Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche HHV-6. Prof. Oliviero E. Varnier
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1 Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche HHV Prof. Oliviero E. Varnier Sezione di Microbiologia Dipartimento di Scienze Chirurgiche R Diagnostiche Integrate (DISC)
2 HERPES VIRUS HUMAN HERPESVIRUS 6 HHV-6! Il virus erpetico umano-6 (HHV-6) fu isolato in maniera casuale per la prima volta nel 1986 da linfociti periferici (linfociti B) di sei soggetti affetti da patologie di tipo linfoproliferativo, due dei quali erano contemporaneamente infettati da HIV.! Esso fu denominato virus umano B linfotropo (Human B-Lymphotropic Virus, HBLV). Di fatto, si è visto che infetta di preferenza linfociti T.! Successivamente il virus fu rinvenuto in Africa nel sangue periferico di soggetti infetti da HIV e in individui con compromissione delle difese immunitarie in seguito a trapianto.! Il virus è stato riscontrato anche nella saliva di adulti sani e nel sangue periferico di bambini durante l'infezione primaria. 2 di 00
3 HHV-6! Una risposta anticorpale specifica contro HHV-6 è dimostrabile in gran parte della popolazione adulta;! la maggioranza dei soggetti contrae l'infezione durante il primo anno di vita. Il virus è stato posto in relazione etiopatogenetica con l'exanthema subitum (o VI malattia), descritto per la prima volta nel 1910 da J. Zahorsky negli Stati Uniti) e! viene ipotizzato un suo ruolo come cofattore per la progressione verso le manifestazioni conclamate di AIDS, in soggetti affetti da HIV.! L'HHV-6 è stato chiamato in causa nella genesi di numerose patologie tra le quali: epatite, infezioni opportuniste nei trapiantati, linfomi, sindrome di Sjogren, collagenopatie e la sindrome da fatica cronica. 3 di 00
4 PATOLOGIE ASSOCIATE A HHV-6 Exanthema subitum, (Roseola infantum, sesta malattia). HHV-6 è l agente etiologico della sesta malattia. La dimostrazione della sieroconversione e l isolamento del virus dal sangue periferico non lasciano dubbi sul ruolo etiologico del virus nell infezione esantematica primaria. Le manifestazioni della patologia, una malattia febbrile (la febbre sale rapidamente fino a 40.6 C e dopo 4-8 giorni scende altrettanto rapidamente), autolimitantesi della primissima infanzia, possono complicarsi in: epatite grave fatale o encefalite. Nei bambini più grandicelli e negli adulti, l'infezione primaria può presentarsi più frequentemente come una sindrome simil mononucleosica: HHV-6 è responsabile di circa il 12% delle mononucleosi anticorpi eterofili negative, che quindi non possono essere unicamente ascritte al CMV. 4 di 00
5 HHV-6 e Malattie Linfoproliferative! Il virus è stato implicato in malattie linfoproliferative a carattere maligno e benigno. In effetti il virus è stato originariamente isolato da diversi pazienti con malattie neoplastiche, linfoma cutaneo a cellule T, linfoma immunoblastico e leucemia linfatica acuta.! Il genoma di HHV-6 è stato identificato indipendente-mente in due laboratori in associazione con una condizione linfoproliferativa premaligna nota come linfoproliferazione policlonale atipica.! Sequenze nucleotidiche di HHV-6 sono state trovate nei linfociti B di pazienti affetti da linfoma a cellule B. Questi importanti risultati indicano chiaramente che HHV-6 possiede non solo una capacità citolitica, ma anche, come l'ebv, un marcato potere trasformante. 5 di 00
6 HHV-6 e Sindrome da Affaticamento Cronico! La sindrome da affaticamento cronico (chronic fatigue syndrome = CFS) è stata descritta quale un insieme di sintomi ben definiti la cui etiologia rimane molto incerta.! Le varie ipotesi etiologiche comprendono quella virale e quella immuno-mediata. Non va dimenticato che infezioni virali possono essere responsabili in primis di eventi immunopatologici.! Vari virus sono stati considerati quali potenziali candidati etiologici: ricordiamo i virus Coxsackie e tra gli Herpes in particolare EBV e, più recentemente, HHV-6. 6 di 00
7 HHV-6: Caratteristiche Biologiche! Oltre il 90% della popolazione generale è sieropositiva all età di 2 anni! Latenza nelle cellule epiteliali delle ghiadole bronchiali e salivari e forse nei macrofagi / monociti 7 di 00
8 HHV-6: Caratteristiche Biologiche! Agente eziologico della sesta malattia (exanthema subitum).! Il 60% delle infezioni in Giappone e solo il 20% negli USA sono sintomatiche! 90% delle cellule CD4 sono infettate durante l infezione acuta 8 di 00
9 HHV-6: Caratteristiche Biologiche! La cellula bersaglio è (come per HIV) i linfociti T CD4+: ma la molecola CD4 non è il recettore! Compromissione dell immunità cellulo mediata mediante:! Inibizione della risposta proliferativa delle cellule T! Inibizione di IL-2, TNF e INF-alfa 9 di 00
10 Trasmissione di HHV-6 10 di 00
11 HHV-6! L'HHV-6 appartiene alla famiglia delle Herpesviridae ed è strettamente imparentato con il Cytomegalovirus (CMV). Questi virus hanno delle proprietà strutturali e biologiche comuni (genoma kpb e composizione % di G+C).! Recentemente è stato proposto di suddividere i numerosi ceppi di HHV-6 in due sottogruppi denominati A e B sulla base delle loro proprietà antigeniche, dell'eterogeneità genetica e delle caratte-ristiche di crescita in vitro.! I ceppi di gruppo A sono più frequentemente isolati da pazienti con AIDS (specialmente africani) e malattie linfoproliferative,! I ceppi di gruppo B sono in causa nelle manifestazioni esantematiche infantili (nel 97% dei casi colpisce, infatti, i bambini). 11 di 00
