LA DIAGNOSI DEI LINFOMI MALIGNI ATTRAVERSO TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE

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1 LA DIAGNOSI DEI LINFOMI MALIGNI ATTRAVERSO TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE Dott.ssa Cristina Colarossi Anatomia Patologica Istituto Oncologico del Mediterraneo Catania

2 Linfomi I Linfomi sono malattie monoclonali neoplastiche caratterizzate dalla proliferazione di linfociti B o T negli organi linfoidi. Causano un sovvertimento strutturale del linfonodo Nella maggioranza dei casi la diagnosi si basa su aspetti morfologici ed immunofenotipici Nel 5-15% dei casi sono necessarie analisi molecolari per conferma diagnostica

3 ANATOMIA DEGLI ORGANI LINFOIDI

4 Classificazione dei linfomi A CELLULE B Immature Mature CLL/SLL Folliculare Marginale Diffuso a grandi cellule Mantellare Burkitt Mieloma plasmacellulare A CELLULE T/NK Immature Mature NOS Angioimmunoblastico Micosi fungoide/sézary Anaplastico a grandi cellule LINFOMA DI HODGKIN

5 Clonalità dei linfomi L analisi della clonalità delle cellule linfoidi attraverso l amplificazione, mediante PCR, delle regioni VDJ dei geni delle immunoglobuline (IG) e del recettore dei linfociti T (TCR) permette di distinguere processi reattivi (policlonali) dalle neoplasie (monoclonali)

6 LOCI DELLE IMMUNOGLOBULINE I segmenti genici V (Variable) sono collocati all'estremità 5' di ciascun locus delle Ig. Sono lunghi mediamente 300 bp. I segmenti genici D (Diversity) sono collocati oltre i segmenti V e sono presenti solo nel locus per le catene pesanti delle Ig I segmenti genici J (Joining) sono collocati a valle dei segmenti D. Ciascun segmento J è lungo bp. I segmenti genici C (Constant) codificano per la regione costante delle catene pesanti e delle catene leggere Ig

7 Loci delle catene delle immunoglobuline

8 TCR I loci codificanti per le quattro catene del TCR (α, β, γ, δ) sono collocati sul cromosoma 7 sul cromosoma 14 Nei loci per i geni del TCR la struttura è simile a quella dei loci genici per le Ig, si riscontrano ancora una volta segmenti V, D, J e C. Le catene α e γ non possiedono segmenti D

9 Loci del TCR

10 Riarrangiamenti genici I geni delle immunoglobuline e del TCR contengono molti segmenti VDJ che vengono riarrangiati durante lo sviluppo iniziale dei linfociti Il processo di riarrangiamento affianca casualente un segmento V, uno D, ed uno J in modo da creare le regioni variabili di geni ricombinati che possono essere trascritti in mrna e codificare per i recettori dell antigene.

11 Fasi del Riarrangiamento I riarrangiamenti sono mediati da un complesso enzimatico nel quale le proteine RAG1 e RAG2 agiscono tagliando a livello di speciali sequenze segnale (regioni RSS) Dopo il taglio inserzioni o delezioni di nucleotidi aumentano la diversificazione L ultima tappa è l avvicinamento dei segmenti genici

12 Clonalità dei linfomi Clonalità linfomi B Valutazione molecolare del riarrangiamento del gene IgH:(catena pesante delle immunoglobuline) Valutazione molecolare del riarrangiamento del gene IgK: (catena leggera delle immunoglobuline) Clonalità linfomi T Valutazione molecolare del riarrangiamento del gene gamma del recettore dei linfociti T (TCR gamma) Valutazione molecolare del riarrangiamento del gene beta del recettore delle cellule T (TCR beta).

13 BIOMED 2 Uno studio coordinato dal gruppo BIOMED 2 (ora chiamato euroclonality consortium) ha standardizzato i protocolli con multipli set di primers (Van Dongen, Leukemia, 2003) Numerosi lavori scientifici nel decennio successivo hanno confermato la sensibilità, specificità e riproducibilità dei test Tali protocolli possono essere applicati allo studio di campioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina, agoaspirati e biopsie osteomidollari decalcificate

14 Limiti degli studi molecolari Sensibilità limitata in caso di un normale background policlonale, (es Linfoma B T cell rich) con percentuale di linfociti clonali < 10% Clonale non è sempre sinonimo di malignità (processi linfoproliferativi EBV correlati o proliferazioni cutanee benigne a fenotipo T) I riarrangiamenti di Ig e TCR non sono esclusivi di una linea cellulare: riarrangiamenti di TCR possono riscontrarsi in neoplasie immature a fenotipo B o alcune leucemie mieloidi acute.

