Scheda di presentazione del progetto. Titolo del progefto Applicazioni dell'elettroforesi capillare in oncologia.

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1 Scheda di presentazione del progetto Titolo del progefto Applicazioni dell'elettroforesi capillare in oncologia. Obietfivi del progetto Lo scopo di qr"resto progetto e quello di sviluppare e mettere a punto metodiche di elettroforesi capillare. L'applicazione di queste nuove metodiche sarà rivolta allo studio della clonalità nei disordini linfoproliferativi e allo studio della instabilità dei microsatelliti in patologie selezionate. Responsabile del raggiungimento degli obietfivi del progetto Prof. Lorenzo Leoncini. Descriziotte del progetto Fra le varie metodiche di biologia molecolare, senz'altro, la "Polymerase Chain Reaction" (PCR) è quella che trova maggiore impiego nella pratica quotidiana della diagnosi istopatologica. Il patologo. infatti, si trova spesso ad utilizzare tessuti che, per le procedure di campionatura e le metodiche di trattarnento, non possono fornire DNA o RNA utilizzabile con tecniche classiche quali il Southem o ilnorthern Blot. La metodica di PCR, che permette di utilizzare anche piccole sequenze di DNA, si basa sul concetto che una sequenza nucleotidica puo essere amplificata numerose volte fino ad ottenere un numero di copie pari almeno a 106. L'amplificazione del DNA per mezzo della PCR non è limitata al solo DNA genornico, ma può essere applicata anche al DNA complementare, sintetízzato dal RNA usando una reazione di trascrizione iriversa. La PCR rapplesetita quindi I'approccio migiiore per l'identificazione di sequenze di DNA, la caratterizzazione genica e per I'analisi dei livelli di espressione genica. Uno dei rnetodi per poter separare e studiare i vari frammenti del prodottodi PCR è I'elettroforesi capillare (CE). La CE a differenza dell'elettroforesi classica viene eseguita su colonna similmente ad una cromatografia. il tutto avviene in modo automatizzato. Il sistema consiste di uno strumento per l'elettrofbresi collegato ad un computer che mediante software specifico perrnette di acquisire i dati e di analizzarli. Questo strumento permette di effettuare sia analisi delle sequenze del DNA sia analisi GeneScan ed in entrambi i casi vengono utilizzati traccianti fluorocromati invece dei normali traccianti radioattivi. I frammenti di DNA marcati sono sottoposti ad elettroforesi attraverso il materiale polimerico contenuto nel capillare e si separano secondo le loro dimensioni. Mentre passano dal capillare vengono illuminati dal laser attraverso una finestra di rivelazione; i coloranti fluorescenti, ancorati al DNA, passano ad uno stato eccitato ed emettono una radiazione ad una specifica Iunghezza d'onda. La CE va sempre più sostituendo i metodi classici dell'elettroforesi su gel, PAGE (poliacrylamide gel elettrophoresis), Southern Blotting. Essa è caratterrzzata da un'alta sensibilità e dalla possibilità di analtzzare piccole quantità di campione con la minima quantità di reagenti. Inoltre si possono anahzzare tessuti non ideali, come campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina e fare un' analisi quantitativa o semiquantitativa tramite la valutazione dell'altezza di picchi e dell'area descritta dai picchi stessi. Oggi la CE automatizzata è ampiamente utilizzata sia nella diagnostica che nella ricerca. I campi di applicazione piu diffusi sono: -DNA sequencing -Analisi di DNA Fragment o Restriction Patterns (RFLP) -Analisi di Microsatelliti

