonarius Ottenimento di campioni a diverse fasi della microvinificazione e di vino con diverse concentrazioni di OTA. Risultati sulla presenza di OTA e suoi derivati (OT-α) in almeno 80 campioni prelevati dalle diverse micro vinificazioni Analisi HPLC di OTA e suoi derivati di degradazione nei campioni della microvinificazione 9 Attività c Individuazione di campioni per gli isolamenti microbiologici, selezione di ceppi in grado di degradare l OTA Isolamento di ceppi rappresentativi per ciascuna popolazione microbica e verifica in vitro della loro valenza enologica e degradativa dell OTA Ottenimento di ceppo/i microbici con valenza enologica capaci di degradare l OTA Degradazione di OTA > del 10% 12 Attività a Validazione di un efficiente protocollo di estrazione degli acidi nucleici dai campioni ambientali provenienti dalla cantina. Identificazione di primers specifici per geni codificanti enzimi con potenziale degradativo per l OTA Ottenimento di cdna per analisi di deepsequencing Diverse metodiche di estrazione di acidi nucleici e di successiva di RNA ribosomale dall RNA totale saranno confrontate Analisi bioinformatica Estrazione di acidi nucleici da almeno due campioni ambientali a diverso contenuto di OTA Qualità del DNA ed RNA estratto ed efficienza della metodica di estrazione. Un efficiente protocollo di estrazione di acidi nucleici da mosto. Protocollo di amplificazione. Capacità di amplificare i geni di interesse. Qualità del cdna sintetizzato. Efficiente protocollo di sintesi di cdna dall mrna ottenuto 9 Attività b Ottimizzazione e validizione del protocollo per la piattaforma di sequenziamento del metatrascrittoma Produzione delle sequenze mediante piattaforme di nuova Numero congruo di sequenze ottenute per reads Lunghezza delle sequenze ottenute Qualità delle sequenze ottenute. Data sets di sequenze riferito ai trascritti genici del microbioma analizzato

115 generazione Attività c Implementazione e validazione di un idoneo workflow di analisi bioinformatica per l analisi del metatrascrittoma associato a geni codificante enzimi con potenziale degradativo dell OTA Analisi comparativa dei matatrascrittomi Pull di enzimi presubilmente coinvolti della degradazione dell OTA. Determinazione sulla base delle sequenze prodotte, della composizione del metatrascrittoma dell intera comunità microbica 26 Attività a-b Produzione biotecnologica di enzimi che degradono l OTA e ottenimento di un ceppo microbico ricombinate Almeno un enzima e un ceppo microbico ricombinante in grado di degradare l OTA Capacità di degradazione verso l OTA. Degradazione di OTA > del 10% 36 Attività a-c Ottimizzazione dei parametri sperimentali con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata. Definizione della migliore tecnologia e del miglior processo. Definizione dei migliori parametri sperimentali (tempo di contatto, concentrazioni di ozono, temperatura del trattamento) che permettano una efficace riduzione nel frumento dell infestazione da insetti, contaminazione da funghi tossigeni, batteri alterativi e micotossine. Determinazione della mortalità degli insetti, della riduzione della carica microbica e dei livelli di micotossine prima e dopo i trattamenti di cariossidi di frumento con ozono/acqua ozonizzata. Valutazione dell effetto dei trattamenti sulla qualità delle cariossidi attraverso le analisi del colore, odore, acidi grassi, trigliceridi, proteine, zuccheri e vitamine delle cariossidi prima e dopo i trattamenti con ozono/acqua ozonizzata. Mortalità degli insetti, batteri alterativi e funghi micotossigeni dell ordine del 80-90%. Percentuale di abbattimento delle micotossine (in particolare deossinivalenolo e ocratossina A) in cariossidi di frumento del 60-70%. 14 Attività 4.1.2a-b Prototipo di generatore di ozono gassoso e acqua ozonizzata. Progettazione e realizzazione del prototipo. Prototipo in grado di generare 30 g/h di ozono, dotato di un sistema di gestione dello stesso, di un sensore per la misurazione dell ozono disciolto in acqua e di un sensore per la misurazione di ozono in aria; il prototipo inoltre sarà dotato di un sistema di sicurezza che rileverà la concentrazione di

116 ozono nell ambiente. Attività a Individuazione delle sottoclassi di fitofarmaci, studio dell effetto matrice (frumento) sull analisi strumentale di fitofarmaci(ri) di solubilità, stabilità ed interazioni tra medium e soluzione di fitofarmaci. Ricerca bibliografica dei parametri chimico-fisici ed analitici disponibili in letteratura (peso molecolare esatto, fattori di capacità, indici di Kovats, etc) sui fitofarmaci selezionati. Prove sperimentali con tecniche LC-QqQ su ognuno dei fitofarmaci selezionati. Determinazione della stabilità intrinseca della matrice rispetto ad alcuni fitofarmaci rappresentativi delle singole classi chimiche mediante analisi comparativa nel tempo. Redazione di una lista di fitofarmaci, selezionati sulla d indagine bibliografica in ragione dell utilizzo nel medium frumento, caratterizzati dal punto di vista chimico-fisico ed analitico con particolare riferimento ai Rt, ai PM esatti, al K ed ai limiti di rivelabilità LOD ed LOQ con tecnica analitica di spettrometriche di massa LC- QqQ. 24 Attività b Allestimento CRM in matrice frumento in aliquote da sottoporre ai partecipanti il proficiency test. Allestimento di n vials, delle miscele CRM di fitofarmaci in matrice frumento e/o di quelle eventualmente fortificate (Spiked). Allestimento di n vials, di dette miscele. Studio e prove, nel tempo, di: stabilità, omogeneità, etc sulle miscele opportunamente conservate in appositi congelatori. Analisi rifrattometriche e di LC-MS/MS. Effettuazione di prove comparative d indagine (LC- QqQ) versus le innovative tecniche di spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS Orbitrap). Produzione di studio comparativo tra le differenti tecniche spettrometriche di massa LC-HRMS Orbitrap ed LC-QqQ sull analisi multi residuale di pesticidi nella matrice frumento. 30 Attività a Sviluppo e validazione di metodica untargeted d analisi multiresiduale di pesticidi in frumento basata sull utilizzo di spettrometri di massa ad alta risoluzione (LC- HRMS Orbitrap) e confronto con metodica tradizionale con tecniche (LC-QqQ ). Analisi multi residuale untargeted con tecniche di spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS Orbitrap) di tutti i fitofarmaci presenti nel campione sottoposto a controllo. Analisi multi residuale targeted con tecniche di spettrometria di massa (LC- QqQ) dei fitofarmaci presenti nel campione sottoposto a controllo. Documentazione di pre-audit, interni ed esterni, effettuati ai fini della certificabilità ISO EN della nuova metodica sviluppata su miscele allestite di pesticidi CRM fornite da produttori certificati ISO EN

117 Attività a Selezione di campioni di frumento e mais Analisi LC-MS/MS di campioni di frumento e mais per tricoteceni, zearalenone, fumonisine, aflatossine, ocratossina A. Individuazione di almeno 1 campione di frumento (5-10 kg) e uno di mais (5-10 kg) con contaminazione inferiore al 20% dei limiti massimi ammissibili (per tutte le micotossine) 6 Attività b Allestimento di colture fungine (Fusarium, Aspergillus) su frumento e mais Allestimento di colture di F. graminearum (DON-ZEA), F. verticillioides (FB 1 -FB 2 ), F. poae, (T2-HT2) A. ochraceus (OTA), A. flavus (AFB 1, B 2, G 1, G 2 ) su frumento e mais e analisi del contenuto di micotossine in ciascuna coltura. Produzione di frumento e mais altamente contaminati (1 campione per ogni gruppo di micotossine, contaminazione dell ordine di centinaia di µg/kg) 6 Attività c Preparazione di farine di frumento e mais contaminate ai livelli desiderati Miscelazione di campioni non contaminati e colture fungine. Analisi LC-MS/MS dei livelli di contaminazione ottenuti. Produzione di una farina di frumento e una di mais (5-10 kg) contaminate da DON, ZEA, T2/HT2, FB 1 /FB 2, AFB 1 /B 2 /G 1 /G 2, OTA a livelli simili ai limiti massimi ammissibili. 12 Attività d Studio di omogeneità Suddivisione dei campioni di farina di frumento e mais in porzioni da 100g e prelievo di aliquote per lo studio della omogeneità della contaminazione da DON, ZEA, T2/HT2, FB 1 /FB 2, AFB 1 /B 2 /G 1 /G 2, OTA. Attività e Studio di stabilità Conservazione delle farine di frumento e mais a -20 C, 4 C e 25 C per 3, 6, 12 mesi. Analisi dei livelli di DON, ZEA, T2/HT2, FB1/FB2, AFB1/B2/G1/G2, OTA per ogni intervallo di tempo e temperatura testate. Superamento del test statistico di omogeneità. Stabilità in condizioni ottimizzate > 12 mesi Attività a Sviluppo di una procedura di estrazione Prove di recupero da estrazione effettuate su campioni artificialmente contaminati da micotossine a livelli pari ai limiti massimi ammissibili. Recuperi della fase estrattiva superiori al 70% per tutte le micotossine considerate. 6 Attività b Sviluppo di procedure di purificazione degli estratti. Prove di recupero della fase di purificazione effettuate con colonnine SPE (polimeriche) e colonnine ad immunoaffinità multi anticorpo. Recuperi della fase estrazione + purificazione superiori al 70% per tutte le micotossine considerate

118 Prove di recupero della fase di estrazione + purificazione effettuate con la migliore miscela estraente e la migliore tecnica di purificazione. Attività c Implementazione di un sistema per estrazione in fase solida (SPE) on line Ottimizzazione del funzionamento di un sistema per la purificazione del campione on line e in particolare di: fase di caricamento del campione, lavaggio della cartuccia, eluizione degli analiti, separazione cromatografica, rivelazione degli analiti). Recuperi della fase estrazione + purificazione superiori al 70% per tutte le micotossine considerate. 24 Attività d Studio dell effetto matrice Confronto di rette di calibrazione (6 punti) in fase mobile e in matrice (frumento, mais, e derivati). Calcolo del SSE%: [(pendenza retta in matricependenza retta in fase mobile)/pendenza retta in matrice]. Valori di SSE% compresi tra 60% e 140% per tutte le micotossine in tutte le matrici considerate. 24 Attività e Sviluppo e confronto di metodiche di rivelazione basate sull uso di spettrometri di massa a triplo quadrupolo (LC- MS/MS) e ad alta risoluzione (LC- HRMS) Analisi di micotossine standard per l ottimizzazione delle condizioni di rivelazione mediante MS/MS e HRMS (potenziali di ionizzazione, energie di collisione, temperatura della sorgente, aggiunta di modificatori alla fase mobile, scelta degli ioni caratteristici). Conformità con il regolamento 2002/657/EC 12 Attività a Messa a punto di un adeguato processo di estrazione del campione - Preparazione di un campione con gli standard da ricercare - Test di omogeneità (10) Individuazione della migliore metodica di estrazione del campione 4 - Prove di estrazione (diverse combinazioni di solventi in duplicato) - Prove di estrazione con combinazione di solventi ottimale - Verifica dei recuperi Attività b Determinazione delle condizioni sperimentali più idonee per l analisi Prove per l ottimizzazione delle condizioni sperimentali in HPLC-MS-MS e in GC- MS-MS Griglia delle condizioni strumentali ottimali per apparecchiatura (LC-MS/MS, GC-MS/MS) 10 Attività b Taratura - 6 miscele contenenti ognuna 100 principi attivi di Rette di calibrazione ottenute

119 pesticidi preparate - Una miscela contenente standard di micotossine - Analisi per la messa a punto delle rette di calibrazione Attività a Sintesi, isolamento e caratterizzazione di derivati fluorescenti per micotossina (OTA, DON, T-2/HT-2) da utilizzare per lo sviluppo di immunosaggi FP. Messa a punto di un protocollo di sintesi per la derivatizzazione delle micotossine attraverso procedure di attivazione delle funzionalità idrossiliche/carbossiliche delle micotossine di interesse. Messa apunto di procedure di identificazione e isolamento dei prodotti sintetizzati. Almeno un derivato fluorescente per micotossina (OTA, DON, T-2/HT-2) da utilizzare per lo sviluppo di immunosaggi FP. 12 Attività b Messa a punto di un protocollo di preparazione del campione per la determinazione di OTA, DON e tossine T-2 e HT-2 in cereali e prodotti derivati mediante immunosaggi FP. Messa a punto di un protocollo di estrazione rapido delle micotossine di interesse che sia compatibile con l immunosaggio FP. Test di diverse miscele estraenti; ottimizzazione del fattore di diluizione, determinazione dei recuperi della fase estrattiva. Almeno un protocollo di estrazione selettivo che consente di recuperare OTA, DON e tossine T-2 e HT-2 con elevata accuratezza (recupero 70%) e precisione (CV 15%). 24 Attività c Messa a punto di immunosaggi FP con soluzioni standard di micotossine (OTA, DON, T2/HT2) Messa a punto delle condizioni sperimentali che ottimizzano la competizione in soluzione con valutazione dei relativi tempi di incubazione. Verranno condotte prove di valutazione della sensibilità, intervallo di linearità e cross-reattività dell immunosaggio FP in soluzione. Tempo totale di analisi: 20 min 27 Attività a Messa a punto di un protocollo di preparazione del campione per la determinazione di OTA mediante saggio LF Preparazione di colonnine SPE Ottimizzazione delle condizioni di estrazione e purificazione del campione. Caratteristiche delle colonnine SPE (selettività, capacità di carico, stabilità) comparabili a quelle commercialmente disponibili. Protocollo ad hoc per l estrazione e la purificazione dell OTA

120 Attività b Messa a punto di un saggio LF con soluzioni standard di OTA Valutazione delle performance analitiche del saggio LF mediante analisi di soluzioni standard di OTA preparate nella soluzione di lavoro (tampone o miscela di estrazione). Prestazioni del metodo analitico (Accuratezza: 70%. Incertezza di misura: 40%) 30 Attività a Selezione di campioni di cereali naturalmente contaminati da utilizzare per lo sviluppo del metodo FT-NIR per la determinazione di DON e/o OTA in cereali e prodotti derivati Collezione campioni di cereali e prodotti derivati naturalmente contaminati da Fusarium, Aspergillus e Penicillium spp; Determinazione contenuto di DON e/o OTA mediante HPLC (metodo di riferimento). Numero sufficiente di campioni (almeno 150 per ciascuna matrice) naturalmente contaminati con livelli apprezzabili di DON (fino a 5000 µg/kg) e/o OTA (fino a 100 µg/kg). 15 Attività b Valutazione delle performance analitiche dei metodi di calibrazione FT-NIR per la determinazione di DON e/o OTA in cereali e prodotti derivati Analisi mediante spettroscopia FT-NIR dei campioni di cereali e prodotti derivati. Elaborazione dei dati spettroscopici mediante analisi statistica multivariata. (modello matematico PLS e analisi discriminante). Metodo semi-quantitativo: incertezza di misura: 40%. Metodo qualitativo: percentuale di corretta classificazione: 80%. 24 Attività a Calibrazione del naso elettronico per la classificazione di campioni di cereali e prodotti derivati a differente contenuto di DON e OTA Ottimizzazione delle condizioni sperimentali di analisi mediante naso elettronico (gas carrier, flusso, temperatura, umidità del gas, tempo di generazione dello spazio di testa). Ottimizzazione delle condizioni sperimentali di preparazione del campione. Analisi di campioni a differente contenuto (basso, medio, alto) di DON e OTA. Addestramento del sistema e- nose per discriminare campioni di cereali e prodotti derivati a differente contenuto di DON e/o OTA. 24 Attività c Caratterizzazione delle sostanze volatili correlate alla presenza del DON e OTA in cereali e prodotti derivati Messa a punto delle condizioni sperimentali dell analisi SPME-GC-MS per l identificazione e la determinazione semiquantitativa di sostanze volatili correlate alla presenza di DON e OTA in cereali e prodotti derivati Determinazione di almeno 5 componenti volatili 36 Attività a-b Selezione di batteri Saggi di inibizione in vitro Selezione di almeno

121 lattici in grado di inibire la crescita di Pseudomonas spp. di Pseudomonas fluorescens. microrganismo potenzialmente bio-conservante. Attività a-b Messa a punto di un protocollo biotecnologico per il controllo di Pseudomonas spp. mediante bioconservanti. Prove di inibizione di Pseudomonas in mozzarella. Selezione di almeno 1 condizione nella quale, dopo 14 giorni, la mozzarella presenta aspetto ed odore normali ed una densità cellulare di Pseudomonas inferiore a ufc/g 24 Attività 6.2.1a Individuazione e valutazione di differenti compost idonei all impiego come substrati di coltivazione e/o ammendanti in orticoltura Su 10 compost: - saggi di fitotossicità su 3 specie spia - analisi fisiche del substrato - analisi chimiche dei metalli pesanti Individuazione di 2 compost con caratteristiche idonee all impiego come substrato/ammendante in orticoltura per le successive prove in ambiente confinato. Report tecnico. 7 Attività a Screening varietale su cultivar di pomodoro allevate senza suolo su substrato a base di compost Prova di pomodoro allevato senza suolo per 6 mesi (4 cv, 2 compost, 3 ripetizioni). Produzione e analisi qualitative sui frutti. Analisi dei metalli pesanti su foglie frutti e radici. Primo report tecnico e collezione dati sulle performance produttive e qualitative e sul relativo contenuto di metalli pesanti nelle porzioni eduli di 4 cultivar di pomodoro allevate senza suolo su di un substrato a base di compost. 19 Attività b Screening varietale su cultivar di lattuga allevate senza suolo su substrato a base di compost Prova di lattuga allevata senza suolo per 3 mesi (6 cv, 2 compost, 3 ripetizioni). Produzione e analisi di nitrati e sostanza secca nella porzione edule. Analisi dei metalli pesanti su foglie e radici. Primo report tecnico e collezione dati sulle performance produttive e qualitative e sul relativo contenuto di metalli pesanti nelle porzioni eduli di 6 cultivar di lattuga allevate senza suolo su di un substrato a base di compost. 21 Attività 6.2.3a Coltivazione di pomodoro con sistema senza suolo e su terreno ammendato con compost Prova di pomodoro allevato su terreno e senza suolo per 6 mesi (2 sistemi di coltivazione, 2 compost, 3 ripetizioni). Raccolta dati per la stesura del report tecnico dell influenza del sistema di coltivazione (terreno/senza suolo) sugli aspetti produttivi di pomodoro da mensa. 26 Attività b Coltivazione di lattuga con sistema senza suolo e su terreno ammendato con compost Prova di lattuga allevata su terreno e senza suolo per 3 mesi (2 sistemi di coltivazione, 2 compost, 2 cultivar, 3 ripetizioni). Raccolta dati per la stesura del report tecnico dell influenza del sistema di coltivazione (soil/soilless) sugli aspetti produttivi di due cultivar di lattuga. 26 Attività a Identificazione delle condizioni sperimentali che favoriscono il rilascio del nichel ed altri metalli dagli Prove di rilascio di metalli pesanti da alimenti contaminati trattati con acidi forti e deboli, chelanti o sali. Analisi delle cinetiche di rilascio anche in funzione Definizione della composizione chimica e del ph di soluzioni per il trattamento blando di alimenti da sottoporre ad analisi ATR-FTIR differenziale. Definizione dei

122 alimenti. Valutazione della sensibilità della tecnica ATR-FTIR per la rivelazione di metalli pesanti nelle matrici alimentari. Sviluppo di protocolli preliminari di analisi. della temperatura. Acquisizione di spettri ATR- FTIR di prodotti alimentari il cui contenuto in metalli pesanti è noto, prima e dopo blando trattamento con acidi, chelanti o sali. Analisi degli spettri differenza. tempi di trattamento e della temperatura ottimali per le analisi. Identificazione della minima quantità di metallo pesante nell alimento in grado di dare luogo a segnali IR rivelabili. Attività b Selezione di materiali da utilizzare per la preparazione di strati attivi sensibili a diversi ioni metallici tossici (Ni2+, Co2+, Cd2+, Pb2+, Cr3+). Verifica parziale delle prestazioni di tali materiali in sensori chimici a trasduzione ottica nel range infrarosso. Caratterizzazione chimico-fisica del fenomeno di binding responsabile del sensing chimico. Analisi della risposta spettroscopica nel range infrarosso di diversi materiali idrofobici all interazione con metalli pesanti. Per ogni materiale test di sensibilità, selettività, stabilità, limite di rivelabilità, rapidità di risposta, riutilizzabilità. Analisi degli spettri IR differenza. Definizione dei parametri quantitativi per i diversi materiali analizzati indicativi delle loro prestazioni come strati attivi. Per ogni metallo, individuazione del materiale da utilizzare come strato attivo in sensori chimici a trasduzione IR, che presenta i migliori parametri di sensibilità, stabilità, rapidità, riutilizzabilità e selettività. Identificazione dei gruppi funzionali coinvolti nell interazione con i metalli pesanti (siti attivi). Determinazione delle costanti termodinamiche di binding. 20 Attività c a) Protocolli di trasferimento su quarzo degli strati attivi selezionati. Studio della risposta piezoelettrica degli strati attivi all interazione con gli ioni metallici tossici. b) Analisi di campioni reali per la verifica delle prestazioni di sensori piezoelettrici che utilizzano cristalli di quarzo opportunamente funzionalizzati. a) Prove di deposizione su quarzo dei migliori materiali selezionati mediante spettroscopia IR (4 tecniche di deposizione: casting, spin coating, Langmuir-Blodgett, Langmuir-Schafer). Analisi della risposta piezoelettrica indotta dal legame con i metalli anche in dipendenza del tipo e dello spessore del film. b) Per ogni tipologia di strato attivo test di sensibilità, selettività, stabilità, limite di rivelabilità, rapidità di risposta, riutilizzabilità, facendo uso di soluzioni standard e campioni reali. a) Per le diverse tipologie di deposizione degli strati attivi su quarzo definizione dei parametri quantitativi indicativi delle prestazioni analitiche dei sensori piezolettrici ottenibili. Individuazione della tipologia di deposizione su quarzo piezoelettrico e dello spessore dello strato attivo in grado di garantire le migliori prestazioni nell analisi di metalli pesanti in mezzo acquoso. b) Definizione dei parametri quantitativi indicativi delle prestazioni analitiche dei sensori piezolettrici utilizzabili sui prodotti alimentari. a) 24 b) 26 Attività a-c Allestimento dei singoli acquari monospecifici per tre delle più diffuse specie di molluschi edibili (Mytilus galloprovincialis, Ostrea gigas, Tapes Analisi su molluschi per valutare l assenza dei 3 patogeni emergenti. Acquari allestiti (27 da contaminare, 9 controlli) Batch con concentrazioni note di protozoi mantenuti in Acquari contaminati (3 specie di molluschi x 3 patogeni x 3 concentrazioni diverse) 6 122