15 Valutazione qualità del DNA Il DNA estratto da tessuti FFPE è di qualità subottimale e potrebbe contenere inibitori della PCR E essenziale valutare l integrità e l amplificabilità del DNA Il protocollo BIOMED 2 ha standardizzato una multiplex PCR contenente i primers di geni housekeeping di 100, 200, 300 e 600 paia di basi Per l analisi di IGH/TCR la PCR di controllo dovrebbe amplificare prodotti di almeno 300 bp

16 Analisi qualitativa DNA AF4 PLZF RAG1 TBXAS La presenza delle 4 bande indica che il DNA genomico è integro. La qualità del campione è idonea per effettuare amplificazioni, mediante PCR, anche di frammenti di grosse dimensioni

17 Clonalità IGH Tre set di primers amplificano 3 regioni nella regione variabile e la regione J Due set di primers amplificano la regione D e J L analisi dei prodotti di PCR può essere condotta con metodica: Heteroduplex: i prodotti di PCR vengono denaturati a 95, rinaturati a 4 e poi corsi su gel di poliacrilamide al 6% Gene scanning: i primers devono essere marcati con fluorocromo per analizzare i prodotti di PCR con metodi automatizzati (es sequenziatore 3500)

18 Clonalità IGH

19 Analisi dei prodotti di PCR

20 Analisi riarrangiamento del gene IGH

21 Ipermutazione somatica (Maturazione dell affinità Negli organi linfoidi periferici i linfociti B maturi (centrociti o cellule del centro germinale) subiscono un ulteriore diversificazione nel sito di riconoscimento antigenico tramite il processo di ipermutazione somatica. Dopo l incontro con l antigene e la stimolazione del linfocita B da parte di un linfocita T helper, si generano delle mutazioni puntiformi nelle regioni geniche codificanti per i domini variabili di IGH.

22 Leucemia Linfatica Cronica In circa il 50% dei casi la cellula neoplastica origina in una fase di maturazione linfocitaria antigene indipendente (pre-centro germinativo nel linfonodo). Non sono presenti mutazioni somatiche del gene IgVH Nel restante 50% dei casi circa la cellula neoplastica origina in fase maturativa Ag dipendente, post centro germinativo. Sono presenti mutazioni somatiche del gene IgVH

23 Stato mutazionale di IGVH nella LLC M-CLL (mutata): a buona prognosi; U-CLL (non mutata) a prognosi infausta Cut-off: 98% di identità con la sequenza germline Linee guida per l analisi molecolare (European Research Initiative on CLL, ERIC reccomendation) Lo stato mutazionale puo essere determinato in qualsiasi momento.

24 IGH Hypermutation

25 Traslocazioni e riarrangiamenti nei linfomi Riarrangiamenti B-cell Linfoma/Leuk T-cell Linfoma/Leuk Catene pesanti Ig T-cell receptor Patologia Traslocazione Geni coinvolti Linfoma follicolare t(14;18) BCL2-IgH Linfoma mantellare t(11;14) BCL1-IgH Linfoma di Burkitt t(8;14) MYC-IgH Linfoma anaplasticot(2;5) ALK-NPM

26 BCL2/IGH t(14;18)(q32;q21) Presente nel 90% dei FL e nel 20% dei DLBCL Giustappone il gene che codifica per l elemento J delle catene pesanti delle immunoglobuline, (14q32), al gene Bcl-2 (18q21) Pone BCL2 sotto il diretto controllo trascrizionale di enhancers del locus IGH e successiva alterazione dell espressione della proteina La valutazione della traslocazione è di ausilio diagnostico per distinguere il linfoma da iperplasia linfoide benigna Monitorare la recidiva neoplastica e la malattia minima residua.

27 BCL2/JH Maior Breakpoint Region (MBR): 70% delle rotture del gene bcl2 al livello del terzo esone Minor cluster region (mcr) :I rimanenti punti di rottura sono situati 20 kb a valle del terzo esone. Analisi cariotipica FISH Southern blotting PCR

28 Traslocazione t(14;18) BCl2/JH CT (-): --- bp Dimensione ampliconi di controllo CT (+): 250 bp

29 FOLLOW UP La malattia minima residua La presenza di un basso numero di cellule neoplastiche dopo terapia viene definito come malattia minima residua (MRD) Metodiche di RT PCR consentono di evidenziare la presenza di numerose traslocazioni con maggiore precisione e sensibilità (1x10 5) rispetto alla citogenetica convenzionale (1x10 2 ) RT-PCR è pertanto il metodo di scelta per monitorare la risposta al trattamento e l eradicazione completa di cellule neoplastiche durante il corso della malattia

30 NEXT GENERATION SEQUENCING

31 NGS

32 NGS Le due tipologie di piattaforme NGS più diffuse permettono il sequenziamento parallelo massivo di molecole di DNA amplificate in modo clonale. Nelle tecnologie NGS, il sequenziamento viene effettuato mediante cicli ripetuti di estensioni nucleotidiche ad opera di una DNA-polimerasi. La procedura è parallela e massiva, e consente di sequenziare da centinaia di Mb fino a Gb di DNA in un unica seduta analitica.

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