2 -Analisi di Single-strand Conformation Polymirphism (SSCP) Il sistenra CE. insieme al multi-array capillaries, sarà in futuro la tecnica di elezione per anahzzare corltemporaneamente la sequenza di un grande numero di campioni. L'analisi dei fiammenti di DNA tramite CE viene uttlizzaía per determinare la presenza di mutazioni. polimorfismi e siti di restrizione in una sequenza genica. A differenza del DNA sequencing. l'analisi dei fiammenti prevede I'utilizzo di primers fluorocromati nella reazione standard di PCR in modo tale che il frammento di interesse viene subito visualizzato e quindi analtzz,ato" Usando questa tecnica si puo contemporaneamente, e molto rapidamente, distinguere tra un proclotto di PCR normale e uno mutato. La SSCP combinata con la CE fornisce un valido aiuto per la determinazione di mutazioni note e non. su grandi numeri di campioni e soprattutto per studi di screening. Per quanto riguarda le applicazionin campo oncologico la CE viene uírlizzataper -Determinazione delle aberrazioni cromosomiche -Studio della instabilità dei microsatelliti (MSI) -Studi di clonalità -Determinazione di tumor-related mutations e Single nucleotide Polymorphisms (SNPs). La nostra attività di ricerca sarà rivolta allo studio della clonalità nei disordini linfoproliferativi e allo deila MSI in patologie selezionate. Entrambi gli studi verranno condotti con le queste nuove metodiche di CE. precisamente GeneScan analysis e Sequencing Analysis. I prodotti della ricerca avranno importante ricaduta sul piano diagnostico. Intpalto su altre linee di ricerca. Le attività sopra descritte andranno ad integrarsi ed a favorire lo sviluppo di altri progetti già presenti nel Dipartimento di Patologia Umana e Oncologia, come lo studio della instabilità dei microsatelliti nel carcinoma del colon retto e gli studi di clonalità nei disordini linfoproliferativi. Per quanto riguarda lo studio della clonalità, nel nostro laboratorio si stanno poftando avanti progetti di ricerca che possono, poi, essere applicati in campo diagnostico al fine di migliorare la diagnosi nei disordini linfoproliferativi. Quest'ultimi sono generalmente diagnosticati in base a criteri istomorfologici e immunofenotipici. Spesso questi metodi non sono conclusivi per una corretta diagnosi. Nel 5-10o/o dei casi, infatti, la diagnosi differenziale tra lesione reattiva e linfoma maligno e molto difficoltosa, lo studio della clonalità dei riarrangiamenti dei geni delle immunoglobuline (Ig) e del T-cell receptor (TCR) diventa uri valido aruto. Partendo dal presupposto che tutte ie cellule turirorali abbiano come progenie una singola cellula trasformata e nel caso dei linfomi e delle leucemie questa cellula sia una cellula linfoide, è possibile discriminare tra un processo reattivo policlonale e una proliferazione neoplastica monoclonale. Recentemente, in Europa. è stato condotto uno studio multicentrico per la standardizzazione dí protocolli di multiplex-pcr per I'analisi dei riarrangiamenti dei geni delle Ig e del TCR a cui ha partecipato anche il Dipartimento di Patologia Umana e Oncologia (BIOMED-2 Concerted Action BHM4-CT -3936). La clonalità è stata dimostrata nel 99Yo nelle patologie maligne a cellule B e nel 94% nelle patologie maligne a cellule T, mentre la grande maggioranza delle lesioni reattive mostrano un andamento policlonale. Lo scopo del nostro progetto di ricerca è quello di utilizzare i protocolli BIOMED-2 per lo studio di materiale fissato in formalina e incluso in paraffina. Molti studi hanno dimostrato che il DNA estratto da questi tessuti può essere amplificato al massimo fino a 400bp. Sarà necessario mettere a punto una metodica di PCR che ci permetta di effettuare dei controlli di qualità del DNA stesso, amplificando esoni di geni controllo. Per quanto riguarda la scelta dei primers, essa sarà fatta tenendo conto che dovranno amplificare sequenze di DNA non molto lunghe e dovranno riconoscere la maggior pare dei segmenti genici funzionali dei geni delle IGH e del TCR. I primers selezionati,,serviranno per amplificare: IGH cornpleto (VH-JH), IGH incompleto (DH-JH), IGK (VK-JK e I riarrangiamento Kde), IGL (V)"-J)"), TCRB completo (Vp- JP), TCRB incompleto (DB-JB), TCRG (Vy-Jy) e TCRD. Verranno messe a punto delle multiplex-