123 philippinarum). Ottenimento degli esemplari di molluschi edibili contaminati con Giardia, Cryptosporidium spp e Toxoplasma, a diverse concentrazioni. vitro. Attività a-c Valutazione della presenza e quantificazione di Giardia, Cryptosporidium in diverse localizzazioni anatomiche dei molluschi contaminati in funzione delle diverse concentrazioni e dei tempi postesposizione. Messa a punto di almeno 2 dei protocolli di standardizzazione per la Real Time PCR Valutazione della presenza e quantificazione di Toxoplasma in diverse localizzazioni anatomiche dei molluschi contaminati in funzione delle diverse concentrazioni e dei tempi postesposizione. Messa a punto dei finali 2 protocolli di standardizzazione per la Real Time PCR - Prelievo di molluschi dagli acquari nei 3 tempi p.c. - Analisi qualitative per rilevare Giardia e Cryptosporidium (6 subpools per prelievo) - Analisi qualitative per rilevare Toxoplasma (6 subpools per prelievo) - Estrazioni di DNA con kits commerciali (216 campioni per laboratorio di ricerca) - Analisi quantitative con prove molecolari (3 protocolli da sperimentare in 4 laboratori) - n. 4 Protocolli da mettere a punto (1 protocollo per laboratorio specifico per un patogeno) 23 Attività a Messa a punto della piattaforma real-time PCR, così come sviluppata dal consulente STMicroelectronics con adattamento ai protocolli messi a punto dai 4 laboratori partner Prove di adattamento con protocolli specifici per la messa a punto della piattaforma Messa a punto della Piattaforma unica con modalità di rilevazione specie-specifica 29 Attività a-d Selezione di sonde oligonucleotidiche specifiche per diverse specie di Listeria (almeno 3) e Salmonella (almeno 3) Multiplex Real Time PCR e padlock probes per amplificazione Ottimizzazione della sensibilità di rilevamento (al di sotto di 10 cfu/ml) 6 123

124 Attività a-d Protocolli per estrazione DNA batterico e preparazione di estratti batterici (selezione di sonde oligonucleotidiche specifiche per diverse specie di Listeria (almeno 3) e Salmonella (almeno 3) in matrici complesse Multiplex Real Time PCR e padlock probes per amplificazione isotermica e nuovi sistemi di detection Ottimizzazione della sensibilità di rilevamento (< 10 cfu/ml) 6 Attività a-b Selezione di anticorpi specie-specifici per immunosensori Verifica dell applicabilità di metodi basati su immunosensori Ottimizzazione delle sensibilità di rilevamento intorno a 10 cfu/ml) 14 Attività c-f Riduzione dei tempi di esecuzione e Sviluppo di sistemi di allerta rapidi della presenza di Listeria e Salmonella nelle carni Verifica degli step e dei tempi di esecuzione dei protocolli Ottimizzazione dei protocolli per analisi molecolari rapide e precise 18 SCALE UP INDUSTRIALE Task Sperimentazione su scala industriale del protocollo biotecnologico per la minimizzazione dello sviluppo di lieviti di B. Bruxellensis e che riduca la presenza di etilfenoli nel vino Circa 18 vinificazioni sperimentali con dimensionamento industriale. Amplificazioni qpcr. Analisi cromatografiche. Documento tecnico-operativo riguardo la validazione su scala industriale del protocollo standard ottimizzato su scala pilota per ridurre la presenza di B. bruxellensis in vinificazione. 32 Task Valutazione dell efficacia di una o più strategie per il controllo di Pseudomonas spp. su scala industriale Prove di inibizione di Pseudomonas in mozzarella. Selezione di almeno una strategia che consenta di ottenere, anche in seguito ad una contaminazione simulata, un prodotto con aspetto ed odore normali e con una densità cellulare di Pseudomonas inferiore a ufc/g, dopo 14 giorni

125 Task a) Analisi del processo industriale e definizione di un piano di campionamento b) Trasferimento in azienda del sistema per effettuare le analisi molecolari sui campionamenti, trasferimento tecnologico dei sistemi sviluppati a) Campionamenti e verifica dei punti critici di pericolo di contaminazione b) Analisi molecolari effettuati con il personale dell azienda c) Prove di campionamento, inoculo e analisi molecolari effettuati in azienda a) Ottimizzazione dei punti critici da campionare b) Tecnologie ed expertise trasferiti al personale in azienda c) Scale up del protocollo di analisi e della sua applicazione durante la filiera a) 18 b) 20 c) 22 c) Scale up: Implementazione finale dei metodi nel ciclo produttivo aziendale 11.2 Verifica finale I criteri tecnici che si intendono adottare per verificare l esito dell intera ricerca sono schematizzati di seguito. Attività OBIETTIVI DI RICERCA RAGGIUNTI PROVE DA SVOLGERE RISULTATI QUANTITATIVI ATTESI Mese Attività c Definizione di un protocollo finale che permetta, sulla base delle reali variabili di cantina, la pianificazione e realizzazione di azioni per per ridurre le perdite annue causate da B. bruxellensis, minimizzando lo sviluppo del lievito e riducendo la produzione e la presenza di etilderivati da esso prodotti. Circa 120 microvinificazioni sperimentali. Amplificazioni qpcr. Analisi cromatografiche. Analisi chimiche per altri composti di interesse enologico, quali ad esempio composti aromatici, acido L-malico, ammine biogene, ocratossina. Documento tecnico (report, piano sperimentale e protocollo standard). Documento tecnico operativo, ovvero un protocollo di standard per le vinificazioni atto a ridurre la presenza di B. bruxellensis. Scheda qualitativa delle vinificazioni effettuate contenente l analisi quantitativa dei principali composti di interesse enologico, desiderati e non. 19 Attività c Validazione del metodo secondo la procedura di validazione del Regolamento 123/2005 Analisi di soluzioni standard e campioni reali artificialmente contaminati Determinazione di: - Accuratezza: calcolata come 100*Crbd/Crb, percentuale della concentrazione (Crbd) dell analita determinata nel campione reale bianco additivato rispetto a quella realmente Metodo analitico validato. Risultati: - Accuratezza: % per concentrazioni di 1-10µg/kg; % per concentrazioni inferiori a 1µg/kg. - Linarità di risposta: r > 0,

126 presente nel campione stesso (Crb) - Linarità di risposta intervallo di concentrazione nel quale la correlazione tra risposta e concentrazione di campioni reali bianchi additivati è lineare, valutata in termini di coefficiente di correlazione (r) - Ripetibilità: precisione (RSD r ) valutata mediante sei analisi ripetute per ciascuno di tre differenti livelli di concentrazione (0.5, 1 e 1,5 il limite massimo permesso per legge) additivati a campioni reali bianchi, ed eseguite dallo stesso operatore con lo stesso metodo e strumentazione - Riproducibilità: precisione (RSD R ) valutata mediante sei analisi ripetute per ciascuno di tre differenti livelli di concentrazione (0.5, 1 e 1,5 il limite massimo permesso per legge) additivati a campioni reali bianchi, ed eseguite da operatori diversi con lo stesso metodo e strumentazione) - Limite di quantificazione (LOQ): Concentrazione minima quantificabile definita come rapporto segnale rumore pari a 10 - Ripetibilità: 11.5% < RSD r < 15.2% (23% valore di riferimento secondo Thompson 2000). - Riproducibilità: RSD R < 23% (valore di riferimento secondo Thompson 2000). - Limite di quantificazione (LOQ): LOQ < 0.3 ppb. Attività c Messa a punto e validazione del protocollo di analisi con biosensore doppio integrato in un sistema di analisi elettrochimica in flusso con campionatore a fibra da microdialisi per analisi simultanee online o at-line di glucosio ed alcool in campioni reali del settore viti-vinicolo Saranno effettuate analisi, a differenti velocità di flusso, di soluzioni standard a varie concentrazioni e campioni reali. Determinazione di: - Linearità di risposta: intervallo di concentrazione nel quale la correlazione tra risposta e concentrazione è lineare, valutata in termini di coefficiente di correlazione (r) - Accuratezza: calcolata come 100*Cb/Cr, percentuale della concentrazione (Cb) dell analita determinata con il biosensore rispetto a quella realmente presente nel campione (Cr) - Precisione: calcolata come 100- rsd, dove rsd è la deviazione standard relativa della concentrazione di analita, determinata sullo stesso campione analizzato 10 volte Protocollo di analisi con biosensore doppio validato Risultati: - Linarità di risposta r > 0, Accuratezza: 100*Cb/Cr nell intervallo % - Precisione: 100-rsd > 95% - Stabilità di risposta (SR): SR > 1 settimana

127 consecutive - Stabilità di risposta (SR): tempo durante il quale la risposta del biosensore all analita in condizioni operative rimane costante Attività d Ricerca in banca-dati dei peptidi identificati ed elaborazione statistica dei risultati ottenuti al fine di validare i peptidi marker per ciascuna proteina selezionata Utilizzo dei sistemi di bioinformatica quali FindPept, ProteinProspector ecc. per la ricerca in banche-dati quali SwissProt e NCBI dei peptidi previamente identificati nei digeriti. Almeno due peptidi e due frammenti identificati e validati per ciascun allergene alimentare. 36 Attività c Applicazione dell immunosaggio FP e/o saggio immunocromatografic o (LFD o dipstick) e/o immunosaggio basato su tecnologia SPR sviluppato alla determinazione di allergeni in campioni vino. Sviluppo di un protocollo di estrazione compatibile con l immunosaggio sviluppato. Valutazione dei parametri analitici (sensibilità, accuratezza e precisione) dell immunosaggio applicato alla determinazione di allergeni in campioni vino. Messa a punto di un protocollo di estrazione compatibile con l immunosaggio sviluppato (FP e/o SPR e/o LFD) per almeno due proteine allergeniche. 36 Attività d Allestimento di una procedura metrologica, conforme alla ISO/REMCO 2005, in merito a più specifiche proprietà del misurando al fine di rendere certificabile la miscela. Preparazione di materiale di riferimento in miscela ed in matrice. Misure gravimetriche con relativo calcolo dell incertezza sul titolo dei singoli fitofarmaci in soluzione. Controllo qualità e determinazione mediante GC- MS/MS ed LC-MS/MS delle miscele prodotte e determinazione dell indice d incertezza dei singoli componenti. Realizzazione di almeno due miscele di fitofarmaci a titolo noto in matrice vino accompagnate da documentazione tecnica di laboratorio comprensiva dei valori relativi alle proprietà misurate, agli indici d incertezza ed alla riferibilità e tracciabilità metrologica adottata. 24 Attività g Analisi di certificabilità delle materie di riferimento in miscela ed in matrice vino Stesura di procedure di produzione dei CMR prodotti secondo ISO EN Stesura di procedure di laboratorio prove di controllo qualità secondo ISO EN Integrazione delle attività di produzione di CRM nel manuale di Qualità di sistema aziendale ISO EN Prove valutative interlaboratorio in conformità ai requisiti della ISO/IEC Conformity assessment- General requirments for proficiency test Realizzazione del Manuale operativo secondo ISO EN ed ISO EN e produzione di certificati d analisi a riferibilità metrologica sulle miscele di fitofarmaci (CMR) prodotte. Individuazione del confezionamento più idoneo ai fini della stabilità e conservabilità delle miscele di CRM. Sinossi di tutte le attività di ricerca ed analisi effettuate in accordo con le ISO

128 Studi di confezionamento e packaging ai fini della certificabilità dei CMR realizzati. Allestimento, organizzazione, conduzione di prove valutative interlaboratorio in conformità ai requisiti della ISO/IEC Conformity assessment- General requirments for proficiency testing Guide ed ILAC G9 e G12. Realizzazione delle procedure di organizzazione e gestione di proficiency test sui CRM prodotti in accordo con la ISO EN Attività c Certificazione del processo di produzione del materiale di riferimento in miscela sulla scorta dei risultati ottenuti dall attivazione del circuito interlaboratorio di Proficiency testing. Accreditamento ai fini della verifica di certificabilità. Organizzazione di tutto il corpus di dati analitici ottenuti nelle varie fasi. Prove ed audit interni a cura del Responsabile Gestione Qualità ed esterni a cura di ispettori dell Ente Internazionale di Certificazione. Prove di laboratorio all interno delle verifiche ispettive interne ed esterne. Certificati di pre-audit, interni ed esterni, effettuati ai fini della certificabilità ISO EN delle miscele prodotte ed ISO EN della nuova metodica sviluppata. 36 Attività b Messa a punto di serbatoi per la stabilizzazione delle vinacce Prove per l ottenimento di un serbatoio con caratteristiche costruttive idonee a conservare inalterate le vinacce/buccette per un periodo di almeno 30 giorni. Parametri qualitativi di mosti/vini ripassati sulle vinacce/buccette conservate per 30 giorni in serbatoio. I valori dei parametri di qualità non devono essere statisticamente inferiori (p=0.05) ai valori di controllo 24 Attività a-b Progettazione, costruzione e messa a punto di un prototipo per il ripasso in continuo di mosto/vino su vinacce/buccette Progettare e costruire un impianto prototipale per il ripasso in continuo di mosto/vino su vinacce o loro componenti Impianto prototipale per il ripasso di mosti/vini su vinacce con una capacità di lt 29 Attività c Isolamento di microrganismi in grado di degradare l OTA Almeno 12 microvinificazioni per l isolamento di microrganismi. Prove in vitro per la capacità degradativi dell OTA da parte dei microrganismi selezionati. Identificazione dei microrganismi degradatatori Isolamento di almeno un ceppo microbico con valenza enologica in grado di degradare l OTA (> 10%)

129 Attività b-c Nuove conoscenze sull attività enzimatica/metabolica del microbioma presente durante la fermentazione vinaria associato alla degradazione dell OTA Annotazione delle sequenze e validità dei dati di metatrascrittomica ottenuti Identificazione di nuovi geni e/o di geni già conosciuti relativi ad attività enzimatiche di interesse espresse durante la fermentazione vinaria. Identificazione di almeno un gene espresso correlato ad una attività enzimatica degradativa dell OTA 36 Attività a-b Conoscenza sugli enzimi coinvolti nel processo fermentativo e degradativo dell OTA e ottenimento di isolato/i ricombinante in grado di degradare l OTA Gli enzimi identificati durante i processi fermentativi verrano utilizzati individualmente o in combinazione in vitro per varificare la loro capacità di degradazione dell OTA. Tale capacità verrà anche studiata da parte degli isolato/i ricombinante Identificazione di almeno un enzima responsabile della degradazione dell OTA Ottenimento di almeno un isolato microbico ricombinante in grado di esprimere un enzima degradativo dell OTA. (> 10%) 36 Attività b Validazione della metodica sviluppata mediante prove intralaboratorio Allestimento di aliquote delle miscele di fitofarmaci (CMR) in matrice frumento ai fini dell istituzione di un confronto interlaboratorio in accordo con la ISO EN (Proficiency testing) tra tecniche innovative di spettrometria di massa ad alta risoluzione (HR-Orbitrap) e tecniche di spettrometria di massa convenzionali (QqQ) generalmente in uso in laboratori accreditati Analisi delle miscele prodotte a partire da substrati e CRM certificati in accordo con la ISO EN Produzione di un confronto statistico, in conformità alla ISO 13528:2005 Statistical method for use in proficiency testing by interlaboratory comparison dei dati analitici ottenuti dai vari laboratori selezionati ed accreditati ISO Attività f Certificazione dei valori di contaminazione delle singole micotossine mediante proficiency test Invio dei campioni di farine di frumento e mais ad almeno 10 laboratori che determineranno i livelli di DON, ZEA, T2/HT2, FB 1 /FB 2, AFB 1 /B 2 /G 1 /G 2, OTA con metodiche indipendenti. Incertezza dei valori certificati < 30% 36 Attività f Validazione intralaboratorio della metodica analitica sviluppata in tutte le matrici di interesse. Determinazione dei seguenti parametri: - Recuperi e ripetibilità (a 3 livelli di contaminazione intorno ai limiti massimi ammissibili) - Recuperi e ripetibilità in conformità con il regolamento 401/2006/EC - Limiti di rivelabilità compatibili con i limiti massimi ammissibili

130 - Limiti di rivelabilità - Intervallo di linearità - Analisi di materiali di riferimento. - Risultati dell analisi di materiali di riferimento all intermo del range di accettabilità specificato per ciascun materiale. Attività c Verifica delle prestazioni del metodo Analisi con campioni certificati e/o circuiti interlaboratorio (1 per la multi residuale dei fitofarmaci, 10 per le micotossine) Criteri di accettabilità dei risultati: - Falsi positivi (0) - Z-score (+ 2) 18 Attività d Validazione del metodo Parametri da calcolare statisticamente (12) 1 Metodo validato 24 Attività d Validazione intralaboratorio dell immunosaggio FP Verranno determinate le caratteristiche dell immunosaggio FP in termini di precisione e accuratezza attraverso prove di recupero condotte a tre livelli (basso, medio e alto) in triplicato. Conformità ai criteri di accettabilità del Regolamento CE N. 401/ L immunosaggio sarà validato mediante l analisi di campioni naturalmente contaminati con le micotossine di interesse per confronto con un metodo HPLC di riferimento Attività c Validazione intralaboratorio del saggio LF Analisi mediante saggio LF di campioni naturalmente contaminati e confronto con metodo analitico di riferimento. Prestazioni del saggio LF (Accuratezza: 70%. Incertezza di misura: 40%) 34 Attività c Validazione (inhouse) delle rette e dei modelli discriminanti FT-NIR Analisi mediante spettroscopia FT-NIR di campioni naturalmente contaminati e confronto con metodo analitico di riferimento. Metodo semi-quantitativo: incertezza di misura: 40%. Metodo qualitativo: percentuale di corretta classificazione: 80%. 34 Attività b Validazione (inhouse) del metodo basato su naso elettronico con tecnologia MOS Analisi e-nose dei campioni di cereali e prodotti derivati appartenenti al set di validazione. Elaborazione dei segnali dervanti dall array di sensori mediante analisi statistica multivariata. (Analisi della funzione discriminante, DFA). Percentuale di corretta classificazione: 80%. Incertezza di misura: 40%. Tempo totale di analisi: 10 min 36 Attività b Elaborazione di un protocollo di monitoraggio di Pseudomonas spp. Real Time PCR di LAB e di Pseudomonas spp. durante la shelf-life del prodotto Strumenti di microbiologia predittiva per stabilire i criteri per valutare, in tempo reale e prima della messa in commercio, la probabilità del verificarsi dell alterazione del prodotto La mozzarella presenta un aspetto ed un odore normale ed una densità cellulare di Pseudomonas inferiore a ufc/g, dopo 14 giorni

131 durante la shelf-life. Attività a Confronto pomodoro terreno/senza suolo Analisi qualitative sui frutti. Analisi dei metalli pesanti su foglie frutti e radici. Rapporto tecnico dell influenza del sistema di coltivazione (terreno/senza suolo) sulle analisi qualitative dei frutti e sul contenuto di metalli pesanti in foglie, radici e frutti di pomodoro. 30 Verifica della trasferibilità dei risultati. Attività b Confronto lattuga terreno/senza suolo Analisi di nitrati e sostanza secca nella porzione edule. Analisi dei metalli pesanti su foglie e radici. Report tecnico dell influenza del sistema di coltivazione (terreno/senza suolo) sulla sostanza secca, nitrati e contenuto di metalli pesanti in foglie e radici di due cultivar di lattuga. 28 Verifica della trasferibilità dei risultati. Attività a Innesto erbaceo su pomodoro al fine di ridurre il contenuto di metalli pesanti nei frutti di pomodoro Prova di pomodoro allevato su terreno e senza suolo della durata di 4 mesi (2 sistemi di coltivazione x 3 portainnesti x 3 ripetizioni = 18 parcelle elementari) Report tecnico dell influenza del tipo di portainnesto adottato sul contenuto di metalli pesanti in foglie radici e frutti di pomodoro. 34 Produzione e analisi qualitative sui frutti. Analisi dei metalli pesanti su foglie frutti e radici. Riduzione dell accumulo di metalli pesanti con almeno un portainnesto rispetto al testimone non innestato. Attività b Tecniche innovative per ridurre l accumulo di metalli pesanti (lattuga) Prova di lattuga allevata senza suolo della durata di 3 mesi (2 cultivar x 3 livelli di ph x 3 ripetizioni = 18 parcelle elementari). Report sull influenza del ph della soluzione nutritiva sul contenuto di metalli pesanti in foglie e radici di due cultivar di lattuga. 36 Analisi di nitrati e sostanza secca nella porzione edule. Analisi dei metalli pesanti su foglie e radici. Attività c Valutazione dei processi che riducono l accumulo di metalli pesanti mediante raggi X di sincrotrone Analisi di diversi organi di pomodoro e lattuga mediante luce di sincrotrone Mappature di distribuzione di metalli pesanti in foglie, radici e frutti di pomodoro e lattuga (solo radici e foglie) e interpretazione in relazione alla tecnica di coltura utilizzata 36 Attività a Identificazione dei siti di accumulo preferenziali dei metalli pesanti nelle diverse matrici Analisi quali-quantitative di metalli pesanti condotte su campioni reali mediante spettroscopia ATR-FTIR Documento tecnico operativo, ovvero un protocollo relativo alla rivelazione dei siti di accumulo dei metalli

132 alimentari. Protocolli definitivi per la rivelazione immediata mediante ATR-FTIR differenziale della contaminazione alimentare da metalli pesanti. differenziale. pesanti presenti nelle diverse matrici alimentari Attività b Individuazione di materiali ad alta affinità e selettività per ioni metallici tossici (nichel, cobalto, cromo, cadmio), idonei alla preparazione di strati attivi stabili. Definizione di parametri analitici (sensibilità, selettività, ecc.) di sensori chimici a trasduzione ottica nel range IR basati sugli strati attivi selezionati. Prove di sensibilità, selettività, stabilità, limite di rivelabilità, rapidità di risposta, riutilizzabilità per ogni materiale selezionato (complessivamente circa 300 test). Analisi degli spettri IR differenza. Individuazione dei materiali ottimali da utilizzare in sensori chimici a trasduzione ottica per la detection di Ni, Cd, Co, Cr in matrici acquose. 24 Attività c a) Individuazione dei materiali, della tipologia di deposizione e dello spessore degli strati attivi da utilizzare per la funzionalizzazione di cristalli di quarzo piezoelettrico, che garantiscono le migliori prestazioni analitiche per i metalli pesanti. b) Definizione delle prestazioni di sensori piezoelettrici per l analisi di metalli pesanti da utilizzare in azienda. a) Deposizione dei migliori materiali selezionati per la detection dei diversi metalli pesanti mediante sensori piezoelettrici. b) Analisi quantitative di metalli pesanti in matrici acquose alimentari reali, condotte in azienda alimentare mediante bilance piezoelettriche dotate di cristalli di quarzo funzionalizzati. a) Documenti tecnici operativi, ovvero protocolli per la deposizione di strati attivi selezionati su cristalli di quarzo piezoelettrici. b) Nuovi sensori piezoelettrici per l analisi quali/quantitativa di metalli pesanti

133 Attività a-c Realizzazione del prototipo del sistema Real Time PCR che comprende: il chip in silicio (lab-on-chip), lo strumento di ciclatura termica e lettura ottica, il software di controllo e analisi. Prove di verifica del sistema di Real Time PCR e confronto con i risultati ottenuti con l utilizzo di strumentazione da laboratorio standard per verificarne la congruenza. Prove per la realizzazione di 4 prototipi Prove di controverifica dei laboratori con utilizzo del prototipo (2 campioni per chip) Confronto di coppie di dati dei risultati ottenuti dalle analisi molecolare e prototipali 4 Prototipi validati (con significatività dei risultati del minimo 95%) 36 SCALE UP INDUSTRIALE Task Sperimentazione su scala industriale del protocollo biotecnologico per la minimizzazione dello sviluppo di lieviti di B. Bruxellensis e che riduca la presenza di etilfenoli nel vino Analisi chimico-fisiche per i principali composti di interesse enologico (etanolo, acido totale, acido volatile, acido malico, ph, acido lattico, glucosio, fruttosio, zuccheri riducenti, ecc. ecc.). Analisi cromatografiche per la determinazione analitica dei composti responsabili della qualità sensoriale del vino, delle principali ammine biogene e dell ocratossina. Tutte le analisi saranno condotte in triplicato per il numero delle vinificazioni sperimentali. Saranno realizzate anche analisi sensoriali sul prodotto finito. Documento tecnico riportante le schede qualitative relative alle vinificazioni con le analisi di base, i principali dati sulla qualità sensoriale, livello di ammine biogene ed ocratossina, risultati dell analisi sensoriale. 36 Task Validazione a livello semi-industriale della soluzione tecnologica a basso impatto ambientale Verifica dell efficacia dei trattamenti con ozono nel prevenire/ridurre lo sviluppo di insetti, batteri alterativi, funghi tossigeni e micotossine nelle cariossidi di frumento. Ottimizzazione dei parametri sperimentali (tempi di contatto, concentrazioni di ozono, temperatura di trattamento) in prove presso l azienda, senza alterare la qualità del frumento e delle farine. Determinazione della mortalità degli insetti, della riduzione della carica microbica e dei livelli di micotossine prima e Mortalità degli insetti, batteri alterativi e funghi micotossigeni dell ordine del 80-90%. Percentuale di abbattimento delle micotossine (in particolare deossinivalenolo e ocratossina A) in cariossidi di frumento del 60-70%

134 dopo i trattamenti di cariossidi di frumento con ozono/acqua ozonizzata. Valutazione dell effetto dei trattamenti sulla qualità delle cariossidi attraverso le analisi del colore, odore, acidi grassi, trigliceridi, proteine, zuccheri e vitamine delle cariossidi prima e dopo i trattamenti con ozono/acqua ozonizzata. Task Sperimentazione su scala industriale del protocollo biotecnologico per il controllo di Pseudomonas spp. su latti di origine e storia tecnologica diversa. Prove di inibizione di Pseudomonas in mozzarella. Selezione di almeno 1 condizione di applicazione del protocollo biotecnologico nella quale la mozzarella presenta un aspetto ed un odore normale ed una densità cellulare di Pseudomonas inferiore a ufc/g, dopo 14 giorni. 36 Task Applicazione in azienda in condizioni operazionali della metodica basata sul biosensore doppio. Allestimento del protocollo, valutazione della riproducibilità tra operatori durante l analisi simultanea di glucosio ed etanolo in matrici reali lungo tutta la filiera. Confronto dei risultati con quelli ottenuti con metodi di analisi classica operanti in azienda. - Tempo di start-up (t su ): tempo impiegato dal personale per allestire il protocollo. - Velocità di campionamento (VC): numero di campioni giornaliero analizzato. - Riproducibilità: precisione (RSD R ) valutata mediante analisi di campioni reali e materiali certificati di riferimento, eseguite da operatori diversi con lo stesso metodo e strumentazione. - Test t di student accoppiato: confronto del valore t sperimentale (t s ) con il valore t critico (t c ) tabulato - t su < 30 minuti - VC > RSD R < 23% - t s < t c al 95% di livello di confidenza 36 Task Applicazione in azienda in condizioni operazionali della metodica per l ocratossina A. Allestimento del protocollo, valutazione della riproducibilità tra operatori durante l analisi di matrici reali lungo tutta la filiera e di materiali certificati di riferimento. Confronto dei risultati con quelli ottenuti con metodi di analisi classica operanti - Tempo di start-up (t su ): tempo impiegato dal personale per allestire il protocollo. - Tempo d analisi (t a ): tempo complessivo di campionamento con MEPS ed analisi cromatografica. - Accuratezza: calcolata come 100*Crd/Cr, percentuale della concentrazione (Crd) dell analita determinata nel campione reale o materiale di riferimento certificato rispetto a quella realmente presente nel campione (Cr). - t su < 1 ora - t a < 40 minuti per campione % per concentrazioni di 1-10µg/kg; % per concentrazioni inferiori a 1µg/kg. - RSD R < 23% - t s < t c al 95% di livello di confidenza

135 in azienda. - Riproducibilità: precisione (RSD R ) valutata mediante analisi di campioni reali e materiali certificati di riferimento, eseguite da operatori diversi con lo stesso metodo e strumentazione. - Test t di student accoppiato: confronto del valore t sperimentale (t s ) con il valore t critico (t c ) tabulato. Task Validazione interlaboratorio dell immunosaggio FP sviluppato per almeno due micotossine in almeno due matrici. Verranno determinate le caratteristiche dell immunosaggio FP in termini di precisione (ripetibilità e riproducibilità) e accuratezza attraverso prove di recupero condotte a tre livelli (basso, medio e alto) in triplicato e attraverso l analisi di campioni naturalmente contaminati. Conformità ai criteri di accettabilità del Regolamento CE N. 401/ Task Verifica della fattibilità di rilevamento dei patogeni nelle 18 ore di tempo dall arrivo delle mezzene alla loro destinazione lungo la linea di produzione. Esecuzione di una serie di campionamenti (24 per patogeno, in duplicato) sulle carni e sull ambiente, 24 set analizzati con metodo microbiologico ed 24 set analizzati mediante i due biosensori specifici per i due patogeni Rapporto tecnico sull efficienza (rapidità: 18 ore) (sensibilità: 10 cfu/ml) e applicabilità validata dei metodi molecolari a biosensori sui campionamenti lungo la filiera di produzione 24 Task Validazione del protocollo di stabilizzazione delle vinacce e dell impianto prototipale Conservare 5 lotti di vinacce o loro componenti in serbatoi coibentati nelle condizioni ottimizzate in precedenza. Monitorare la carica microbica delle vinacce ad inizio e fine conservazione. Monitorare i parametri qualitativi di mosti/vini prima e dopo il ripasso sulle vinacce conservate/stabilizzate. Prove di rimozione dell OTA da 3 lotti di mosti/vini contaminati da OTA utilizzando l impianto prototipale. Analizzare tutti i campioni di mosto/vino per l OTA e i parametri qualitativi prima e dopo il ripasso con l impianto prototipale Vinacce stabilizzate per almeno 30 gg. I valori medi di carica microbica delle vinacce stabilizzate non devono essere statisticamente diversi (p=0.05) dai valori medi di vinacce fresche. I valori dei parametri di qualità dei mosti/vini prima e dopo il ripasso su vinacce stabilizzate non devono essere statisticamente diversi (p=0.05). Ripasso completo eseguito in meno di 5 ore. - Riduzione di almeno il 90% dell OTA. - I valori dei parametri di qualità non devono essere statisticamente inferiori (p=0.05) ai valori di controllo

136 SECONDA PARTE 1) ELEMENTI PER LA VALUTAZIONE DELL'EFFETTO INCENTIVANTE DELL'INTERVENTO PUBBLICO La compagine sociale del Distretto Agroalimentare Regionale (DARe s.c.r.l.) oltre a prevedere la totalità degli organismi di ricerca presenti nella Regione Puglia, ha al suo interno n. 93 imprese operative nel settore agroalimentare. Delle 93 imprese socie solo una parte marginale non avrà un ruolo nelle attività da realizzare per i progetti che DARe sta candidando in risposta al presente avviso. Rientrano nella compagine sociale di DARe alcune imprese di grande dimensione e piccole e medie imprese (PMI) che costituiscono la maggioranza della componente imprenditoriale. Tenendo presente che il settore agroalimentare, nella sua parte imprenditoriale, è un settore caratterizzato da una bassa intensità di innovazione e nel quale vi è una scarsa attenzione all attività di ricerca e sviluppo. Oltretutto, la maggior parte delle imprese è di piccola dimensione e di conseguenza non vi una sufficiente quota di risorse finanziarie da destinare ad attività di ricerca e sviluppo. A tale scopo le attività di ricerca previste nei progetti che DARe si accinge a presentare consentiranno alle imprese partner di aumentare, certamente nel breve periodo, i rispettivi costi di ricerca, inducendo un attenzione crescente verso la tematica della ricerca e sviluppo sostenuta anche grazie ad un crescente numero di impiegati e tecnici coinvolti nelle attività. La stessa considerazione può essere fatta per le grandi imprese coinvolte nelle progettualità. Solo che, a differenza delle PMI, per quest ultime l effetto incentivante è determinato dall elevato rischio di insuccesso dei risultati delle attività progettuali da realizzare. Inoltre, le attività di ricerca previste nelle progettualità permetterebbero alle grandi imprese coinvolte di beneficiare di una tempistica certa per quel che riguarda il raggiungimento dei risultati, positivi o negativi che siano, tempistica sicuramente inferiore rispetto al caso di realizzazione delle stesse attività senza alcun beneficio esterno. In definitiva, per quanto sopra detto, il progetto, in assenza dell intervento pubblico: - potrebbe non essere realizzato, - nel caso venisse realizzato, presenterebbe obiettivi ridimensionati, quindi meno ambiziosi. Con la realizzazione del progetto infine, si potrà pervenire a risultati di avanguardia rispetto allo stato dell'arte nazionale e almeno allineati a quello mondiale e che consisteranno anche in dimostratori non immediatamente trasferibili alla produzione industriale. 2) CARATTERISTICHE INNOVATIVE E TECNICO-SCIENTIFICHE Le caratteristiche innovative tecnico-scientifiche del progetto S.I.Mi.S.A verranno descritte in relazione ai tre principali ambiti di riferimento, ovvero il miglioramento della sicurezza di vino, cereali e prodotti derivati, prodotti freschi. Per ogni ambito di riferimento verranno descritti: - contributo del progetto alla soluzione delle problematiche di ricerca e sviluppo, - novità e originalità delle conoscenze acquisibili, - utilità delle conoscenze acquisibili. Le problematiche di ricerca affrontate e le relative soluzioni che si intendono sviluppare vedranno il coinvolgimento sinergico degli enti di ricerca e delle aziende coinvolte nel progetto. Le attività di ricerca industriale saranno in parte orientate a rispondere a specifiche esigenze delle aziende in merito a problematiche specifiche da esse evidenziate (p.es. necessità di metodiche affidabili per contaminanti sottoposti a regolamentazione, riduzione dei tempi e dei costi delle analisi, procedure di decontaminazione/detossificazione), e in parte saranno rivolte a sviluppare problematiche emergenti rispetto alle quali i ricercatori hanno sensibilizzato le aziende stesse (per esempio studio di contaminanti emergenti, applicazione di tecnologie innovative). In tutti i casi gli strumenti di prevenzione/controllo/correzione sviluppati saranno caratterizzati da facilità di trasferimento tecnologico e implementazione in azienda. 136

137 UVA e VINO Il progetto prevede la messa a punti di strumenti innovativi che garantiscano elevati standard di sicurezza della filiera vitivinicola. Considerato il grado di avanzamento delle conoscenze disponibili tra i partner è stato possibile progettare interventi a tre diversi livelli: prevenzione, con l inibizione dello sviluppo di lieviti indesiderati e della produzione di etil fenoli; controllo dei principali contaminanti, quali ocratossina, allergeni, fitofarmaci; correzione, rimediante nuove strategie di decontaminazione e degradazione dell ocratossina. Contributo del progetto alla soluzione di problematiche di ricerca e sviluppo La proposta progettuale prevede la messa a punto di un protocollo biotecnologico per inibire lo sviluppo di lieviti indesiderati del genere Brettanomyces e ridurre la presenza di etilfenoli nel vino. Il piano sperimentale si basa sulla comprensione dei fenomeni e delle cause alla base dello sviluppo microbico indesiderato. La sperimentazione proposta infatti prevede, coerentemente con l indirizzo industriale della ricerca progettata, azioni preventive (management delle risorse microbiche e monitoraggio dei parametri chimico-fisici delle vinificazioni) e correttive (impiego di pareti cellulari di lievito), entrambe basate sull applicazione dello studio dell ecologia microbica. Le variabili del processo di produzione di cui si prevede l implementazione per risolvere il problema Brettanomyces presentano indubbi vantaggi secondari sull economia, sulla qualità e sulla sostenibilità della produzione. Infatti il trasferimento dei risultati che saranno conseguiti potrà migliorare contribuendo a migliorare il posizionamento della produzione vinicola pugliese, ancora rappresentata da una enologica logica produttiva che guarda alla quantità piuttosto che alla qualità del prodotto finale. Le azioni preventive possono, peraltro, migliorare la qualità globale del vino, specie sotto gli aspetti sensoriali (aromi di fermentazione, inibizione di microorganismi deterioranti) e salutistici (riduzione di ammine biogene). L impiego delle pareti cellulari di lievito contribuiranno anche alla riduzione dell ocratossina A, eventualmente presente nelle produzioni. Il progetto ambisce al superamento della carenza nella preziosa integrazione verticale della ricerca e sviluppo nella filiera vino, producendo ricadute sostanziali sui relativi costi di produzione e sul miglioramento delle performance fermentative. Lo studio della fattibilità economica del varo di uno spin-off universitario-aziendale è da intendersi come un analisi funzionale al potenziale trasferimento tecnologico delle soluzioni attese, in maniera tale da realizzare un ulteriore dimensione all innovazione prodotta. Il progetto prevede lo sviluppo di metodiche analitiche innovative per la determinazione di importanti contaminanti nel vino, quali ocratossina, allergeni e fitofarmaci. Per quanto riguarda la determinazione dell ocratossina A verranno sviluppate metodiche rapide, accurate e a basso costo, che potranno essere facilmente implementate nelle aziende vitivinicole. La selezione delle uve in fase di vendemmia, infatti, può limitare in misura significativa il tenore in OTA nel vino, evitando sprechi in termini di prodotto acquisito e di economia aziendale. Le metodiche sviluppate consentiranno alle aziende di procedere autonomamente alla determinazione di questo contaminante, utilizzando il protocollo di analisi validato nei propri laboratori. L impiego del metodo analitico proposto, porterà ad un duplice vantaggio: produttivo, dato che il suo utilizzo nel laboratorio dell azienda comporterà una velocizzazione dei controlli e quindi della trasformazione della materia prima, ed economico, con un risparmio nei costi di analisi affidate a terzi ed un miglioramento qualitativo del prodotto. Per la determinazione di allergeni si prevede invece di sviluppare approcci alternativi basati su metodiche avanzate di spettrometria di massa in alta risoluzione, che consentano la determinazione simultanea con elevata accuratezza di allergeni di latte e di uovo in vini chiarificati. Per lo sviluppo delle metodiche rapide verranno valutate diverse tecnologie (polarizzazione di fluorescenza, lateral flow devices, risonanza plasmonica di superficie) che già hanno dato risultati soddisfacenti per la rivelazione di altri contaminanti, ma che rimangono ad oggi poco esplorate nel campo della determinazione degli allergeni. I metodi rapidi che si intendono mettere a punto mireranno a soddisfare le seguenti caratteristiche: i) capacità di analizzare un singolo allergene all'interno della matrice vino in un ampio intervallo di concentrazione; ii) tempo di analisi relativamente breve; iii) elevata affidabilità e infine capacità di fornire risultati accurati e ripetibili. Per l analisi dei fitofarmaci, verranno sviluppate metodiche multi residuali per la determinazione simultanea di centinaia di principi attivi in risposta all esigenza espressa dai laboratori di controllo di aumentare il numero di controlli effettuabili a parità di tempo, di personale e di costo. In particolare la combinazione di tecniche di spettrometria di massa/massa e ad alta risoluzione permetterà di sviluppare rispettivamente approcci targeted, dedicati agli analiti sottoposti a regolamentazione, e untargeted volti alla 137

138 indagine sulla presenza di fitofarmaci, metaboliti e/o prodotti di degradazione. Accanto ad una rigorosa procedura di preparazione e certificazione dei mix di materiali di riferimento proposti, l implementazione di metodiche multi residuali targetet e untargeted di un maggior numero di composti contribuirà al miglioramento del monitoraggio tossicologico e della sicurezza alimentare, garantendo una maggiore qualità del dato analitico prodotto, una migliore tracciabilità e riferibilità dei dati analitici, oltre che un incremento nella armonizzazione dei dati ottenuti da differenti laboratori regionali, nazionali ed internazionali. Il progetto si prefigge inoltre l obiettivo sviluppare strategie innovative per la decontaminazione/degradazione dell ocratossina (OTA). Una delle problematiche che il progetto intende risolvere è quella di rimuovere più del 90% dell OTA dai mosti/vini contaminati senza alterarne la qualità. Ad oggi non esiste un metodo efficace di rimozione dell OTA che possa garantire questo risultato. Si prevede di sviluppare un sistema avanzato di ripasso in continuo dei mosti/vini su vinacce/buccette che sarà il frutto dell integrazione delle competenze scientifiche dell ISPA e tecnologiche dell Industrie Fracchiolla. La competitività tecnologica del prototipo lo renderà molto appetibile sui mercati nazionali ed internazionali, con particolare riferimento alle regioni vitivinicole maggiormente a rischio OTA. Particolare attenzione sarà dedicata sia alla valutazione dell efficacia di stabilizzazione delle vinacce e dei parametri da utilizzare per l ottenimento della stessa, sia alla progettazione e sperimentazione del prototipo per il ripasso in continuo. Nell ambito delle attività del progetto verranno inoltre ottenute approfondite informazioni molecolari utili per l identificazione di microrganismi ed enzimi di origine microbica coinvolti nel processo di detossificazione/degradazione di OTA, per la successiva implementazione di un efficace sistema di decontaminazione della tossina da mosti e/o vino. L approccio innovativo sarà quello dell utilizzo di nuove tecnologie molecolari coltura indipendenti che mirano a caratterizzare i profili metabolici dei microrganismi presenti in un certo habitat mediante amplificazione e sequenziamento di sequenze geniche direttamente dal campione ambientale. A tal riguardo le due istituzioni coinvolte hanno maturato una comprovata esperienza e competenze specifiche nella produzione ed analisi di dati molecolari relativi a microrganismi che ben si integrano per il conseguimento degli obiettivi proposti Novità e originalità delle conoscenze acquisibili La novità dell approccio proposto per la inibizione dello sviluppo di B. bruxellensis permetterà di ottenere dei risultati innovativi rispetto all attuale stato dell arte della tematica in oggetto: - Sviluppo, validazione e pubblicazione della prima metodologia di real-time PCR unita all analisi HRM (high-resolution melting curve) per l identificazione e quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino. L analisi HRM è una tecnica innovativa per analisi routinarie di mutazioni geniche in quanto rapida, accurata, semplice, e economica. L applicazione di tale tecnologia avanzate di tipo molecolare, consentirà di ottenere sia una quantificazione assoluta del titolo di inoculo del lievito e sia l identificazione dei differenti ceppi del contaminante presenti. - Allestimento della prima collezione di ceppi autoctoni pugliesi appartenenti alla specie di B. bruxellensis. - Valutazione, analisi e pubblicazione dello studio sulla biodiversità genetica presente nei ceppi autoctoni di B. bruxellensis e della presenza fenoli volatili (etil-derivati) nei vini pugliesi. - Pubblicazione del primo studio di analisi trascrittomica realizzato su B. bruxellensis in vivo (direttamente nel sistema mosto-vino). Infatti, gli unici dati sinora disponibili in letteratura si riferiscono ad uno studio effettuato unicamente mediante PCR real-time quantitativa. - Valutazione, analisi e pubblicazione dello studio di riduzione degli etil-derivati prodotti da B.bruxellensis in vino mediante impiego di pareti cellulari di lievito. - Valutazione, analisi e pubblicazione del primo studio, inerente l applicazione di un approccio ecologico per la soluzione delle problematiche connesse con la presenza di B. bruxellensis in vino. Tale studio prevederà, differenti impieghi delle risorse microbiche di interesse enologico (in particolare Saccharomyces cerevisiae e Oenococcus oeni) per inibire e ridurre la sviluppo di B. bruxellensis in vino, valutando l effetto di differenti biotipi, di colture starter mono- e multi-strain-ceppo, inoculo di lieviti e batteri in forma scalare e come coinoculo coinoculi, Gli interventi proposti avranno ricadute su altri importanti aspetti qualitativi ed economici della produzione vinicola, in quanto una corretta gestione microbiologica di cantina permetterà di valorizzare l apporto sensoriale di lieviti e batteri, sfavorendo la produzione di sottoprodotti microbici indesiderati e nocivi per la salute umana, tra cui le ammine biogene. Inoltre, l utilizzo di pareti cellulari di lieviti potrebbe contribuire anche alla riduzione del contenuto di ocratossina A, in vini eventualmente contaminati. Lo studio proposto, peraltro, è il 138