3 PCR in accorclo con i protocolli standard. Il metodo utilizzato per discriminare tra prodotto di PCR monoclottale' e policlonale sarà quello della GeneScan fragment analysis. In caso di proliferazione reattiva non-clonale l'analisi di Genescan darà una curva Gaussiana, mentre la popolazione linfoide clonale sarà rappresentata da un picco rnonoclonale del prodotto di PCR. I microsatelliti sono sequenze altamente polimorfiche, sparse lungo tutto il genoma umano, costituite cla ripetizioni in tandem di una subunità rappresentata da due, tre o quattro nucleotidi. Essi sono divctrtati recentemente di grande interesse oncologico perche coinvolti nello sviluppo di una forma ereditaria di carcinoma del colon (sindrome HNPCC: Hereditary Nonpolypous Colorectal Cancer). Individui affètti da sindrome HNPCC mostrano "instabilità genetica"generalizzafa che si evidenzia con la perdita della normale replicazione delle sequenze satellite nel DNA tumorale rispetto al DNA normale (fenotipo RER+;. Recentemente sono stati clonati i geni responsabili di questa sindrome: essi sono coinvolti nel sistema del"dna mismatch repair" (MLH1, MSH2, MS116, PMSl. PM52) responsabili cioè della corretta replicazione del DNA, inclusa la stabllizzazior-re delle sequenze microsatellite. Tali geni sono costitutivamente mutati (mutazioni germinali) nei pazienti HNPCC causando una generalizzata instabilità genetica ed un aumento della frequenza di mutazione. L'alterazione in lunghezza di sequenze microsatellite, interne o adiacenti a geni del controllo della proliferazione cellulare, puo modificare qualitativamente o quantitativamente il prodotto dei geni stessi, giocando così un ruolo nella tumorigenesi. Fra i vari tipi di tumori finora studiati. mostrano instabilità genetica il carcinoma dello stomaco, dell' endometrio, del tratto biliopancreatico e dell'apparato urinario. Nel Dipartimento di Patologia Umana e Oncologia, la MSI viene studiata su tessuti freschi di pazienti cott carcinoma del colon-retto. Questo progetto, invece, sarà rivolto allo studio di pazienti con diversi tipi di tumore e I'analisi verrà effettuata su materiale fissato in formalina e incluso in paraffina. Per lo stesso paziente I'analisi sarà effettuata sia sul DNA normale che su quello tumorale e i risultati confrontati. In caso di elevata instabilità (MSI-H), definita dal protocollo di Bethesda come bandshift di 2 o piu nricrosatelliti, che depcne per un rischio di familiarità per iluiazioni dei geni codilìcanti le proteine del " DNA mismatch repair", veffano studiate quest'ultime in modo da identificare il gene interessato. I rnicrosatelliti da analizzare verrano selezionati, a seconda del tipo di tumore, servendosi del pannello della Consensus Conference del National Cancer institute di Bethesda. ll materiale esaminato sarà DNA genomico estratto da tessuto normale e patologico proveniente da sezioni di tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina, sezionato, raccolto su vetrino e infrne prelevato con microdissettore laser. ImpaÍto sulla.sírutture orgunizzcttive coinvolte nel proqetto. Nell'ambito dei progetti di ricerca condotti in collaborazione con settori disciplinari affini presenti nell'ateneo (MED/6, MED/8. MED/I5, MED/18, MED/46) la messa a punto di nuove metodiche I'interpretazione dei risultati contribuirà ad avvalorare i dati raggiunti. Inoltre la possibilità di mettere a disposizione tecniche sempre piu aggiornate può contribuire a migliorare la qualità della didattica in campo biomedico. Tempi previsti per Is realizzazione del progetto Data di inizio del PROGETTO: Data di ultirnazione del PROGETTO: Durata del PR.OGETTO: 60 mesi Risorse unlane, strumentetli e servizi coinvolti In questo progetto saranno coinvolti i'docenti responsabili di altri progetti di ricerca che sono assirnilabili allo stesso (Marcella Cintorino, Maria Teresa del Vecchio, Franco Roviello, Enrico

4 Pinto, Picro 1'osi); verrà coinvolto anche personale non docente in servizio presso i laboratori del Dipartinrento (Nazzareno Palummo, Lorenzo Pacenti, Rosella vatti) Gli strirtrrcnttrftlizzati saranno quelli del Laboratorio di Biologia Molecolare del Dipartimento di Patologia LJrrana E Oncologia. Essi cotrrpt'etrdono. oltre alla comune atfrezzaturapresente nei laboratori: - piccola strutlentazione (termociclizzatori, centrifughe, apparati per elettroforesi)l - grarrdi a lezzaruíe (sistema per elettroforesi capillare ABI PRISM 310 Applied Biosystem, microdi ssettore laser Arctr-rrus). Risorse u,nune coinvolte Professionalità individuata: n. I unità di personale di area tecnica, cat. D, con conoscenze approfondite di tecniche di biologia molecolare e cellulare nell'ambito dello sviluppo ed applicazione di metodologie strumentali in campo biomedico; Titolo di sttrdio previsto: Diploma universitari o Laurea triennale. Attività da svolgere all'interno del progetto: Attuazione dei seguenti punti previsti dal progetto: 1) Selezione dei casi da analizzare, estrazione del DNA e controllo della qualità del DNA eslratto: 2) Messa a punto delle tecniche per I'amplificazione dei geni IgVH, TCR; 3) Scelta dei primers ed amplificazione delle sequenze microsatellite; 4) Ottimizzazione de ll'elettroforesi capillare; 5) Analisi delle GeneScan. Progru m nruzio ne p I urie n nal e del I' attività Descriziona làsi e sottofasi del Proqefto Data prevista inizio attività Data nrevista fine attività Selezione dei casi daanahzzare, estrazione del DNA dai tessuti includi in paraffina. controllo della qualità del DNA estratto, determinazione della quantità t per la successiva amplificazior-re. Messa a punto delle tecniche per I'arnplifìcazione dei geni IgVH. TCR. tramire PCR (Polin'rerasi ['hain Reaction). Scelta dci primers e arnplificazione delle sequenze microsatellite su tessuti provenienti da vari tipi di tumori chc mostrano instabilità

5 genetica colre il cancro del colon rctto. il cancro dello slomaco. dcll'endometrio, del sistema biliopancreatico e del sistema urinario. Ottimizzazione ell'elettroforesi capillare (GeneScan) e applicazione di essa ai prodotti di PCR. Analisi de llc Genescan ed interrrretazione dei risultati I Approvato dal Consiglio di Dipartimento con delibera de ; modifiche da portare a ratifica nclla seduta del II II responsabile del progetto (Prof. Lorenzo Leoncini) Direttoi'c del Diparlimento (Prof.ssa l\4arcella Cintorino) Siena. { * Zoof