139 primo che valuterà l importanza dell impiego razionale in vino di colture microbiche starter per ridurre non solo la produzione di etil-derivati da parte di B. bruxellensis in vino, ma anche la produzione dei precursori, i vinil-derivati, da parte del lieviti e batteri autoctoni. - Pubblicazione di una review sull importanza del management microbico in cantina per la riduzione dei rischi causati da B. bruxellensis in vino. - La divulgazione dei principali risultati innovativi ottenuti si realizzerà anche attraverso la partecipazione con comunicazioni orali e poster a convegni e seminari sull argomento. La possibilità di una determinazione at-line dell OTA rappresenta un opportunità per l azienda per assicurare standard qualitativi più elevati e risparmi di costi e tempi grazie ad azioni preventive di monitoraggio dei prodotti in entrata. Questo controllo può essere possibile solo se l Azienda ha a disposizione metodiche analitiche di facile utilizzo, rapide, economiche e validate. L utilizzo delle MEPS come sistema di estrazione/preconcentrazione dell OTA sembra essere quello più promettente per raggiungere gli obiettivi prefissati. La novità delle metodiche multi residuali per la determinazione di fitofarmaci risiederà soprattutto nell utilizzo di metodologie di spettrometria di massa in alta risoluzione che permetteranno lo sviluppo di approcci untargeted. L analisi multiresiduale così concepita introduce nuovi aspetti diagnostici nell analisi quali/quantitativa di routine, in relazione alla gestione del rischio correlata alla individuazione di molecole nuove nella procedura analitica di controllo. Alcuni recenti lavori riportano lo sviluppo di metodiche LC-MS(MS) per l analisi multi allergenica nei prodotti a base di cereali mentre al momento il settore vino appare ancora scoperto. L analisi in spettrometria di massa potrà fornire nuove informazioni su quelli che sono i potenziali peptidi marker e i relativi frammenti da utilizzare per confermare l univocità dell attribuzione della proteina. A tal proposito alcuni peptidi marker delle caseine sono stati recentemente identificati tramite LC-MS nel vino chiarificato come dimostrato da uno studio condotto presso l ISPA-CNR. Allo scopo di avere saggi di facile implementazione lungo tutta la filiera alimentare, gli sforzi sono stati finora mirati prevalentemente allo sviluppo di metodiche rapide e semplici nell esecuzione basate sull uso di lateral flow devices (LFD). L applicazione di tecniche di risonanza plasmonica di superficie (SPR) e polarizzazione di fluorescenza (FP) per lo sviluppo di immunosaggi per la determinazione di allergeni in vini chiarificati rappresenta invece in settore ad oggi assolutamente inesplorato. I risultati degli studi condotti nell ambito di questa attività contribuiranno pertanto in maniera significativa all avanzamento delle conoscenze in questo campo. Ad oggi il ripasso dei mosti/vini su vinacce risulta l unica tecnica eco-compatibile e naturale che rimuove selettivamente l OTA ma ancora non utilizzabile in pratica nelle cantine. Attualmente le cantine utilizzano diversi agenti chiarificanti, contenenti carbone attivo che, pur rimuovendo l OTA, riducono drasticamente la qualità del vino (indice di colore, corpo, resveratrolo e altre sostanze antiossidanti). Le nuove conoscenze acquisibili con le attività di ricerca proposte in questo progetto permetteranno di mettere a punto un sistema di decontaminazione selettiva ad elevata efficienza e integrabile con i normali processi di vinificazione a livello industriale. In particolare si prevede di aumentare l efficienza di decontaminazione a livelli superiori al 90% in tempi ridotti e di mettere a punto le condizioni necessarie a stabilizzare le vinacce o suoi componenti per un periodo che copra i tempi della vendemmia. L implementazione tecnologica di questi risultati rappresenta un altra importante novità di questa proposta progettuale in quanto è prevista anche la progettazione/sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo ad elevata efficienza (rimozione del > 90% di OTA tempo di ripasso minre di 5 ore, stabilizzazione delle vinacce/buccette per almeno 30 giorni). La possibilità di poter stabilizzare le vinacce/buccette per un periodo di almeno 30 gg permetterà di eliminare le criticità connesse con il reperimento e la conservazione di vinacce/buccette fresche non stabilizzate. Quindi la produzione del suddetto impianto da parte delle Industrie Fracchiolla rappresenterebbe l unica soluzione in grado di decontaminare il mosto/vino dall OTA lasciandone inalterate le caratteristiche organolettiche. L approccio metatrascrittomico, previsto nell ambito dell OS 3.2, risulta una procedura di ormai comprovata validità per lo studio su ampia scala dei profili metabolici di comunità microbiche, quali ad esempio quelle del suolo e degli ambienti marini. Tale approccio ha l importante vantaggio di superare la necessità di isolare e mettere in coltura gli individui appartenenti a ciascuna specie permettendo, così, di includere nell analisi anche gli organismi non coltivabili in laboratorio. L analisi del complesso microbioma caratterizzante le diverse fasi della fermentazione vinaria sarà affrontata per la prima volta con questo approccio di metatrascrittomica che consentirà, al di là dell obiettivo previsto, una conoscenza più approfondita dell intensa attività metabolica presente e potenzialmente sfruttabile a fini biotecnologici 139

140 Utilità delle conoscenze acquisibili I risultati attesi nell ambito di questa proposta progettuale ambiscono a ridurre notevolmente la produzione persa a causa delle problematiche connesse con lo sviluppo di B. bruxellensis nel vino che è i grado di produrre quantità di fenoli volatili oltre la soglia di percezione, dequalificando così il prodotto con conseguenti danni economici. Tale quota di produzione, in cantina, è stimata poter incidere comportando un fatturato inferiore del 20% della produzione totale, con un danno economico annuale che si aggira euro. Inoltre, i vantaggi la sperimentazione proposta porterà un implementazione del processo, producendo miglioramenti del profilo sensoriale dei vini e una diminuzione di sotto-prodotti microbici tossici in essi eventualmente contenuti, con una ricaduta economica stimabile in un aumento di vendite del 4-5 %, ulteriore corrispondente ad fatturato annuale di circa euro. le ricadute dei risultati previsti inerenti alla riduzione del contenuto in ammine biogene dei vini regionali accresceranno la competitività delle nostre produzioni in ambito Internazionale. Infatti, il rispetto dei limiti sulla concentrazione minima di ammine biogene nei vini importati imposti dalle legislazioni,di diversi Paesi ed in via di adozione da parte dell Unione Europea, rappresenta un fattore cruciale per l export italiano vinicolo. E inoltre da considerare, se pur difficilmente quantificabile da un punto di vista economico, che una più adeguata gestione delle risorse microbiche in cantina permetterà alle aziende pugliesi di produrre vini con potenzialità di mercato innovative e consumer-oriented. Tali possibilità si potranno sviluppare nel medio-lungo periodo, e protranno essere concretizzabili a patto che venga sviluppato e trasferito alla filiera produttiva l adeguato know-how in merito al management della microflora vinaria e delle colture starter impiegate. La disponibilità di un protocollo validato per la determinazione rapida dell OTA, consentirebbe alle aziende vitivinicole di incrementare la competitività sul mercato mondiale enologico, che richiede, sempre più, vini di qualità. La possibilità di determinare l ocratossina A in maniera rapida ed accurata, comporterà un accelerazione nella selezione delle uve e nell avvio delle fasi di trasformazione, con conseguente miglioramento della qualità e sicurezza del vino. I metodi sviluppati per l analisi degli allergeni con particolare riferimento a quelli rapidi potranno essere per un monitoraggio costante lungo tutta la filiera viti-vinicola in grado di rilevare in tempo reale la presenza dei principali allergeni potenzialmente contaminanti i vini chiarificati. Questo permetterà alle aziende di allinearsi a quanto previsto dalla direttiva 2007/68/CE che disciplina i 14 allergeni alimentari che è obbligatorio indicare sull etichetta qualora utilizzati nella produzione degli alimenti. Recentemente l EFSA è stata chiamata ad esprimere un parere sull eventuale contenuto di residui di proteine allergeniche rimaste nei vini dopo i trattamenti di chiarifica. Le informazioni ottenute, soprattutto mediante le analisi LC-MS(MS), potranno rappresentare un importante contributo in questo contesto. Le metodiche LC-HRMS per la determinazione di fitofarmaci corredate da materiali di riferimento certificati contenenti fino a 600 principi attivi rappresentano un prodotto/servizio che al momento non esiste sul mercato e che supporterà notevolmente gli utilizzatori nella fase di verifica dell accuratezza del dato analitico prodotto. Un ulteriore e non trascurabile vantaggio dell analisi untargeted risiede inoltre nella possibilità di effettuare ricerche a posteriori di composti inizialmente non considerati senza necessità di rianalizzare il campione, cosa che non sempre è possibile e/o consentito nei controlli ufficiali. Gli esiti positivi delle ricerche in merito alla possibilità di decontaminazione da OTA produrrà un ritorno in termini di apporto di nuova tecnologia, prestazioni, competitività e di immagine aziendale sia delle Industrie Fracchiolla ma anche delle cantine e di tutta la filiera vitivinicola pugliese in coerenza con gli obiettivi strategici sia dell impresa che dell intero settore vitivinicolo. La risoluzione del problema OTA nei vini pugliesi è fondamentale per preservarne la sicurezza e la qualità, nonchè migliorare la competitività nazionale e internazionale delle aziende vitivinicole pugliesi. Lo studio di microrganismi per degradare micotossine sembra offrire buone prospettive di sviluppo nel settore agroalimentare. A tal riguardo il progetto apporterà approfondite informazioni molecolari utili per l identificazione di microrganismi autoctoni e di enzimi di origine microbica coinvolti nel processo di detossificazione/degradazione di OTA, per la successiva implementazione di un efficace sistema di decontaminazione della tossina da mosti e/o vino. Tale implementazione potrà essere conseguita mediante adeguati interventi bio-tecnologici basati sull utilizzo di nuovi sistemi biologici (enzimi/microrganismi) il cui utilizzo non pregiudichi la qualità del prodotto finale migliorando le procedure di vinificazione delle aziende locali attraverso il trasferimento di procedure e tecnologie innovative. 140

141 CEREALI e PRODOTTI DERIVATI Per i cereali e prodotti derivati il progetto si pone come obiettivo la realizzazione di un complesso sistema di strategie per il miglioramento della la sicurezza alimentare applicabili lungo tutta la filiera. In particolare verranno messe a punto strategie di riduzione dei rischio di contaminazione da microrganismi indesiderati e infestazioni da insetti, che prevedranno interventi di prevenzione e correzione. Un ampia sezione delle attività previste sarà focalizzata sullo sviluppo di strumenti di controllo dedicati ai contaminanti più frequentemente ritrovati nei prodotti in oggetto, ovvero micotossine e fitofarmaci. Le strategie di controllo da sviluppare saranno basate sia su tecnologie avanzate, caratterizzate da elevata sensibilità e elevato numero di informazioni ottenibili, sia su metodiche rapide caratterizzate da facilità di uso e quindi di trasferimento e bassi costi di analisi. Contributo del progetto alla soluzione di problematiche di ricerca e sviluppo In bibliografia sono presenti vari dati da esperimenti effettuati mediante l impiego dell ozono per il controllo di funghi, micotossine ed insetti, ma tutti sono svolti in condizioni non trasferibili ad un impianto industriale. Questo perché le quantità di merce trattate erano limitate (dell ordine di decine di kg), i tempi di contatto richiesti molto lunghi (giorni). Inoltre i test svolti non confrontavano le diverse metodologie applicabili (ozono gassoso e acqua ozonizzata) al fine di individuare quale fosse la migliore tecnica da utilizzare o di studiare ad esempio una azione sinergica tra le due applicazioni. ll presente progetto si propone di superare lo stato dell arte e di sviluppare un prototipo che consenta un raffronto tra le diverse metodologie applicabili, studiare le tecniche che consentano di effettuare i trattamenti su quantità di prodotto e tempi accettabili per i processi industriali delle imprese e infine, verificare come questi nuovi trattamenti impattano sula qualità del prodotto e delle farine. Il prototipo inoltre intende sfruttare le nuove tecnologie di generazione dell ozono (come quelle a plasmi freddi) che consentono consumi energetici molto ridotti e la realizzazione di impianti di ridotte dimensioni. Il prototipo poi supererà lo stato dell arte industriale anche in funzione dei sistemi di controllo e sicurezza: dai sensori di rilevazione di ozono per indicare eventuali superamenti delle soglie previste dalle normative vigenti del gas in aria, in modo da garantire la sicurezza degli operati; ai sistemi di rilevazione di ozono in acqua ed in aria per certificare il raggiungimento delle concentrazioni previste per i tempi previsti, ecc.. Ad oggi questo tipo di tecnologia è richiesta da tutte le Aziende del settore, ma non è disponibile nel mercato. La presente idea progettuale si propone di sviluppare metodiche multiresiduali rapide e innovative per la determinazione di centinaia di fitofarmaci in cereali. In particolare la combinazione di tecniche di spettrometria di massa/massa e ad alta risoluzione permetterà di sviluppare rispettivamente approcci targeted e untargeted. La combinazione degli approcci sviluppati consentirà di rispondere ad una duplice esigenza. Se da una parte infatti rimante costante la richiesta di analizzare un elevato numero di specifici principi attivi sottoposti a regolamentazione, dall altra si riscontra la necessità di acquisire nuove conoscenze sui relativi prodotti di trasformazione. Accanto ad una rigorosa procedura di validazione delle metodiche proposte, la disponibilità di miscele di standard e di materiali di riferimento contenenti diversi fitofarmaci contribuirà al miglioramento del dato analitico prodotto garantendo una migliore confronto dei dati ottenuti da differenti laboratori. Tecnologie LC-MS/MS e LC-HRMS saranno inoltre alla base dello sviluppo di metodiche multimicotossina per la per la determinazione simultanea delle micotossine più importanti perché sottoposte a regolamentazione in Europa o perché rappresentano problematiche emergenti (micotossine nascoste). Le attività condotte in quest ambito porteranno allo sviluppo nuovi approcci analitici per la determinazione si questi contaminanti caratterizzati da alta selettività e sensibilità. Fondamentale sarà la validazione di questi metodi supportata dallo sviluppo di materiali di riferimento. Nonostante in letteratura siano riportati numerosi esempi di metodiche LC-MS(MS) multi-micotossina, la maggior parte di queste può essere applicata solo come metodiche di screening proprio a causa della mancanza di una validazione rigorosa. Problemi tipicamente riscontrati nelle metodiche multi-micotossina attualmente disponibili invece di sviluppare metodiche affidabili la cui robustezza e accuratezza verranno verificate mediante rigorose procedure di validazione supportate anche da materiali di riferimento multi-micotossina attualmente non disponibili sul mercato. La recente esperienza dell ISPA nell organizzazione di un proficiency test per il confronto di metodiche LC- MS(MS) per l analisi multi-micotossina nell ambito del progetto europeo MoniQA (FP7), la comprovata 141

142 esperienza dell istituto stesso nello sviluppo e validazione di metodiche analitiche per micotossine, supportate dalle conoscenze disponibili presso la Lab. Instruments sulla certificazione di materiali di riferimento, saranno garanzia dell esito positivo delle attività previste. Sull altro fronte ci si propone di sviluppare metodiche rapide per la determinazione delle principali micotossine basate su tecnologie emergenti quali FP, NIR, LFD basati sull uso di aptameri, applicando quindi i risultati di una ricerca avanzata allo sviluppo di metodiche rapide e a basso costo, facilmente trasferibili. I risultati che si otterranno permetteranno alle aziende pugliesi del settore cerealicolo di poter disporre di metodi di analisi rapidi e innovativi per garantire sicurezza e qualità alimentare delle materie prime e dei prodotti trasformati. I risultati potranno essere estesi anche ad altre realtà produttive nazionali. Va segnalato che le aziende pugliesi agroalimentari, trattandosi di PMI spesso a conduzione familiare, non sempre sono dotate di laboratori interni di controllo qualità e sono spesso costrette a servirsi di laboratori esterni (spesso ubicati nel nord Italia) per effettuare le analisi merceologiche delle loro produzioni. Le tecniche di analisi tradizionali per la determinazione di contaminanti negli alimenti, inoltre, richiedono tempi non compatibili con le esigenze e i costi aziendali e l impiego di personale tecnico altamente specializzato. Ad oggi, metodi rapidi ed affidabili per la determinazione del DON in prodotti derivati del frumento (farina, crusca, farinaccio) e dell OTA e delle tossine T-2 e HT-2 in frumento e prodotti derivati, nel farro e nella pasta di farro non sono stati ancora sviluppati. Il presente progetto si propone quindi di superare i limiti derivanti dalle attuali metodologie attraverso lo sviluppo e validazione di metodi di analisi rapidi e affidabili, prontamente trasferibili, per la determinazione di micotossine nel frumento, farro e prodotti derivati (crusca, farine e pasta). Le tecnologie avanzate che si intende utilizzare quali polarizzazione di fluorescenza (FP), lateral flow devices (LFD), spettroscopia nel vicino infrarosso a trasformata di Fourier (FT-NIR) e naso elettronico con tecnologia Metal Oxide Semiconductors (MOS). In linea con la forte tendenza a sviluppare metodiche multi-analita che includano diverse classi di contaminanti, testimoniata da alcune recenti pubblicazioni, nell ambito del presente progetto ci si propone la messa a punto di una metodica unica capace di determinare in una sola analisi 500 principi attivi di fitofarmaci e le principali micotossine (aflatossine B 1, B 2, G 1, G 2, ocratossina A, deossinivalenolo, zearalenone, fumonisine, tossine T-2 e HT-2). La crescente accessibilità da parte dei laboratori di ricerca e di controllo a spettrometri di massa altamente sensibili e selettivi ha determinato una forte tendenza ad andare nella direzione dello sviluppo di metodiche generiche per la determinazione simultanea di diverse classi di contaminanti, sebbene questo rappresenta un settore ancora poco esplorato. I pochi esempi riportati in letteratura riguardano metodiche di screening che mettono in evidenza le potenzialità di queste tecnologie. Nell ambito di questa proposta progettuale ci si propone invece di affrontare in maniera sistematica le problematiche connesse con la validazione di tali approcci allo scopo di fornire metodiche robuste ed affidabili che soddisfino i criteri di accettabilità imposti dalla legge. Novità e originalità delle conoscenze acquisibili Le strategie di correzione/prevenzione che prevedono l impiego dell ozono per il controllo di funghi, micotossine ed insetti sviluppate nell ambito della presente proposta rappresenteranno il primo esempio di trasferimento in azienda di una tecnologia le cui applicazioni fino ad ora erano limitate ad attività di ricerca. Per quanto riguarda le metodiche multianalita per fitofarmaci e/o micotossine, basate sull uso di tecnologie avanzate di spettrometria di massa, la novità e originalità delle conoscenze che verranno acquisite riguardano diversi aspetti. - Utilizzo di tecnologie full scan in alta risoluzione per l analisi quantitativa. Mentre l utilizzo di spettrometri a triplo quadrupolo rappresenta al momento la tecnica di elezione per l analisi quantitativa di micotossine e fitofarmaci, limitate informazioni sono invece disponibili sulle caratteristiche di metodiche full scan in alta risoluzione, che invece potrebbero risultare un alternativa particolarmente vantaggiosa soprattutto per la possibilità di effettuare anche un analisi retrospettiva dei dati. Lo studio comparativo tra metodiche di rivelazione MS/MS e HRMS condotto nell ambito di queste attività fornirà importanti informazioni sulla corretta applicazione delle suddette metodologie per l analisi quantitativa accurata dei contaminanti in oggetto. - Messa a punto di nuovi protocolli per la produzione di materiali di riferimento multi-analita (micotossine e fitofarmaci) che al momento non sono disponibili sul mercato. 142

143 Tutte le metodiche rapide che si intendono sviluppare saranno caratterizzate da un elevato grado di novità e originalità in quanto esse rappresenteranno, per le matrici cerealicole oggetto della proposta progettuale, i primi esempi di: - uso degli aptameri per la produzione di LFD per la determinazione di OTA, - uso del e-nose e FT-NIR per la determinazione di DON e OTA, - uso della FP per la determinazione di OTA, DON e T-2/HT-2. I risultati ottenuti sia in fase di sviluppo che di validazione delle suddette metodiche rappresenteranno un consistente avanzamento dello stato delle conoscenze scientifiche in questo settore. Utilità delle conoscenze acquisibili I risultati che si otterranno con questo progetto saranno di grande interesse per le Aziende del settore cerealicolo pugliese e nazionale perché consentiranno loro di vendere i loro prodotti a fette di mercato molto più ampie e con una qualità più elevata. Nello specifico lo sviluppo di funghi ed insetti causano perdite di prodotto durante la fase di stoccaggio e conservazione causando perdite economiche ad aziende del settore. Lo sviluppo di nuovi processi di trattamento e di conservazione potrebbe quindi portare a: - una riduzione delle perdite di prodotto, in particolare a tutte le Aziende che stoccano e conservano i prodotti sia pugliesi che nazionali; - un vantaggio competitivo per le Aziende di molitura che potrebbero entrare in quote di mercato oggi occupate da altri paesi esteri offrendo un prodotto di maggior qualità e sicurezza alimentare. Le caratteristiche dei metodi di analisi rapidi e avanzati (multi-analita) che il progetto intende sviluppare, in termini di semplicità, accuratezza, sensibilità e costi, permetteranno alle aziende di effettuare un monitoraggio interno più capillare sia delle materie prime che dei prodotti finiti destinati al consumatore migliorando in maniera significativa l efficienza del controllo qualità nelle filiere alimentari. L applicazione di alcune metodologie che il progetto intende sviluppare (FT-NIR, e-nose) ha inoltre l obiettivo di ridurre il numero di campioni da sottoporre all analisi tradizionali, con notevoli risparmi in termini di tempo e costi. Mentre le metodiche multi-micotossina LC-MS(MS) consentiranno ai laboratori di controllo di verificare la conformità di cereali e prodotti derivati per tutte le micotossine regolamentate in una sola analisi. La stessa considerazione si applica alle metodiche multi residuali per fitofarmaci. L'implementazione in azienda di metodiche innovative di questo livello potrebbe portare ad una serie di commesse analitiche su cereali, sfarinati, pasta e prodotti da forno. BonassisaLab in particolare conta di riportare la grossa parte dei controlli alimentari della filiera cerealicola all'interno della regione Puglia e più settorialmente in Capitanata, tradizionalmente il Granaio d'italia. Tali servizi innovativi sono attualmente svolti nel nord Italia ed all'estero da strutture multinazionali, ma tali servizi ad oggi non soddisfano le esigenze dei grandi produttori, soprattutto per la tempistica molto lunga dei risultati analitici che risulta poco funzionale allo sblocco delle partite dei fornitori che sono localizzati principalmente nel centro sud Italia. L applicazione di metodiche accurate, selettive e sensibili contribuirà al miglioramento della valutazione del rischio di esposizione dei consumatori a micotossine e fitofarmaci in risposta alle richieste della Commissione europea e dei principali organi internazionali (EFSA, WHO-FAO, SCF) che costantemente sottolineano l importanza di dati attendibili sulla frequenza e i livelli di contaminazione. PRODOTTI FRESCHI (mozzarella, prodotti ortofrutticoli, molluschi bivalvi, carni bovine) Il progetto S.I.Mi.S.A prevede infine di sviluppare strategie di intervento per il miglioramento della sicurezza alimentare rivolte a specifiche combinazioni contaminante/alimento di particolare interesse nell ambito delle produzioni pugliesi. In particolare verranno considerati: - patogeni alteranti nelle mozzarelle, - metalli pesanti in prodotti ortofrutticoli freschi e trasformati, - patogeni in molluschi bivalvi e carni bovine. Contributo del progetto alla soluzione di problematiche di ricerca e sviluppo Il progetto contribuisce ad ampliare la gamma di soluzioni al problema delle alterazioni dei formaggi freschi. A titolo di esempio, si consideri che il rilevamento di mozzarelle con colorazione anomala ha avuto una grande risonanza sui mass-media e si presume che le aziende produttrici coinvolte abbiano registrato una perdita di profitti, oltre ad aver accusato un danno alla propria immagine. Di riflesso, l intero comparto dei formaggi freschi a pasta filata potrebbe aver risentito negativamente degli episodi di alterazione resi pubblici nel giugno La soluzione proposta nel progetto, oltre che porre al riparo il produttore dal rischio di 143

144 alterazioni particolarmente importanti a carico di un prodotto, quale la mozzarella, che ha un mercato importante anche al di fuori della regione Puglia, rappresenta un avanzamento tecnologico per l Azienda partner, dal momento che l uso di bio-conservanti è una soluzione innovativa per questa gamma di prodotti. Il progetto prende inoltre in considerazione il problema dell accumilo di metalli pesanti nei prodotti ortofrutticoli causato dall impiego in agricoltura di compost contaminati. Questi contaminanti, oltre che essere potenziali responsabili di inquinamento del suolo, qualora traslocati e accumulati nei diversi organi eduli delle piante orticole possono causare problemi di sicurezza alimentare. Poiché i metalli pesanti tendono ad accumularsi negli organismi viventi e lungo la catena alimentare, il problema nei compost può nascere anche quando questi materiali rispondono alle normative di commercializzazione vigenti, relative alle concentrazioni massime ammissibili di questi elementi. Il progetto, attraverso metodologie consolidate all interno del gruppo di ricerca proponente e strategie innovative, mira ad individuare le modalità d impiego ed i limiti di utilizzo di compost mediante prove sperimentali con sistemi di coltivazione non-tradizionali (senza suolo e mesocosmi confinati contenenti terreno ammendato con compost). L impiego della spettroscopia di fluorescenza di raggi X (XRF), spettroscopia di emissione al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES o ICP-MS), o della voltammetria di stripping anodico, per l analisi dei metalli pesanti nel substrato e nei diversi organi della pianta, consentirà, a seconda della tipologia del campione, una corretta acquisizione dei dati al fine di garantire il rispetto dei limiti imposti per la sicurezza degli alimenti. Tutti gli attuali protocolli per la quantificazione di metalli pesanti in matrici alimentari prevedono diverse fasi, quali la mineralizzazione, estrazione o preconcentrazione, che rendono i tempi di analisi estremamente lunghi e richiedono grandi quantità di reagenti costosi, come acidi forti e chelanti ultrapuri. La possibilità di sviluppare metodi innovativi in grado di rivelare nel campione tal quale o dopo blando trattamento, la presenza di metalli contaminanti è pertanto estremamente importante per consentire uno screening rapido e su larga scala degli alimenti freschi o trasformati potenzialmente dannosi per i soggetti affetti da intolleranza ai metalli pesanti. Nel presente progetto di ricerca, la spettroscopia ATR-FTIR differenziale sarà testata quale sistema innovativo di detection di metalli pesanti, (nichel, cobalto, piombo, cadmio e cromo) nei prodotti ortofrutticoli freschi (pomodoro, lattuga) sia da un punto di vista qualitativo che quantitativo. Tale tecnologia sarà applicata anche per lo studio di materiali da utilizzare in sensori chimici per matrici acquose. In tal caso i materiali selezionati saranno depositati come film sottili sul cristallo ATR e, mediante celle a flusso, sarà studiata la loro abilità di legare i diversi metalli pesanti generando segnali di legame caratteristici. La possibilità di operare in situ consentirà di abbassare il rapporto segnale/rumore della tecnica. Pertanto, in tal caso, saranno perseguiti limiti di rivelabilità dell ordine dei 10 ppm. A seguito della deposizione degli strati attivi su cristalli di quarzo per un utilizzo in sensori piezoelettrici saranno definite le prestazioni dei sensori in termini di sensibilità e limite di rivelabilità in campioni reali. Inoltre sarà valutata la possibilità di utilizzare i nuovi sensori direttamente da parte del personale di aziende agro-alimentari per il monitoraggio in campo ed in tempo reale. A tal fine, saranno ottimizzati una serie di parametri quali la versatilità, la durata e la semplicità d uso dei sensori. Per quanto riguarda il controllo di patogeni emergenti in molluschi bivalvi obiettivi strategici dell impresa proponente che ha interesse a: - incrementare i propri introiti; - implementare la propria offerta di servizi (adeguandosi a standard di sicurezza presenti al momento solo in altri paesi); - differenziare l offerta aziendale. La Bonassisalab, infatti, grazie ai risultati di questo progetto, potrà diversificare ed ampliare il proprio business aziendale in quanto l impresa non si limiterà più alla sola erogazione di servizi di analisi (che comunque saranno incrementati) ma intenderà anche immettere sul mercato, anche insieme ai partner del progetto di ricerca, la tecnologia innovativa messa a punto e validata nel corso delle attività progettuali. L impresa proponente, pertanto, trarrà benefici in termini sia economico-produttivi sia tecnologici. Dal punto di vista economico-produttivo, infatti, tale ricerca risulta vantaggiosa per l impresa per l interesse della stessa a fornire un servizio aggiuntivo alla clientela, finalizzato a prevenire il rischio di trasmissione di infezioni e avente esplicite ricadute sul business aziendale e indirettamente anche sui consumatori che potranno disporre di un prodotto con maggiori garanzie igienico-sanitarie; si tratterà, infatti, di un servizio unico a livello nazionale che consentirà all Impresa di differenziare l offerta, di specializzarsi e caratterizzarsi anche sul territorio nazionale. Tali aspetti consentiranno l avvio di un processo virtuoso di 144

145 domanda e offerta tra i clienti e l Impresa, proiettato ad ottenere sempre maggiori garanzie di qualità e sicurezza del mollusco bivalve. Dal punto di vista tecnologico, tale ricerca consente di mettere a punto una tecnologia innovativa e inedita che permetterà, una volta brevettata, di essere adottata non solo dalle imprese che si occupano della produzione e/o commercializzazione dei molluschi ma anche dai laboratori di prova (pubblici e privati) specializzati in analisi sugli alimenti. Oltre a patogeni emergenti, il progetto considera anche microrganismi la cui patogenicità rappresenta un noto problema di sicurezza alimentare. In particolare, verranno messi a punto sistemi di allerta rapidi della presenza di patogeni Gram Positivi (Listeria) e negativi (Salmonella) in tagli bovini prima della destinazione d uso. Tali sistemi saranno basati su tecniche molecolari avanzate. Le tecnologie basate sulla PCR presentano scarsa applicabilità nelle imprese agroalimentari, perchè si prestano a difficoltà di interpretazione e a variabilità di risultato (falsi positivi, falsi negativi). Le aziende si affidano ancora ai laboratori di analisi esterni il controllo microbiologico dei prodotti, e questo richiede tempi prolungati di invio dei campionamenti in altra sede, e utilizzando tecnologie tradizionali come il piastramento e la coltura batterica per le analisi di identificazione dei patogeni. Le certificazioni ISO non si affidano a nuovi metodi come la PCR per il motivo di variabilità dei risultati dovuti a difficoltà di funzionamento degli enzimi Taq polimerasi in presenza di campioni contenenti sangue. Oggigiorno si provvede a sostituire l uso dell amplificazione mediante Taq polimerasi con amplificazioni isotermiche (phi polimerasi, un enzima che non risente della presenza di inibitori nel campione), con applicazioni quali Rolling Circle Amplification. I metodi a protein chips (immunosensori indiretti) ed a SPR (metodi diretti) sono ancora poco sensibili. Gli immunobiosensori rappresentano la base di partenza in questo processo innovativo, che prevede l applicazione alla immunodetection di metodi di amplificazione del segnale, corrispodenti per sensibilità alla PCR. L introduzione di un sistema di amplificazione del segnale (anticorpi coniugati a tags che sono amplificate di 1000 volte) permetterà lo sviluppo di questa metodica e la sua applicabilità in campo microbiologico, per la sua capacità di individuare quantità minime di patogeni contaminanti. Inoltre, la lettura dei protein chips attualmente non permette il confronto con le analisi precedenti, perché lo scanner dotato di fotomoltiplicatore quantifica in modo di volta in volta diverso, la lampada laser perde di efficienza, quindi le letture non sono confrontabili. Il nuovo metodo di lettura di questo progetto è basato su una CCD camera capace di quantificare le unità di fotoni presenti sul campione, e mediante autocalibrazione permette la riproducibilità dell analisi con la stessa efficienza di fluorescenza. Le competenze scientifiche dell ISPA-CNR sono la messa a punto di protocolli di processamento dei campioni, il settaggio delle analisi innovative, la validazione delle metodiche. L azienda Biotecgen è competente nello sviluppo di protein chips e di applicazioni di Lateral Flow e di strips per immunodetection, tutt ora ancora al di sotto della sensibilità richiesta, a cui l ISPA-CNR intende applicare necessarie modifiche per ottenere l amplificazione del segnale (RCA, sonde FRET). Inoltre il laboratorio di Microbiologia SME offre la sua competenza nella verifica del risultato mediante conta su piastra con protocolli certificati ISO. L azienda Ciullo Carni assiste tutto il processo di campionamento mediante il supporto del personale intero, la formazione di un tecnico per il trasferimento tecnologico, l expertise e la conoscenza dei punti critici di possibile contaminazione della filiera di produzione. Un importante vantaggio tecnologico sarà la realizzazione delle analisi per la sicurezza microbiologica in azienda, risparmiando sia sul tempo sia sui costi della realizzazione delle analisi. Il nuovo sistema avanzato di monitoraggio della filiera avrà un impatto importante, con immediati vantaggi economici che si concretizzano nel: recupero di carni mediante ottimizzazione della destinazione d uso delle mezzene bovine alle lavorazioni idonee (vantaggio dei tempi brevi di analisi); maggiore sicurezza microbiologica dei prodotti perché la carne processata per prodotti da banco sarà certificata, escludendo la necessità di richiamare indietro prodotti a rischio dalla grande distribuzione (vantaggio di maggiore sicurezza). Novità e originalità delle conoscenze acquisibili La proposta progettuale potrebbe aggiungere nuova conoscenza in merito al controllo di Pseudomonas spp. in formaggi freschi a pasta filata. Infatti, tra le strategie proposte per il controllo di tale microrganismo alterativo, l uso di batteriocine in combinazione con EDTA non è stato mai sperimentato nel settore lattierocaseario con la finalità di inibire batteri Gram-negativi, quale è Pseudomonas spp. Un altra strategia proposta nella presente idea progettuale consiste nell uso di microrganismi (o loro metaboliti) che agiscano da bio- 145

146 conservanti. Sebbene vi siano alcuni esempi dell applicazione di bio-conservanti nel settore lattiero-caseario, non vi sono dati bibliografici relativi all uso di tali sostanze in formaggi freschi a pasta filata. In aggiunta, sebbene sia stata dimostrata l efficacia di alcune sostanze (estratti vegetali, lisozima in combinazione con EDTA) nell inibire la moltiplicazione di Pseudomonas spp. durante la shelf-life della mozzarella, nella metodica impiegata precedentemente non è stata prevista la simulazione della contaminazione del liquido di governo con il batterio alterativo e, per quanto di nostra conoscenza, i risultati raggiunti con gli studi effettuati non hanno avuto un riscontro applicativo. Infine, non è mai stata effettuata una comparazione dell efficacia di tali strategie di controllo nelle medesime condizioni sperimentali. Le coltivazioni senza suolo sono spesso state proposte come strumento per raggiungere la qualità totale delle produzioni orticole (ortaggi funzionali, incremento di licopene, riduzione dei nitrati) con risposte incoraggianti relativamente alle tematiche di volta in volta affrontate. Le tecniche senza suolo possono fornire uno strumento innovativo anche per limitare l accumulo di metalli pesanti negli ortaggi finalizzato a garantire l ottenimento di un prodotto con elevati standard di sicurezza alimentare. Inoltre, l approccio non è quello convenzionale di ricercare substrati con un basso contenuto di metalli pesanti, ma di modificare la risposta fisiologica della pianta in termini di uptake e traslocazione degli stessi. Gli studi che saranno effettuati non si fermano ai meri aspetti fisiologici relativi al metabolismo dei metalli pesanti nelle piante, già abbondantemente affrontati ma spesso condotti su plantule e in condizioni sperimentali volutamente non paragonabili con quelle proprie dei sistemi agricoli, ma si propongono di rendere applicative alcune evidenze scientifiche, in parte note e che in parte emergeranno dalle sperimentazioni previste. Per quanto riguarda l aspetto diagnostico invece, la possibilità di sviluppare metodi innovativi semplici e poco costosi, in grado di rivelare nell alimento, tal quale o dopo blando trattamento, la presenza di diversi metalli rappresenta una novità assoluta ed è pertanto estremamente importante per consentire uno screening rapido, in campo e su larga scala dei prodotti alimentari freschi o trasformati. Infatti, le attuali metodologie di quantizzazione dei metalli pesanti prevedono l utilizzo di attrezzature costose e di personale altamente addestrato. Tutto ciò limita notevolmente la possibilità di effettuare analisi di routine sui prodotti freschi. Lo sviluppo di sensori piezoelettrici poco costosi, a basso impatto ambientale, per la detection di metalli pesanti negli alimenti, lascia intravedere un ottima diffusione sul mercato. La validità scientifica della ricerca in merito alla diagnosi di patogeni emergenti è desumibile dai seguenti aspetti: - Originalità. La ricerca proposta sia nei contenuti che nella tecnologia non ha precedenti nel panorama mondiale. Nessuno strumento attualmente disponibile nei laboratori di analisi presenta i requisiti che la piattaforma garantirebbe (rilievo di patogeni zoonosici emergenti, rapidità di esecuzione, ridotte dimensioni (15x15), facile impiego). La Piattaforma Tecnologica Europa Food for Life ha inserito, insieme ad altri microrganismi, contemplati nelle normative, a pieno titolo anche i protozoi di interesse zoonosico oggetto del presente progetto, sottolineando la necessità non solo di rilevare i parassiti ma di sviluppare strumenti di detection sempre più ampi e raffinati e che possano essere inquadrati nella routine dell HACCP. - Innovatività. Il mercato della diagnostica in vitro è un mercato in forte espansione; la tecnologia messa a punto, una volta brevettata, consentirà di essere adottata dalle imprese che si occupano della produzione e/o commercializzazione dei molluschi, ma anche dai laboratori specializzati in analisi sugli alimenti, dagli impianti di depurazione, dai veterinari ispettori per entrare definitivamente nel processo di controllo HACCP di numerosissime imprese. Il successo di tale tecnologia consiste nell aver aperto la strada allo sviluppo di chip usa e getta a basso costo, semplice, di ridotte dimensioni, e veloce e grazie al quale diventa automatica la preparazione, l analisi e la valutazione di campioni biologici completando il ciclo in un unico sistema. - Potenzialità applicative. La piattaforma che si intende progettare prevede al momento il rilievo di alcuni microrganismi patogeni. Tuttavia, una volta dimostrata l applicabilità dello strumento ai patogeni di riferimento - per i quali gli organismi di ricerca sono competenti - la strumentazione consentirà di estendere la sua applicazione ad altri agenti patogeni emergenti di origine virale e batterica. - Tutela della tipicità. La sempre maggiore richiesta da parte del consumatore di garanzie di sicurezza alimentare fanno della proposta l applicazione più importante. Tale garanzia consentirebbe di ampliare e mantenere sul mercato prodotti che hanno una connotazione anche gastronomico-culturale; in tal senso, il progetto indurrebbe al mantenimento di abitudini alimentari che tendono a scomparire per la sempre minore fiducia da parte del consumatore, in particolare, la consumazione dei molluschi bivalvi crudi, 146

147 abitudine tipica delle regioni italiane (soprattutto meridionali) ed estere, e, contestualmente, a promuovere il prodotto in altre regioni italiane in cui tale cultura gastronomica è meno consolidata. Le tecnologie proposte per la rivelazione di Salmonella e Listeria rappresentano il settore di maggiore investimento dei prossimi anni. I sistemi di immunodetection con amplificazione del segnale sono oggetto di progetti di ricerca in campo europeo, con aziende all avanguardia (ognuna specializzata in metodi diretti od indiretti di acquisizione del segnale), che investono nel settore e sviluppano metodiche originali, applicazioni svariate, soluzioni tecnologiche e nuove conoscenze in campo fisico chimico. Utilità delle conoscenze acquisibili Lo sviluppo di un protocollo biotecnologico per ridurre il rischio di alterazione da Pseudomonas ha un utilità immediata per lo sviluppo della richiedente, perché il progetto prevede la presenza di una fase di scale-up aziendale nella quale saranno definite le modalità operative con cui integrare il protocollo di produzione della mozzarella con il protocollo biotecnologico per la riduzione dei rischi di alterazione da Pseudomonas spp., anche tenendo conto della natura e della provenienza della materia prima. Al termine dello scale-up, le innovazioni raggiunte saranno prontamente applicate, accrescendo la competitività della richiedente. Infatti, la presenza di antimicrobici naturali nel prodotto, quali microrganismi bio-conservanti ed estratti vegetali, potrebbe essere riportata in etichetta sotto forma di claim, il che potrebbe indurre un maggior numero di consumatori ad acquistare il prodotto, perché privo di conservanti chimici. I risultati che si otterranno per la riduzione dell accumulo di metalli pesanti nei prodotti ortofrutticoli potranno essere utilizzati sia dalle aziende orticole che dai gestori di impianti di compostaggio e dalle pubbliche amministrazioni. Nel primo caso, infatti, consentiranno di utilizzare i compost come substrato di coltivazione o come ammendante (per incrementare il tenore di sostanza organica dei suoli e quindi a parziale sostituzione dei fertilizzanti chimici) per produrre ortaggi freschi di qualità e sicuri dal punto di vista alimentare. Ciò si traduce in un vantaggio economico-ambientale sia per la riduzione dei quantitativi di torba utilizzati (materiale costoso la cui estrazione è in fase di limitazione a livello europeo) che di fertilizzanti chimici, il cui prezzo è in continua ascesa. L utilità per i gestori di impianti di compostaggio risiede nella possibilità di definire, in funzione dei risultati ottenuti, criteri per l utilizzazione finale dei compost (per colture orticole, per vivai forestali, come ammendante per alberate stradali, ecc.) meglio rispondenti alle caratteristiche intrinseche dei materiali soprattutto riguardo al contenuto di metalli pesanti e alla possibilità che passino nella catena alimentare. Infine, le pubbliche amministrazioni potrebbero trarre, indirettamente, utili indicazioni per finalizzare in modo più appropriato la raccolta differenziata e quindi indirizzare i materiali raccolti per la produzione di compost con specifiche proprietà,soprattutto perché il compost è un bene riciclato e quindi potrebbe rientrare nella quota di acquisti verdi imposti alle amministrazioni pubbliche. Le ricerche volte allo sviluppo di metodi per la diagnosi rapida di metalli pesanti consentiranno di acquisire nuove ed importanti conoscenze in merito all interazione dei metalli pesanti con specifiche componenti degli alimenti ed alle cinetiche di rilascio di ciascun metallo in seguito a specifici trattamenti chimico/fisici. Tali risulti saranno particolarmente importanti sia per il successivo sviluppo di nuovi sensori per la detection di specifici metalli che per lo sviluppo di nuove metodologie per la rimozione e/o il sequestramento dei metalli durante la fase iniziale del processo di trasformazione. Un altro importante avanzamento della ricerca è relativo all identificazione di nuovi materiali naturali o di sintesi in grado di legare selettivamente specifici metalli pesanti, di fondamentale importanza per lo sviluppo di nuovi sensori piezoelettrici. Per ciascun materiale selezionato saranno individuati il sistema di deposizione e lo strato ottimale per un efficiente detection dei metalli. Infine saranno sviluppati sensori piezolettrici da utilizzare come sistemi di analisi di specifici metalli pesanti estremamente economici e di semplice utilizzo. Tali dispositivi accresceranno la competitività delle imprese nel settore di riferimento, da sempre attenti allo sviluppo di nuove tecnologie innovative per la detection rapida di contaminanti ambientali ed alimentari. La Molluschicoltura rappresenta la principale voce produttiva nell ambito dell acquacoltura nazionale. I due poli produttivi della molluschicoltura in Puglia, localizzati nelle province di Taranto (quasi esclusivamente città di Taranto) e Foggia (Manfredonia e Cagnano Varano) contano rispettivamente circa il 10% ed il 90% delle 49 imprese censite, per un totale di 86 impianti, localizzati rispettivamente per il 6% in provincia di Foggia e per il 94% in provincia di Taranto. 147

148 L attuazione del presente progetto di ricerca trova una quanto mai opportuna e strategica collocazione in quanto consentirebbe all Impresa ospitante di essere credibile e concorrenziale sul mercato e di ampliare il proprio mercato (aumentando il numero dei clienti) sia sul territorio regionale ma anche nazionale o internazionale, attraverso l erogazione di un servizio aggiuntivo di analisi totalmente innovativo che potrà: - garantire nel prodotto da commercializzare l assenza di protozoi di origine fecale non contemplati dalla normativa, pericolosi per la salute umana, ma sottovalutati; - far conoscere indirettamente l efficienza di rimozione degli impianti di depurazione dei molluschi; - poter rilevare la presenza nei pressi dell allevamento di eventuali scarichi urbani e/o zootecnici non autorizzati; - mettere in atto sistemi per contrastare il rischio; - denunciare situazioni di illegalità dovute alla contaminazione fecale da reflui urbani e/o zootecnici nelle lagune della Puglia settentrionale o di inefficienza degli impianti di depurazione che scaricano in mare/laguna/laghi. L ampliamento del mercato si manifesterà anche attraverso la differenziazione dell offerta aziendale in quanto l impresa proponente non erogherà più solo servizi ma anche beni in quanto metterà in commercio la nuova tecnologia sviluppata nel progetto. Ad oggi non esistono aziende concorrenti che si stanno adoperando per sviluppare tecnologie similari o per proporre alternative vantaggiose che perseguono gli stessi obiettivi. La conoscenza ed applicabilità delle innovazioni e l avanzamento tecnologico permetterà alla Ciullo Carni la realizzazione delle analisi per la sicurezza microbiologica in azienda. Questo know how permetterà all azienda di accrescere la sua competitività e e capacità di offrire prodotti certificati, con immediati vantaggi economici che si concretizzano nel: recupero di carni mediante ottimizzazione della destinazione d uso delle mezzene bovine alle lavorazioni idonee. Queste innovazioni coinvolgeranno anche altre aziende (settore di riferimento) che vedranno i vantaggi di avere risultati immediati mediante sia l acquisizione delle tecnologie per traferimento in azienda o mediante servizi offerti da terzi. La disponibilità sul mercato di tecnologie innovative, come quelle basate sulla PCR, è poco sfruttato nelle imprese pugliesi, che affidano ancora ai laboratori di analisi esterni il controllo microbiologico dei prodotti, e questo richiede tempi prolungati di invio dei campionamenti in altra sede, inoltre questi laboratori si affidano ancora poco alle tecnologie più nuove, basandosi sul piastramento e sulla coltura batterica per tutte le analisi. Il sistema proposto prevede due immediati vantaggi economici che si concretizzano nel recupero di tempo per la destinazione d uso delle mezzene bovine ad altre lavorazioni più sicure, dal punto della microbiologia perché la carne è processata e l alimento è trasformato con la pastorizzazione. Il secondo vantaggio è la realizzazione delle analisi microbiologiche in azienda, risparmiando sia sul tempo sia sui costi della realizzazione delle analisi. Il risultato del progetto, inteso come metodiche e sistemi innovativi di analisi dei patogeni (Listeria e Salmonella) può essere sfruttato anche nella costituzione di uno spin off per la produzione e distribuzione di prodotti tecnologicamente avanzati da destinare ad un mercato delle biotecnologie e di sistemi di analisi microbiologica. 3) COPERTURA FINANZIARIA Fonti di copertura finanziaria preventivate, ad integrazione degli incentivi richiesti, ed informazioni a supporto della loro congruità. A copertura del fabbisogno del progetto sarà impegnato il cash flow aziendale, il cash flow dei soci partecipanti al progetto e, laddove necessario, linee di credito bancarie. Stante il valore di progetto pari a di cui di Ricerca Industriale (con un tasso incentivante previsto pari all 80%) e di Sviluppo Sperimentale (con un tasso incentivante previsto pari al 60%), si stima che le risorse finanziarie necessarie ad integrare gli incentivi richiesti possa essere pari a La garanzia di copertura per tali risorse è fornita anche da apposita convenzione che è stipulata tra la richiedente e i propri soci partecipanti al progetto. In virtù delle caratteristiche istituzionali e patrimoniali della richiedente e dei suoi soci si giudicano tali fonti di copertura particolarmente congrui. 148

149 Di seguito si propone la suddivisione dei costi per anno solare, prevedendo l inizio delle attività nel novembre Totale Totale Ricerca Totale formazione ) VALIDITA' INDUSTRIALE DEL PROGETTO Coerenza strategica e gestione del progetto Il Progetto presentato appare particolarmente coerente rispetto agli obiettivi strategici del Distretto ad Alta Tecnologia così come evidenziati nel Piano Strategico allegato. Il Distretto, infatti, si propone di favorire la messa a sistema di competenze ed esigenze degli operatori regionali del mondo della ricerca e dell impresa. Inoltre, la tematica Sicurezza Alimentare rientra tra quelle definite strategiche per lo sviluppo del sistema innovativo regionale. A dimostrazione di ciò, le imprese del Distretto ad Alta Tecnologia perseguono strategie autonome che però ben si innestano le une sulle altre all interno della logica complessiva di progetto. Al progetto partecipano direttamente imprese del Distretto impegnate nelle attività produttive di diverse filiere dell agro-alimentare oppure in attività di supporto o di servizio (Bonassisalab srl, Industrie Fracchiolla srl, Lab. Instruments srl, Biotecgen srl) per il settore agro-alimentare. Le imprese partner intendono accrescere la propria competitività migliorando la sicurezza alimentare dei loro prodotti e ampliando l offerta aziendale con servizi sempre più sensibili e affidabili per il controllo della qualità igienico-sanitaria dei prodotti, tutelando così maggiormente i consumatori. Nello specifico, le imprese partner di progetto del settore enologico, o a supporto dello stesso, intendono: 1. DIFFERENZIARE i propri prodotti dotandoli di ulteriori attributi di sicurezza: riducendo il rischio di contaminazione da microrganismi alteranti (lieviti Brettanomyces) e loro metaboliti su uva e vino (Cantine D Alfonso del Sordo srl, Cantele srl); garantendo un prodotto uva/vino in cui la contaminazione da ocratossina A sia assente o al di sotto dei limiti legali (Azienda Viti-vinicola Incoronata, Cooperativa Lavorazione Prodotti Agricoli). 2. DIFFERENZIARE i propri servizi a supporto del settore enologico dotandoli di una maggiore sensibilità, accuratezza e funzionalità: mettendo a punto metodiche multi residuali validate per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento per fitofarmaci (Lab. Instruments srl); mettendo a punto un prototipo per la rimozione dell ocratossina A nel vino (Industrie Fracchiolla srl); sviluppando metodi rapidi per la determinazione di allergeni nel vino; sviluppando metodologie biomolecolari per la decontaminazione/degradazione dell OTA nei mosti vino. Le imprese del settore cerealicolo-molitorio, o a supporto dello stesso, invece, intendono: 1. DIFFERENZIARE i propri prodotti dotandoli di ulteriori attributi di sicurezza: riducendo il rischio di contaminazione da microrganismi indesiderati e loro metaboliti tossici e di infestazione da insetti nel frumento (CDP srl); garantendo prodotti cerealicoli in cui la contaminazione da micotossine sia assente o al di sotto dei limiti legali (Molini Tandoi Pellegrino spa). 2. DIFFERENZIARE i propri servizi a supporto del settore cerealicolo-molitorio dotandoli di una maggiore specificità/ sensibilità e funzionalità: mettendo a punto metodiche multi residuali validate per la determinazione di fitofarmaci in cereali e producendo miscele standard di fitofarmaci e di materiali di riferimento per fitofarmaci in frumento (Lab. Instruments srl); mettendo a punto una metodica multi-micotossina in cereali e derivati e produzione di materiali di riferimento multi-micotossina (Lab Instruments srl); 149

150 mettendo a punto una metodica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati (Bonassisalab srl); sviluppando metodi rapidi per la determinazione di micotossine in cereali e derivati. Le imprese del settore agro-alimentare che producono prodotti freschi, o le imprese a supporto dell intero comparto agro-alimentare, intendono: 1. DIFFERENZIARE i propri prodotti dotandoli di ulteriori attributi di sicurezza: riducendo il rischio di contaminazione da microrganismi alteranti (Pseudomonas spp) nelle mozzarelle (Centro Latte Stasi srl); riducendo il rischio di contaminazioni da patogeni quali Listeria e Salmonella in tagli bovini prima della destinazione d uso (Ciullo Carni srl) riducendo il rischio di contaminazione da metalli pesanti in ortaggi per il consumo fresco. 2. DIFFERENZIARE i propri servizi a supporto del comparto agro-alimentare dotandoli di una maggiore specificità/ sensibilità e funzionalità: mettendo a punto un prototipo per la diagnosi rapida di patpgeni emergenti in molluschi bivalvi (Bonassisalab srl); sviluppando sistemi di allerta rapidi della presenza di patogeni Gram Positivi (Listeria) e negativi (Salmonella) in tagli bovini prima della destinazione d uso (Biotecgen srl) sviluppando metodi rapidi per la diagnosi di metalli pesanti in prodotti freschi. Date queste premesse appare evidente che i risultati previsti dal progetto risultino non solo coerenti con le strategie di ogni partner industriale ma riescano a combinarsi in un insieme organico ed integrato, creando le premesse per uno sfruttamento anche comune dei deliverables. Si evince pertanto che, oltre alle imprese partner del progetto S.I.Mi.S.A, indirettamente tutte le imprese del Distretto potranno beneficiare dei risultati della ricerca. Il progetto prevede una sostanziale interazione tra le strutture operative dei singoli partner e, allo stesso tempo, una relazione assai intensa tra i diversi partner coinvolti nel progetto. Rispetto al coinvolgimento delle strutture dei singoli partecipanti, ovviamente la parte maggiormente coinvolta sarà quella dedicata allo sviluppo delle tecnologie e della ricerca interna all impresa o all organismo di ricerca. Tale attività non potrà, per forza di cose, essere disgiunta da altre strutture chiave nel funzionamento delle unità coinvolte. Nelle imprese la funzione tecnologica si interfaccerà inevitabilmente con la funzione marketing (sia acquisti che vendite) e con la funzione amministrativa. Tali interazioni sono funzionali alla validazione competitiva dei prototipi sviluppati sul piano progettuale sia in termini di problematiche nell acquisizione delle materie prime, sia in termini di prevedibili reazioni da parte dei clienti e consumatori. Anche la funzione amministrativa ha un proprio peso per consentire il corretto svolgimento delle attività progettuali nel rispetto della normativa vigente in termini di aiuti di stato alla ricerca, allo sviluppo e all innovazione. Tale relazione è chiaramente prevista anche nella situazione degli organismi di ricerca per i quali, per ovvi motivi, la funzione marketing assume un ruolo meno rilevante. La relazione tra strutture organizzative si riflette senza dubbio anche sulla relazione tra strutture operative, laddove i soggetti partner presentino più sedi con specializzazioni differenti. Per quanto concerne le interazioni tra strutture di diversi partner, esse emergono chiaramente dal lay-out di progetto, laddove nei differenti OR risultano impegnati più soggetti partecipanti che collaboreranno, attraverso le proprie risorse umane, materiali ed immateriali, alla realizzazione degli obiettivi finali. Il coordinamento generale di tali attività è comunque demandato alle modalità organizzative prescelte per la gestione del progetto. I criteri di selezione del progetto hanno previsto il coinvolgimento pieno e trasparente di tutti le categorie degli stakeholders del Distretto Tecnologico Agro-alimentare Pugliese chiamati nel luglio del 2010 a proporre proposte progettuali sulle tematiche strategiche e di impatto tecnologico individuate dal Distretto stesso. La procedura di selezione ha coinvolto direttamente ed in misura trasparente lo staff tecnico di DARe, il Comitato Tecnico Scientifico della società consortile ed infine il suo Consiglio di Amministrazione. Per quanto riguarda la procedura di monitoraggio, la responsabilità di garantire che le attività procedano in conformità alla tempistica definita è imputata in capo al Responsabile Scientifico, che monitorerà con l aiuto della struttura tecnica di DARE scrl le attività delle singole Unità operative coinvolte nel progetto. 150

151 Il Responsabile Scientifico ha facoltà di avvalersi della collaborazione di responsabili scientifici per ogni singola Unità Operativa del proprio progetto, convocando riunioni per valutare l andamento del progetto. La struttura tecnica di DARE scrl, sotto il coordinamento e la responsabilità del Direttore Generale, fornirà attività di supporto tecnico al Responsabile Scientifico, che si tradurranno in: attività di monitoraggio costante sul progetto per acquisire dati e informazioni da trasmettere al Responsabile Scientifico, interventi on demand a richiesta del Responsabile Scientifico, produzione di una rapporto di avanzamento semestrale sulle attività del progetto rilevando eventuali criticità emerse dal confronto con i criteri di monitoraggio indicati Il Responsabile Scientifico procede alla validazione dei dati forniti dalla struttura tecnica di DARE scrl e trasmette relazione semestrale al Comitato Tecnico Scientifico di DARE scrl suggerendo possibili soluzioni alle criticità individuate. Il CTS, a sua volta, provvederà a inoltrare al Consiglio di Amministrazione tali informazioni. Il CTS almeno una volta l anno relazionerà al Comitato di Valutazione Indipendente previsto nel Piano di Sviluppo Strategico; tale comitato opera come soggetto di massima garanzia e di stimolo esprimendosi sul benchmark tecnologico del progetto. Il responsabile scientifico, inoltre, ha facoltà di convocare e di chiedere l intervento del Comitato Tecnico Scientifico di DARE scrl ogniqualvolta lo ritenga necessario. Sui criteri di monitoraggio si rimanda a quanto esplicitato in altra parte del formulario (verifica intermedia e finale). D.A.Re. DIRETTORE GENERALE STRUTTURA TECNICA COMITATO DI VALUTAZIONE INDIPENDENTE UNITÀ OPERATIVE RESPONSABILE SCIENTIFICO COMITATO TECNICO SCIENTIFICO CONSIGLIO DI AMMINISTRAZIONE D.A.Re. 151

152 Competitività tecnologica Nel contesto attuale e futuro, la disponibilità di metodi e strumenti innovativi che permettano di garantire alimenti sani e sicuri, nel rispetto di determinati requisiti definiti dalle normative vigenti, è di fondamentale importanza non solo per salvaguardare la salute del consumatore, ma anche per l economia dell intero settore agroalimentare. Il progetto S.I.Mi.S.A si pone come obiettivo la realizzazione di un complesso sistema di strategie per il miglioramento della sicurezza alimentare applicabile lungo tutta la filiera. Oggetto delle attività di ricerca è lo sviluppo di soluzioni innovative per la gestione di problematiche di contaminazione alimentare consolidate (come ad esempio micotossine, fitofarmaci, metalli pesanti, Pseudomonas e Salmonella) ed emergenti (come allergeni, micotossine nascoste, patogeni emergenti). La possibilità di sviluppare sistemi rapidi innovativi di rilevamento verrà esplorata utilizzando metodologie avanzate quali polarizzazione di fluorescenza (FP), lateral flow (LF), spettroscopia nel vicino infrarosso a trasformata di Fourier (FT-NIR), spettroscopia ATR-IR, naso elettronico con tecnologia MOS (Metal Oxide Semiconductors), biosensori SPR (Surface Plasmon Resonance) e lab-on-chip per la determinazione di micotossine, metalli pesanti, allergeni e microrganismi patogeni. Al contempo verranno sviluppate strategie di controllo basate su tecnologie avanzate come la spettrometria di massa tandem o ad alta risoluzione. I risultati ottenuti rappresenteranno un consistente avanzamento dello stato dell arte soprattutto in riferimento alle applicazioni di tecnologie emergenti quali chip a proteine, arrays a DNA, biosensori SPR, strip test con aptameri. La tecnologia proposta per prevenire la contaminazione da Brettanomyces e per la selezione di microrganismi ed enzimi che degradano l ocratossina nel vino prevede nuove biotecnologie enologiche attraverso il sequenziamento massivo parallelo o Next Generation Sequencing (NGS) che sarà impiegato nell analisi trascrittomica. Si tratta di tecnologie che forniscono strumenti di indagine molto potenti che stanno rivoluzionando gli ambiti di indagine della genomica e della genomica funzionale. L accoppiamento di real-time PCR (qpcr) all analisi High-Resolution Melting (HRM) curve al fine di realizzare una quantificazione assoluta del lievito e di fornire, al contempo, un indicazione qualitativa sulla biodiversità all interno della specie, propone un approccio innovativo poco utilizzato in microbiologia, ed ancor meno in microbiologia alimentare. Le nuove conoscenze sui metodi alternativi ed eco-compatibili di decontaminazione dei mosti/vini da ocratossina A (OTA) che scaturiranno da questo progetto (cioè il ripasso di mosti/vini su vinacce incontaminate dello stesso vitigno) migliorerà la competitività nazionale e internazionale delle aziende vitivinicole pugliesi e valorizzerà i prodotti di scarto della vinificazione (vinacce). In prospettiva tutte le aziende vinicole, soprattutto quelle più esposte al rischio OTA, avranno la possibilità di sfruttare la tecnologia del ripasso in continuo, messo a punto in questo progetto, per risolvere la problematica dell OTA. Da un punto di vista economico il programma di innovazione tecnologica proposto offre notevoli opportunità, sia in termini di competitività, sia in termini di quantitativi prodotti e di fatturato. L impiego di soluzioni naturali, quale ad esempio l uso di colture protettive appositamente selezionate per inibire la moltiplicazione di Pseudomonas spp. (Pseudomonas fluorescens è agente causale della mozzarella blu ) durante la frigo-conservazione, oltre che porre al riparo il produttore dal rischio di alterazioni severe a carico di un prodotto, quale la mozzarella che ha un mercato importante anche al di fuori della regione Puglia, rappresenta un avanzamento tecnologico per l Azienda partner, dal momento che l uso di bioconservanti è una soluzione innovativa per questa gamma di prodotti. L uso di ozono per prevenire/ridurre il rischio di contaminazione da microrganismi indesiderati, micotossine e insetti nel frumento è una soluzione a basso impatto ambientale che garantirà alle aziende un notevole risparmio dei consumi energetici e nel contempo una marcata riduzione dell impiego di sostanze chimiche inquinanti. Lo sviluppo di nuovi processi di trattamento e di conservazione del frumento consentirà una riduzione delle perdite di prodotto immagazzinato e un vantaggio competitivo per le aziend molitorie che potrebbero entrare in quote di mercato oggi occupate da altri Paesi esteri offrendo un prodotto migliore in termini di qualità e sicurezza alimentare. Tutti i risultati e le informazioni ottenute nell ambito di questo progetto apriranno pertanto la prospettiva di nuove applicazioni per la gestione del rischio delle contaminazioni chimiche e microbiologiche alimentari. 152

153 Si prevede un facile posizionamento sul mercato dei prodotti della presente ricerca, determinato dai seguenti fattori: 1) la crescente domanda da parte dei consumatori di garanzie sulla sicurezza degli alimenti con il conseguente incremento del numero di controlli; 2) la richiesta di migliorare la qualità del dato analitico; 3) la necessità di ridurre i tempi e costi di analisi; 4) la necessità di ridurre le perdite economiche causate da contaminanti indesiderati nelle produzioni alimentari. In merito a quest ultimo aspetto si prevede un forte impatto delle strategie proposte per la prevenzione/riduzione della contaminazione in prodotti come mozzarella, vino, mitili che hanno un mercato importante anche al di fuori della regione Puglia. Tutti gli output delle attività di ricerca si potranno tradurre in prodotti e servizi reali innovativi per le imprese partecipanti, consentendo di migliorare la propria competitività sui mercati di riferimento regionali e nazionali e di introdurre strategie di differenziazione dei propri prodotti e/o servizi. Inizialmente, i prodotti finali avranno come target i laboratori di controllo e le aziende locali coinvolti nel progetto. Date le caratteristiche di affidabilità, trasferibilità e in molti casi anche di ecocompatibilità degli strumenti sviluppati l impatto dei risultati del progetto andrà considerato anche in termini di inserimento delle metodiche proposte in programmi HACCP, di primaria importanza per le aziende del settore agroalimentare. Il progetto S.I.Mi.S.A vedrà il rafforzamento delle interazioni tra imprese locali e un qualificato pool di esperti riconosciuti a livello internazionale, che le accompagnerà nel loro percorso di crescita e di innovazione. Tutto il Distretto Agro-alimentare Regionale Pugliese (DARe) potrà beneficiare di questa fortunata integrazione tra industria e ricerca, generando processi virtuosi di innalzamento delle competenze, di apprendimento collettivo e di sviluppo economico che valorizza il territorio pugliese creando sistema. Dai risultati di questo progetto si prevede per le imprese coinvolte, non solo una crescita professionale, ma anche un aumento dei ricavi non solo imputabile al miglioramento della sicurezza degli alimenti commercializzati, ma in alcuni casi anche dalla vendita della tecnologia messa a punto, o dai dal nuovi servizi di analisi offerti. Inoltre la realizzazione dei prototipi previsti non richiede grossi investimenti per l industrializzazione. L attuazione del presente progetto consentirà alle imprese partner di incrementare la propria credibilità, di essere più concorrenziali sul mercato e, quindi, di ampliarlo sia sul territorio regionale che nazionale o internazionale. Ricadute economiche dei risultati attesi La complessità del progetto proposto induce a ritenere che vi possano essere ricadute economiche particolarmente importanti sia sulla richiedente sia sui partner coinvolti. Per quanto concerne la richiedente, progettazione, realizzazione e follow up del progetto potranno comportare un indubbio vantaggio competitivo oltre a fissare le condizioni minimali per portare avanti gli obiettivi previsti dal Piano di Sviluppo Strategico. DARe scarl si propone sul mercato dell innovazione e del brokeraggio tecnologico, caratterizzato da una crescente complessità competitiva unita ad opportunità particolarmente interessanti. I competitors di riferimento sono i principali sistemi innovativi agro-alimentari operanti in differenti contesti regionali, sia in Italia sia all estero. Con alcuni di questi, specialmente nell ambito dei programmi quadro europei sono già sviluppati rapporti di collaborazione che vanno anche aldilà della pura concorrenza. In termini di ricadute economiche si prevede di raddoppiare il fatturato. Come risultati indiretti si prevede, inoltre di curare in maniera particolare la definizione della proprietà intellettuale dei risultati come premessa alla valorizzazione economica degli stessi attraverso la gestione dei marchi e brevetti costituiti e la promozione di start-up di imprese innovative. Per quanto riguarda i partner privati: Cantina D Alfonso del Sordo srl e Az. Vinicola Cantele srl: i risultati che si otterranno dal progetto, una volta implementati in azienda, permetteranno di ridurre notevolmente le perdite di produzione causate dalle contaminazioni di lieviti del genere Brettanomyces. Tali lieviti sviluppandosi nel vino sono in grado di produrre quantità di fenoli volatili oltre la soglia di percezione dequalificando il prodotto e portando a perdite di produzione più o meno gravi, con conseguenti danni economici più o meno rilevanti. Tale quota di produzione, in cantina, è stimata poter incidere comportando un fatturato inferiore del 20% della produzione totale. Inoltre, i vantaggi secondari prodotti dalla sperimentazione 153

154 saranno anch essi notevoli, producendo miglioramenti del profilo sensoriale e una diminuzione di sottoprodotti microbici tossici. Una valutazione dei miglioramenti realizzati dalla migliorata produzione sotto il profilo sensoriale ed igienico sanitario, sono stimati dalla cantina in un aumento di vendite quantificabile in un 4-5 %, per cui si tratterebbe di ulteriore incremento di fatturato. Si tratta di una stima prudente, poiché, in prospettiva, soprattutto per ciò che concerne la problematica inerente alle ammine biogene, riguardando limiti di legge già presenti in diversi Paesi ed in via di adozione da parte dell Unione Europea, rappresenta un fattore cruciale per l export, e quindi per l aumento delle quote vendute al di fuori del mercato italiano. E inoltre da considerare, se pur difficilmente quantificabile da un punto di vista economico, che una più adeguata gestione delle risorse microbiche, realizzano una serie di potenzialità innovative biotecnologiche nel medio-lungo periodo, che non sarebbero altrimenti concretizzabili in mancanza di una adeguato know-how in merito al management della microflora vinaria e delle colture starter impiegate. Le criticità nel campo della ricerca proposta potranno trovare riflessi sulle possibili attività di trasferimento tecnologico, funzione dei risultati conseguiti. Ove, infatti, i ceppi starter ottimali per ridurre le perdite annue causate da B. bruxellensis dovessero essere ceppi autoctoni precedentemente selezionati e caratterizzati e non colture starter disponibili sul mercato, si porrebbe il problema di ottenere da essi biomassa sufficiente per gli impieghi industriali. A questo scopo si potrebbe prevedere lo studio di fattibilità di una spin-off universitaria e/o aziendale che realizzi il suo business proprio nello sviluppo di starter microbici non presenti in commercio, ma tailored su specifiche esigenze biotecnologiche. Nel caso di settori tradizionali, quale è il settore agro-alimentare, le operazioni di trasferimento tecnologico dal pubblico al privato sono complesse e dovrebbero essere basate su piattaforme comuni di fiducia e interesse. Le leve tecnologiche su cui l attività di ricerca verte, consentiranno anche il miglioramento di altri importanti aspetti qualitativi ed economicamente correlati alle produzioni vinicole regionali. Azienda viti-vinicola Incoronata e Coop. Lavorazione Prodotti Agricoli: i risultati che si otterranno dal progetto, una volta implementati in azienda, permetteranno di ridurre i costi della produzione e, al contempo, di rispondere all esigenza delle aziende di dotarsi di metodiche analitiche innovative legate all utilizzo di dispositivi avanzati e protocolli di analisi validati. L impiego di metodiche rapide, accurate e a basso costo, che i partner industriali intendono perseguire in quanto ritenute di elevato interesse strategico, porterà ad un duplice vantaggio: produttivo, dato che il suo utilizzo nei laboratori aziendali comporterà una velocizzazione dei controlli e quindi della trasformazione della materia prima, ed economico, con un risparmio nei costi di analisi affidate a terzi ed un miglioramento qualitativo del prodotto. Non di secondo piano è la collaborazione con l ente di ricerca universitario che comporta sempre e comunque una crescita professionale. In particolare l impiego di un biosensore amperometrico garantirà il controllo accurato, rapido ed a basso costo di glucosio e alcool nelle materie prime e nel prodotto, con un incremento notevole del numero di campioni giornalieri analizzabili ed un abbattimento dei costi, rispetto a quelli necessari con le metodiche analitiche correnti. Oltre agli aspetti della qualità, anche la sicurezza rappresenta una fonte di guadagno per l azienda. La selezione delle uve in fase di vendemmia, infatti, può limitare in misura significativa il tenore in ocratossina A (OTA) nel vino. Le aziende hanno intenzione di procedere autonomamente alla determinazione di questo residuo pericoloso, utilizzando il protocollo di analisi nei propri laboratori, cosa che implementerebbe le potenzialità di intervento in tempo reale sulle fasi critiche della filiera. L incremento delle competenze nel campo dei controlli e l acquisizione di nuovi protocolli e dispositivi di analisi rapidi, permetterà all'azienda di incrementare significativamente il fatturato, attraverso l'acquisizione di clienti nel mercato europeo, con conseguente aumento della competitività e internazionalizzazione nel settore enologico.. Si pensa che nei prossimi 5 anni, l azienda sarà in grado di conquistare anche una quota del mercato internazionale. Industrie Fracchiolla srl: i risultati che si otterranno dal progetto, una volta implementati in azienda, permetteranno di incrementare notevolmente il fatturato della stessa. L azienda si colloca nel mercato nazionale ed internazionale dei serbatoi in acciaio inox e delle macchine per l enologia e l industria alimentare che raggiunge un volume complessivo di ricavi di (anno 2009). Si può stimare, in maniera ragionevole, che il giro d affari che potrebbe derivare dall introduzione in commercio delle suddette macchine possa essere pari a 10 milioni di euro. A livello territoriale, il mercato interessato è sia quello nazionale che quello estero, logicamente circoscritto ai clienti che 154

155 richiedono una macchina flessibile e versatile per un vino di qualità. Da un punto di vista economico il programma di innovazione tecnologica proposto offre notevoli opportunità, sia in termini di competitività, sia in termini di quantitativi prodotti e di fatturato. In caso di successo della presente iniziativa, il target di riferimento è fissato in circa 50 unità per anno, da commercializzare ad un prezzo medio di per ciascuna unità. Si può quindi concludere che un successo del presente progetto proposto consentirà all Azienda di aumentare il fatturato di circa nell anno a regime. Non sono previsti investimenti per l industrializzazione, in quanto il progetto riguarda l introduzione di innovazioni su impianti che l azienda è in grado di realizzare, in quanto già in possesso di tutte le attrezzature ed i macchinari occorrenti alla costruzione. Lab. Instruments srl: i risultati del progetto, una volta implementati in azienda, permetteranno alla stessa di incrementare notevolmente il fatturato. Alla clientela, servita e potenziale, sarà offerto un innovativo pacchetto prodotto/servizio che andrà a sostituire le altre proposte commerciali attualmente presenti. Il mercato qualificato disponibile, ovvero i clienti che sono adatti al nuovo prodotto/servizio è costituito, soltanto in Italia, dai circa 1000 laboratori di analisi chimica accreditati oltre ad altri circa 1000 non accreditati o dislocati presso industrie alimentari. A fronte della elevata richiesta di analisi di fitofarmaci, il numero di analisi di micotossine è ridotto ma decisamente in crescita. In una matrice Sviluppo del Mercato/Quota di mercato, la Lab.Instruments srl, sulla base dell attuale situazione di mercato, potrà posizionarsi con i nuovi prodotti realizzati nel seguente modo: Il possibile posizionamento sul mercato dei prodotti in una matrice Prezzo/Qualità potrebbe collocare il nuovo prodotto in un area Alta Qualità- Prezzo medio alto. Le previsioni di vendita per il quinquennio d attività successivo all industrializzazione dei risultati della ricerca sono indicati nella tabella seguente: 155

156 Ricavi dal noleggio e dalla vendita di apparecchiature scientifiche Ricavi dalla produzione e vendita di standard e materiali di riferimento per micotossine Ricavi dalla produzione e vendita di standard e materiali di riferimento per pesticidi Ricavi dall attività di assistenza e formazione , , , L industrializzazione dei risultati della ricerca non richiede importanti investimenti strutturali ma solo il completamento di quelli esistenti in relazione alla metodologia produttiva che sarà individuata al termine dalla ricerca. La redditività della produzione è quindi caratterizzata da una bassa incidenza di costi fissi per quote ammortamento dei nuovi investimenti rendendo il break even point raggiungibile con la vendita di circa 1/5 delle confezioni costituenti il lotto di produzione. Si prevede quindi una produzione innovativa, con caratteristiche di unicità e ad alto margine di redditività con bassi investimenti. Nell interazione con i fruitori di tali prodotti sono emerse le seguenti esigenze: - incrementare il numero di analiti determinabili in una singola analisi; - incrementare la rapidità e contenere i costi dell analisi; - migliorare l affidabilità e la tracciabilità dei dati analitici; - ridurre investimenti e costi fissi a favore di costi variabili; - integrare il servizio di assistenza tecnica con consulenze applicative. Di qui nasce l idea strategica della Lab.Instruments srl di proporsi sul mercato con una offerta omnicomprensiva di: - fornitura di miscele standard di calibrazione e taratura per la riferibilità; - fornitura del metodo d analisi rapido e/o multianalita e della strumentazione scientifica necessaria; - supporto post vendita e formazione del personale all uso delle apparecchiature e delle tecniche analitiche proposte; - organizzazione di Proficiency test e fornitura di materiali di riferimento per il controllo del metodo analitico. C.D.P. srl: i risultati che si otterranno dal progetto, una volta implementati in azienda, permetteranno alla stessa di incrementare il fatturato. Ad oggi i principali clienti dell Azienda sono altri molini, panifici, aziende di produzione pasta ed altre aziende di lavorazione distribuiti tra Puglia e Basilicata. In chiave prospettiva l Azienda conta di aumentare il fatturato in Puglia e Basilicata, ma soprattutto di estendere le vendite anche ad altre regioni. I risultati che si otterranno da progetto saranno di grande interesse per l Azienda e per le Aziende del settore cerealicolo pugliese e nazionale perché consentiranno loro di vendere i loro prodotti a fette di mercato molto più ampie e con una qualità più elevata. Grazie ai risultati di progetto, infatti, potranno essere implementati sistemi green che consentano riduzione di consumi energetici e riduzione nell impiego di sostanze chimiche. Queste soluzioni consentiranno un allargamento del proprio mercato di riferimento e delle soluzioni proposte ai propri clienti attraverso un innalzamento degli standard di sicurezza e qualitativi. Dopo le continue crisi di mercato, nel 2010 la produzione cerealicola si apre sotto i peggiori auspici in termini di quantità che si prospetta drasticamente ridimensionata. Uno dei fenomeni a cui si sta assistendo è la slavatura (tecnicamente la perdita di colore e brillantezza della superficie del chicco che spesso diviene più ruvida); è associata ad una riduzione del peso elettrolitico che equivale ad un calo della produttività e del valore commerciale della partita, oltre a problemi di conservazione del prodotto (da DauniaCom.it). Riteniamo che proprio per questo bisogna ridurre i problemi di conservazione del prodotto impedendo che altre aggressioni di carattere fungino o di insetti riducano ulteriormente il valore commerciale dei prodotti. Nello specifico lo sviluppo di funghi ed insetti causano perdite di prodotto durante la fase di stoccaggio e conservazione causando perdite economiche ad aziende del settore. Lo sviluppo di nuovi processi di trattamento e di conservazione potrebbe quindi portare a: i). una riduzione delle perdite di prodotto, in particolare a tutte le Aziende che stoccano e conservano i 156

157 prodotti sia pugliesi che nazionali; ii) un vantaggio competitivo per le Aziende di molitura che potrebbero entrare in quote di mercato oggi occupate da altri paesi esteri offrendo un prodotto di maggior qualità e sicurezza alimentare. L Azienda prevede quindi di aumentare il proprio fatturato in misura pari ad almeno il 15% con lo sviluppo del mercato attuale e di almeno il doppio con lo sviluppo del mercato prospettico. L aumento dei ricavi potrà inoltre consentire all Azienda non solo la salvaguardia degli attuali posti di lavoro, ma uno sviluppo dell organico utilizzato sia per la fase di produzione, che per quella commerciale. Molini Tandoi Pellegrino spa: i risultati che si otterranno dal progetto, una volta implementati in azienda, comporteranno ricadute economiche che si articolano nella implementazione dei prodotti/servizi interni con conseguenti benefici attesi attraverso l abbattimento dei costi nell esecuzione delle analisi di monitoraggio (grazie all utilizzo di strumenti diagnostici e metodi analitici affidabili per l analisi rapida e accurata di micotossine nelle produzioni della filiera cerealicola), benefici di immagine ed impatto di marketing con conseguente miglioramento della posizione concorrenziale. L'andamento della domanda di prodotti alimentari genuini, salubri e igienicamente sicuri mostra una forte crescita in tutte le aree internazionali e specificatamente nelle regioni nord-orientali italiane che registrano, rispetto allo scorso decennio, un aumento del 10,6% in valore e del 9,8% in volume. Crescono inoltre i consumi nel Sud dell Italia, sia in termini quantitativi (+1,6%), sia in valore (+6,7%), a fronte di una battuta d'arresto degli acquisti di prodotti al Nord Ovest (-10% in volume) e al Centro (-9%), aree in cui la spesa di tale tripodi prodotto registra una tendenza all'aumento rispettivamente del 2 e del 3,7 per cento. Con il raggiungimento dei risultati previsti in progetto le imprese rafforzeranno la propria posizione di leadership del settore e potranno seguire i trend di crescita previsti nel mercato dei prodotti caratterizzati da genuinità e salubrità. Il raggiungimento dei risultati del progetto consentirà inoltre alle imprese di ottenere dei notevoli riduzione nei costi di gestione. La realizzazione del progetto consentirà alle imprese di migliorare la propria posizione competitiva sul mercato e pertanto garantire la salvaguardia degli attuali posti di lavoro. Le prospettive di crescita descritte in precedenza potranno consentire uno sviluppo occupazionale in modo particolare nelle componenti tecniche e di ricerca. Bonassisalab srl: i risultati che si otterranno dal progetto, una volta implementati in azienda, comporteranno notevoli ricadute sull azienda. In particolare grazie alla messa a punto di una metodica di analisi unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati, la BonassisaLab pensa di poter riportare la grossa parte dei controlli alimentari della filiera cerealicola all'interno della regione Puglia e più settorialmente in Capitanata, tradizionalmente il Granaio d' Italia. L azienda infatti ritiene che l'implementazione di metodiche innovative di questo livello potrebbe portare ad una serie di commesse analitiche su cereali, sfarinati, pasta e prodotti da forno tali da convincere il primo gruppo europeo del settore ad affidare alla Bonassisalab la grossa parte dei propri controlli sulla sicurezza alimentare. Tali servizi innovativi sono attualmente svolti nel nord Italia ed all'estero da strutture multinazionali, ma tali servizi ad oggi non soddisfano le esigenze dei grandi produttori, soprattutto per la tempistica molto lunga dei risultati analitici che risulta poco funzionale allo sblocco delle partite dei fornitori che sono localizzati principalmente nel centro sud Italia. A tal scopo Bonassisalab si propone di svolgere la propria attività di ricerca all'interno dell'ex stabilimento di ricerca della Barilla denominato Corial nella zona Asi di Foggia che verrebbe dopo anni ridestinato alla propria attività caratteristica con evidenti ricadute sull'area, sul territorio, sulla Puglia tutta. Inoltre si ritiene che tale attività abbia anche un indotto di piccoli concorrenti, di fornitori di materie prime e semilavorati molto promettente. Nel caso specifico di una analisi multiresiduale e multi micotossine su cereali e derivati la Bonassisalab si impegna a fornire risultati in ore; pertanto l introduzione di una metodica altamente sensibile, capace di ridurre tempi e costi di analisi andrebbe a migliorare la competitività dell azienda sul mercato. La messa a punto della nuova metodica, infatti, permetterà all azienda di poter soddisfare un numero maggiore di richieste di analisi oltre a fornire risultati analitici sicuri in quanto saranno quantificabili concentrazioni ben al di sotto dei limiti di legge. I risultati di tale progetto di ricerca, dunque, saranno immediatamente spendibili dall azienda proponente e porteranno di riflesso numerosi vantaggi anche al tessuto produttivo locale. Invece grazie alla messa a punto di un prototipo per la determinazione di patogeni emergenti in molluschi bivalvi la Bonassisalab potrebbe incrementare la propria credibilità, essere più concorrenziale 157

158 sul mercato e, quindi, ampliare il proprio mercato (aumentando il numero dei clienti e al tempo stesso dei ricavi) sia sul territorio regionale ma anche nazionale o internazionale, attraverso l erogazione di un servizio aggiuntivo di analisi totalmente innovativo che possa servire per: 1. garantire nel prodotto da commercializzare l assenza di protozoi di origine fecale non contemplati dalla normativa, pericolosi per la salute umana, ma sottovalutati; 2. far conoscere indirettamente l efficienza di rimozione degli impianti di depurazione dei molluschi; 3. mettere in atto sistemi per contrastare il rischio di contaminazione; 4. denunciare situazioni di illegalità dovute alla contaminazione fecale da reflui urbani e/o zootecnici nelle lagune della Puglia settentrionale o di inefficienza degli impianti di depurazione che scaricano in mare/laguna/laghi. Da una stima dei costi non si prevede di realizzare grossi investimenti per l industrializzazione, per cui l iniziativa dell impresa proponente risulta essere vantaggiosa economicamente. Oltre alle ricadute sull azienda non sono da sottovalutare le ricadute economiche indirette sul sistema produttivo del territorio, ad esempio per quanto riguarda la tutela del prodotto tipico pugliese. Il controllo dei prodotti con la tecnologia messa a punto indurrebbe al mantenimento di abitudini alimentari che tendono a scomparire per la sempre minore fiducia da parte del consumatore, in particolare, per la consumazione dei molluschi bivalvi crudi, abitudine tipica delle regioni italiane (soprattutto meridionali) ed estere, e, contestualmente, a promuovere il prodotto in altre regioni italiane in cui tale cultura gastronomica è meno consolidata. Dal punto di vista economico-produttivo, infatti, tale ricerca risulta vantaggiosa per l impresa per l interesse della stessa a fornire un servizio aggiuntivo alla clientela, finalizzato a prevenire il rischio di trasmissione di infezioni e avente esplicite ricadute sul business aziendale e indirettamente anche sui consumatori che potranno disporre di un prodotto con maggiori garanzie igienico-sanitarie; si tratterà, infatti, di un servizio unico a livello nazionale che consentirà all Impresa di differenziare l offerta, di specializzarsi e caratterizzarsi anche sul territorio nazionale. Tali aspetti consentiranno l avvio di un processo virtuoso di domanda e offerta tra i clienti e l Impresa, proiettato ad ottenere sempre maggiori garanzie di qualità e sicurezza del mollusco bivalve. Dal punto di vista tecnologico, tale ricerca consente di mettere a punto una tecnologia innovativa e inedita che potrà essere adottata non solo dalle imprese che si occupano della produzione e/o commercializzazione dei molluschi ma anche dai laboratori di prova (pubblici e privati) specializzati in analisi sugli alimenti, dagli impianti di depurazione, dai veterinari ispettori per entrare definitivamente nel processo di controllo HACCP di numerosissime imprese, etc. Centro Latte Stasi srl: i risultati che si otterranno dal progetto, una volta implementati in azienda, comporteranno un ampliamento della quota di mercato ed una riduzione di perdite di produzione causate da alterazioni da Pseudomonas spp. Negli ultimi mesi diversi casi di alterazioni degli alimenti hanno ricevuto una notevole risonanza mediatica. Tra questi, quello che ha sconcertato maggiormente l opinione pubblica è stata la comparsa di una colorazione blu su alcune mozzarelle. In un primo momento il caso ha coinvolto produzioni non italiane presenti in alcuni discount del nostro territorio; successivamente, i sistemi di allerta rapido hanno evidenziato numerosi altri casi, anche di prodotti italiani. Questo evento ha sicuramente scosso l opinione pubblica creando un danno di immagine non indifferente alle nostre imprese e al prodotto mozzarella. Recenti dati di Coldiretti Puglia evidenziano che sono quasi 2 i milioni di quintali di latte che vengono importati annualmente dalle imprese lattiero casearie pugliesi, di cui circa 1 milione e 600mila provenienti soprattuttodalla Germania. La situazione del comparto lattiero caseario nazionale è rappresentato da 970 aziende che producono un valore pari a 3,5mn euro (Databank prevede un leggero calo nei prossimi anni). Il comparto lattiero caseario pugliese è costellato da un numero elevato di piccoli Rif. Avviso Prot. n. 394/10 del 20 luglio 2010 caseifici con carattere artigianale, che hanno un mercato ristretto al massimo a livello regionale o ad alcune zone delle regioni limitrofe (ARTI, 2010). In questo contesto Centro Latte Stasi srl possiede un mercato di dimensioni superiori alla media del territorio, e risulta capace di consolidare la propria presenza a livello nazionale tramite la distribuzione nella GDO, sia con prodotti a proprio marchio, sia con marchio a terzi. I suoi principali concorrenti sul territorio pugliese sono tutti concentrati nell area barese (Montrone SpA, Sanguedolce srl, CAP Putignano soc.cop. arl). La messa a punto di un protocollo biotecnologico capace di controllare la proliferazione di Pseudomonas spp. e di altri microrganismi e la sua successiva validazione permetterà di ottenere una mozzarella innovativa che comporta un aumento della competitività del prodotto in termini di sicurezza alimentare e rischio di contaminazioni. Questo consentirà di allargare di almeno il 10% l attuale mercato considerando la particolare attenzione della GDO ad evitare problematiche legate alla distribuzione di prodotti alterati. 158

159 Si precisa che l innovazione derivante dalle attività di ricerca che con questa iniziativa si intende perseguire bene si integra nell attuale processo aziendale, senza la necessità da parte dell azienda di dover sopportare degli investimenti per industrializzare il processo. Ciullo Carni srl: i risultati che si otterranno dal progetto, una volta implementati in azienda, comporteranno indubbi vantaggi economici che scaturiscono da una riduzione dei costi di gestione dell azienda. Il settore della carne bovina rappresenta una delle componenti fondamentali non solo della zootecnia italiana, ma di tutto il sistema agroalimentare nazionale. Le aziende operanti nell industria delle carni assieme a quelle delle trasformazioni lattiero casearie costituiscono i comparti più importanti dell industria alimentare italiana. Il fatturato dell industria di trasformazione vede poco meno di 6 miliardi di euro derivanti dalle sole carni bovine. Il comparto delle carni, e più nello specifico, il settore dei tagli di carne bovina sta vivendo dei cambiamenti legati, da una parte, all andamento del mercato, dall altra, alle modifiche della politica agricola comunitaria e all introduzione di nuove norme in materia igienico sanitaria. Negli ultimi anni si è verificato un rallentamento dei consumi di carne bovina che ha visto i consumatori non solo ridurre gli acquisti di carne ma anche orientarsi verso prodotti di prezzo inferiore. Un altro cambiamento importante in atto nel comparto delle carni bovine riguarda la concentrazione delle aziende in strutture di grandi dimensioni, come conseguenza dell innalzamento degli standard igienici richiesti agli allevamenti e agli stabilimenti di macellazione a seguito delle norme introdotte a livello europeo. L adeguamento a tali norme ha comportato infatti un aumento dei costi di gestione, a discapito soprattutto dei piccoli allevatori e macellatori con la chiusura dei loro stabilimenti di produzione. La Ciullo carni ha recentemente ammodernato il proprio stabilimento di produzione, che oggi assume dimensioni più vicine a quelle oggetto del suddetto cambiamento. Da ciò la necessità di adeguarsi anche agli standard di sicurezza e qualità verso i quali l intero comparto deve inevitabilmente tendere per restare al passo con le norme dettate dalla politica Comunitaria. Rispetto la concorrenza, appare chiaro come, dal successo dell iniziativa proposta possa derivare un immediato vantaggio competitivo per la ditta proponente, che, attraverso una adeguata strategia di marketing, veicolerebbe presso il consumatore finale l informazione inerente l innovatività dei metodi adottati per garantirne la sua sicurezza. E inoltre ipotizzabile un minor costo per le analisi dei patogeni attraverso il metodo sviluppato rispetto a quanto accade attualmente con i metodi tradizionali. Il risultato del progetto, inteso come metodiche e sistemi innovativi di analisi dei patogeni (Listeria e Salmonella) può essere sfruttato anche nella costituzione di uno spin off per la produzione e distribuzione di prodotti tecnologicamente avanzati da destinare ad un mercato delle biotecnologie e di sistemi di analisi microbiologica. Biotecgen srl: i risultati che si otterranno dal progetto comporteranno notevoli ricadute sull azienda. Biotecgen opera nel settore della Ricerca e Sviluppo Biotecnologico attraverso la messa a punto di kit diagnostici rapidi da applicare in campo agroalimentare, medico ed ambientale. Tale segmento di mercato, soprattutto in Puglia, non prevede grossi competitor. L azienda è in grado di fornire soluzioni mirate e sviluppate intorno alle esigenze tecnologiche dell azienda cliente. In particolare grazie ai risultati dell attività di progetto Sviluppo di sistemi di allerta rapidi di detection delle specie salmonella e listeria nelle carni, BTG riuscirebbe a penetrare nuove fette di mercato per l azienda che potrebbe pensare, attraverso la costituzione di uno spin-off dedicato, di produrre e vendere il dispositivo. Nell ambito delle attività di progetto riguardanti lo Sviluppo di sistemi innovativi per la diagnosi rapida di metalli pesanti in prodotti freschi l azienda si occuperà della funzionalizzazione dei cristalli di quarzo necessari all analisi per l individuazione di ioni metallici attraverso microbilance. Lo sviluppo di questo sistema potrebbe aprire all azienda nuovi segmenti di mercato, che non avendo ad oggi una offerta semplice ed economica, potrebbero consentirne un ottimo posizionamento ed una conseguente crescita in termini di fatturato e numero di occupati. 159

160 Previste ricadute occupazionali Per quanto riguarda la richiedente DARe scarl, l incremento di fatturato avrà effetti diretti sulla stabilizzazione delle risorse umane formate negli ultimi tre anni. Si prevede inoltre di aumentare il personale di ulteriori sei unità. Per quanto concerne i partner di progetto, sarà promossa l attrazione di giovani talenti e ricercatori sia nella fase di ricerca sia nella fase di formazione. Nella prima saranno attivate borse di studio, assegni di ricerca, o contratti sulla base di bandi pubblici per titoli ed esami (per gli organismi di ricerca pubblici) ovvero sulla base di interviste personali (per gli altri proponenti). Il personale così coinvolto sarà destinato direttamente, sotto la supervisione di ricercatori senior, alle attività di ricerca e sperimentazione previsti nel lay out progettuale. Nel progetto formativo, invece, i giovani talenti saranno coinvolti anche in qualità di utenti. A tale proposito, per favorire un reclutamento efficace ed efficiente, una particolare attenzione sarà dedicata alla attività di promozione del percorso formativo così come si evince dal progetto. A questa iniziativa seguirà anche una adeguata remunerazione al fine di incentivare la partecipazione di quanti volessero candidarsi. Il progetto, stante la sua validità industriale, persegue il fine di preservare e rafforzare la competitività dei partner industriali e di irrobustire la capacità di sviluppare conoscenza degli organismi di ricerca. In chiave prospettiva, ciò induce a considerare che il pronostico di successo delle attività progettuali possano concorrere non solo all obiettivo di una salvaguardia degli attuali posti di lavoro ma anche ad un potenziale incremento degli organici frutto da una parte di una strutturale internalizzazione delle attività di R&D da parte delle imprese e dall altra di una industrializzazione futura dei prototipi sperimentali messi a punto nel progetto. Gli effetti indotti emergono chiaramente dalla matrice multidisciplinare delle attività previste e dalla diversa specializzazione delle imprese raggruppate a filiera. Impatto atteso sul riposizionamento strategico delle imprese proponenti e del sistema socioeconomico delle Regioni della Convergenza L impatto del progetto sulla struttura economica dell agro-alimentare pugliese è evidente poiché va ad incidere sostanzialmente sulla peculiare debolezza strutturale e strategica dell industria di seconda trasformazione. Da un punto di vista strutturale, l industria di prima trasformazione in Puglia tende ad avere potenzialità simili o addirittura superiori rispetto a quelle dell agricoltura (indice di assorbimento potenziale). Inversamente, l industria di seconda trasformazione presenta dimensioni decisamente inferiori rispetto a quelle dei settori a monte. Tali considerazioni sono avvalorate dalla consistenza di frantoi, sansifici, raffinerie, cantine, mulini, imprese di raccolta dell ortofrutta, conservifici e dal relativo sottodimensionamento in termini di pastifici, imbottigliatori di vino e di olio, imprese di condizionamento industriale dell ortofrutta. Inoltre, le imprese regionali hanno mediamente dimensioni minori a quelle nazionali visto che i dati indicano una media di 4,7 addetti per azienda contro il dato italiano di 6,1 addetti. La gran parte delle imprese alimentari ha dimensioni molto piccole: in Puglia oltre il 90% delle imprese non supera i 10 addetti. Per documentare in qualche modo i ritardi strutturali del tessuto produttivo pugliese rispetto ad altre regioni italiane può essere interessante valutare i dati pubblicati dall annuario AGRA inerenti la graduatoria nazionale delle aziende con maggior fatturato. Tra le prime 500 imprese per fatturato solo 14 sono pugliesi e, di queste, solo una è tra le prime 100. Le restanti aziende di dimensioni interessanti sono distribuite prevalentemente nel settore molitorio e in quello pastario. Passando a considerare le strategie delle imprese pugliesi, invece, il progetto tende a favorire il rafforzamento di imprese innovative particolarmente adeguate a fronteggiare i moderni scenari di mercato. Le proponenti, infatti, rientrano nel gruppo delle imprese con marchi oramai riconosciuti a livello nazionale anche se continuano a realizzare la gran parte del proprio fatturato sui mercati regionali o meridionali. Il vantaggio competitivo di questa particolare tipologia di aziende risiede soprattutto nella reputazione acquisita presso la clientela che costituisce un asset difficilmente aggredibile da parte della concorrenza. Come il progetto dimostra, queste aziende associano alla tradizione dei marchi e delle aziende il tentativo di rafforzare la presenza in ambito nazionale ed internazionale con investimenti tecnologici oltre che organizzativi e pubblicitari. 160

161 Previsione della localizzazione dello sfruttamento industriale Il percorso di sfruttamento dei risultati della ricerca avverrà prioritariamente attraverso lo strumento della brevettazione. Laddove il risultato conseguito non sia brevettabile, attraverso appositi accordi, di individuerà lo strumento di privativa più idoneo tra quelli previsti dal nostro ordinamento giuridico (segreto industriale know-how, ecc.). Entrambe le fattispecie verranno comunque regolate da opportuni accordi di confidenzialità che completeranno la tutela relativa alla privativa/sfruttamento con quella relativa alla segretezza dei dati e delle informazioni di progetto nonché delle procedure atte a disciplinare la loro divulgazione. Le imprese proponenti si impegneranno a valorizzare i risultati della ricerca nei propri stabilimenti all interno della Regione Puglia. 5) ARTICOLAZIONE DEI COSTI Distretto Agro-alimentare Regionale scrl Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR1 OR2 OR2 OR2 OR3 OR3 OR4 OR5 OR5 OR5 OR5 OR6 OS1.1 OS2.1 OS2.2 OS2.3 OS3.1 OS3.2 OS4.1 OS5.1 OS5.2 OS5.3 OS5.4 OS6.1 RI 0,36 0,36 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,23 0,23 0,00 0,00 SS 0,03 0,03 0,00 0,00 RI 0,31 0,31 0,00 0,00 SS 0,03 0,03 0,00 0,00 RI 0,04 0,04 0,00 0,00 SS 0,01 0,01 0,00 0,00 RI 0,50 0,50 0,00 0,00 SS 0,14 0,14 0,00 0,00 RI 0,54 0,54 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,22 0,22 0,00 0,00 SS 0,02 0,02 0,00 0,00 RI 0,07 0,07 0,00 0,00 SS 0,03 0,03 0,00 0,00 RI 0,24 0,24 0,00 0,00 SS 0,06 0,06 0,00 0,00 RI 0,39 0,39 0,00 0,00 SS 0,06 0,06 0,00 0,00 RI 0,38 0,38 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,30 0,30 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 OR6 OS6.2 RI 0,18 0,18 0,00 0,00 161

162 OR7 OR7 OR7 OR8 OR8 OR8 OS7.1 OS7.2 OS7.3 OS8.1 OS8.2 OS8.3 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,23 0,23 0,00 0,00 SS 0,02 0,02 0,00 0,00 RI 0,45 0,45 0,00 0,00 SS 0,12 0,12 0,00 0,00 RI 0,31 0,31 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,14 0,14 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,19 0,19 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,09 0,09 0,00 0,00 Istituto di Biomembrane e Bioenergetica, Consiglio Nazionale delle Ricerche (IBBE-CNR) Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR3 OS3.2 RI 1,37 1,37 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR3 OS3.2 RI SS Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari, Consiglio Nazionale delle Ricerche (ISPA-CNR) Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR1 OR2 OR2 OS1.1 OS2.2 OS2.3 RI 0,98 0,98 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 2,01 2,01 0,00 0,00 SS 0,40 0,40 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,11 0,11 0,00 0,00 162

163 OR3 OR3 OR4 OR5 OR5 OR5 OR6 OR7 OR7 OR8 OR8 OR8 OR8 OR8 OS3.1 OS3.2 OS4.1 OS5.1 OS5.2 OS5.4 OS6.2 OS7.1 OS7.3 OS8.1 Task OS8.1 Task OS8.2 Task OS8.2 Task OS8.3 Task RI 4,24 4,24 0,05 0,05 SS 1,04 1,04 0,05 0,05 RI 3,39 3,39 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 1,93 1,93 0,36 0,36 SS 0,20 0,20 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,12 0,12 0,00 0,00 RI 2,01 2,01 0,00 0,00 SS 0,54 0,54 0,00 0,00 RI 4,35 4,35 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 1,75 1,75 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 1,51 1,51 0,00 0,00 SS 0,08 0,08 0,00 0,00 RI 3,32 3,32 0,14 0,14 SS 0,08 0,08 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,06 0,06 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,16 0,16 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,32 0,32 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,16 0,16 0,14 0,14 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,71 0,71 0,10 0,10 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR1 OR2 OR2 OR3 OS1.1 OS2.2 OS2.3 OS3.1 RI SS RI SS RI SS RI SS OR3 OS3.2 RI

164 OR4 OR5 OR5 OR5 OR6 OR7 OR7 OR8 OR8 OR8 OR8 OR8 OS4.1 OS5.1 OS5.2 OS5.4 OS6.2 OS7.1 OS7.3 OS8.1 Task 811 OS 8.1 Task 812 OS 8.2 Task OS 8.2 Task OS 8.3 Task SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS Università degli Studi di Bari Aldo Moro, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti DiSSPA (Ex DiBCA) Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR6 OR6 OR8 OS6.1 OS6.2 OS8.1 Task RI 2,21 2,21 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,68 0,68 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,72 0,72 0,00 0,00 164

165 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR6 OR6 OR8 OS6.1 OS6.2 OS8.1 Task RI SS RI SS RI SS Università degli Studi di Bari Aldo Moro, Dipartimento di Medicina Veterinaria (Ex DISPeZ) Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR7 OS7.2 RI 2,37 2,37 0,00 0,00 SS 0,70 0,70 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR7 OS7.2 RI 0 0 SS Università degli Studi di Foggia, Dipartimento di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (Ex DiSA - Ex DiSACD - Ex PRIME) Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR1 OR2 OR5 OR7 OS1.1 OS2.1 OS5.3 OS7.2 RI 4,52 4,52 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 1,86 1,86 0,00 0,00 SS 0,43 0,43 0,00 0,00 RI 0,26 0,26 0,00 0,00 SS 0,46 0,46 0,00 0,00 RI 2,22 2,22 0,55 0,55 SS 0,49 0,49 0,35 0,35 165

166 OR8 OR8 OR8 OS8.1 Task OS8.2 Task OS8.2 Task RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,25 0,25 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,22 0,22 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,22 0,22 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR1 OR2 OR5 OR7 OR8 OR8 OR8 OS1.1 OS2.1 OS5.3 OS7.2 OS8.1 Task OS8.2 Task OS8.2 Task RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS RI SS Università del Salento, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali DiSTeBA (Ex DII) Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR7 OS7.1 RI 1,31 1,31 0,00 0,00 SS 0,30 0,30 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR7 OS7.1 RI SS

167 Agriplan s.r.l. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR6 OR8 OS6.1 OS8.1 Task RI 0,22 0,22 0,02 0,02 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,26 0,26 0,07 0,07 Azienda Vinicola Cantele s.r.l. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR8 OS8.1 Task RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,26 0,26 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR8 OS8.1 Task RI SS Azienda Viti-vinicola Incoronata di Scapola Luca Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR8 OR8 OS8.2 Task OS8.2 Task RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,26 0,26 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,39 0,39 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR8 OS8.2 Task RI SS

168 OR8 OS8.2 Task RI SS Biotecgen s.r.l. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR7 OR7 OS7.1 OS7.3 RI 0,96 0,96 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,51 0,51 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR7 OR7 OS7.1 OS7.3 RI SS RI SS BonassisaLab s.r.l. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OS5 OS7 OS5.3 OS7.2 RI 7,06 7,06 0,00 0,00 SS 0,61 0,61 0,00 0,00 RI 1,09 1,09 0,00 0,00 SS 0,43 0,43 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OS5 OS7 OS5.3 OS7.2 RI SS RI SS

169 Cantine D Alfonso del Sordo s.r.l. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR8 OS8.1 Task RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,26 0,26 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR8 OS8.1 Task RI SS C.D.P. s.r.l. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR4 OR8 OS4.1 OS8.1 Task RI 0,26 0,26 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,26 0,26 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR4 OR8 OS4.1 OS8.1 Task RI SS RI SS Centro Latte Stasi s.r.l. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale 169

170 OR6 OR8 OS6.1 OS8.1 Task RI 0,32 0,32 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,46 0,46 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR6 OR8 OS6.1 OS8.1 Task RI SS RI SS Ciullo Carni s.r.l. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OS7 OS8 OS7.3 OS8.2 Task RI 0,96 0,96 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,48 0,48 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OS7 OS8 OS7.3 OS8.2 Task RI SS RI SS Coop. Lavorazione Prodotti Agricoli Terra Maiorum Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR8 OS8.2 Task RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,26 0,26 0,00 0,00 170

171 OR8 OS8.2 Task RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,39 0,39 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR8 OR8 OS8.2 Task OS8.2 Task RI SS RI SS Industrie Fracchiolla s.r.l. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR3 OR8 OS3.1 OS8.3 Task RI 3,40 3,40 0,05 0,05 SS 1,02 1,02 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,55 0,55 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR3 OR8 OS3.1 OS8.3 Task RI SS RI SS Lab. Instruments s.r.l. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR2 OR5 OS2.3 OS5.1 RI 1,03 1,03 0,00 0,00 SS 0,32 0,32 0,00 0,00 RI 1,41 1,41 0,00 0,00 SS 0,38 0,38 0,00 0,00 171

172 OR5 OS5.2 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,19 0,19 0,00 0,00 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR2 OR5 OR5 OS2.3 OS5.1 OS5.2 RI SS RI SS RI SS Molini Tandoi Pellegrino S.p.A. Personale e consulenze Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Personale Consulenze 87.3a Convergenza 87.3a Convergenza Totale Calabria Campania Puglia Sicilia Calabria Campania Puglia Sicilia Totale OR5 OR8 OS5.4 OS8.2 Task RI 0,49 0,49 0,00 0,00 SS 0,00 0,00 0,00 0,00 RI 0,00 0,00 0,00 0,00 SS 0,64 0,64 0,18 0,18 Altri costi Obiettivo Realizzativo Attività Tipologia Prestazione di terzi Materie prime, semilavorati Materiali di consumo specifici Componenti utilizzati per la realizzazione di prototipi e/o impianti pilota TOTALE OR5 OR8 OS5.4 OS8.2 Task RI SS RI SS

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