12 Due Varianti di HHV-6 VARIANTE A! Rara! Soggetti anziani! Isolata da pazienti con HIV! Induce alti livelli di citochine! Più virulento; più soppressivo per le cellule staminali del midollo! Relativamente sensibile all acyclovir VARIANTE B! Comune! Infanzia e adolescenza! Isolata da bambini con esantema subitum! Isolata nella maggior parte dei pazienti trapiantati! Induttore meno potente di citochine! Meno virulento! Resistente all aciclovir 12 di 00
13 HHV-6 Durante l'infezione cellulare l'espressione del genoma virale avviene in una sequenza ben ordinata e precisa: 1. sono inizialmente espressi i geni precocissimi (immediate early: IE) anche in assenza di sintesi delle proteine virali; 2. seguono i geni precoci (delayed early: DE) che codificano per enzimi coinvolti nella sintesi dei DNA virale. 3. Infine i geni tardivi, che codificano per le proteine strutturali sia del capside che del pericapside. 13 di 00
14 HHV-6! Il virus HHV-6 condivide le peculiari proprietà descritte per gli altri Herpes:! diviene latente nelle ghiandole salivari e nelle cellule mononucleate dei sangue provocando infezioni latenti e persistenti.! HHV-6 potrebbe infettare, come EBV, i linfociti B ma recentemente si è dimostrato un quasi esclusivo tropismo per le cellule T ed in particolare per i linfociti CD4+ (che sono anche il bersaglio di HIV) e le cellule dei sistema monocito-macrofagico. 14 di 00
15 MODALITÀ DI TRASMISSIONE ed EPIDEMIOLOGIA! in Giappone e nei paesi anglosassoni la sieropositività è pari al 70% nella popolazione adulta.! L'infezione è contratta precocemente in tenera età, con una prevalenza dei soggetti di sesso maschile in popolazioni al di sotto dei 15 anni;! Metodi più sensibili per la determinazione del titolo anticorpale svelerebbero una positività dei 90% dei soggetti.! Il virus è stato isolato dalla saliva e il DNA è stato dimostrato nelle ghiandole salivali. Si ipotizza che il virus sia trasmesso anche oralmente.! rapido incremento dei positivi nel primo anno di vita: trasmissione dei virus dalla madre al bambino.! Durante la gravidanza: frequente il riscontro di un aumento del titolo anticorpale IgM per HHV-6: riattivazione virale consentita dalla leggera immunodepressione associata alla gravidanza. La riattivazione del virus faciliterebbe la trasmissione al bambino durante il 15 di periodo post-natale. 00
16 Sinergismo tra HHV-6 e HIV! Nel laboratorio di Gallo hanno dimostrato che HHV-6 può agire come cofattore nella genesi e nella progressione dell'infezione da HIV.! Infatti per la nota proprietà di HHV-6 di infettare i linfociti T CD4+ (ove produce un'infezione litica) può verificarsi una duplice infezione che risulta in un'accelerata moltiplicazione del virus dell'alds, con una più precoce morte del linfocita infettato.! È stato proposto un ulteriore meccanismo di cooperazione tra HHV-6 e HIV nell'accelerare la progressione della malattia dimostrando come nei linfociti CD8+ infettati da HHV-6, il virus stimola l'espressione dei recettori CD4, rendendo quindi anche queste cellule sensibili all'aggressione da parte di HIV. 16 di 00
17 DIAGNOSI! PCR e colture linfocitarie sono metodi d indagine microbiologica validi per lo studio dell associazione di HHV-6 con particolari quadri clinici; la ricerca anticorpale, di per se non sufficiente a diagnosticare la fase della malattia, costituisce comunque un iniziale, necessario e valido approccio.! Ricerca anticorpale. La ricerca anticorpale, con i limiti della siero-logia quando applicata a tutti gli Herpersvirus, rappresenta un utile primo approccio al paziente. Gli anticorpi IgG e IgM specifici per HHV-6 possono venire titolati mediante immunofluorescenza indiretta o con metodo immunoenzimatico. 17 di 00
18 DIAGNOSI! Coltura di HHV-6 da linfociti periferici. HHV-6 può infettare varie linee cellulari tra cui i linfociti umani T e B, megacariociti e cellule gliali. I linfociti infettati da HHV-6 mostrano un tipico effetto citopatico oppure acquisiscono la potenzialità di crescita indefinita tipica delle cellule trasformate (virus latente).! Amplificazione (PCR). Si amplifica una breve sequenza di 249 bp oppure l intera sequenza del frammento phc-5, selezionato per possedere sequenze altamente conservate tra i vari isolati clinici di HHV-6. Il metodo ha una notevole sensibilità e identifica i ceppi dei due gruppi A e B. 18 di 00
19 HHV-6 19 di 00
20 Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche HHV-6 e Trapianti Sezione di Microbiologia Dipartimento di Scienze Chirurgiche R Diagnostiche Integrate (DISC)
21 INCIDENZA DELL NFEZIONE DA HHV-6 NEI PAZIENTI TRAPIANTATI GLOBALE 38% (7-32%) FEGATO 24% (7-39%) RENE 50% (33-82%) CUORE 10% MIDOLLO 40% (23-80%) Dati ottenuti da 22 studi effettuati su 850 pazienti trapiantati d organo e 225 di midollo (totale 1105) 21 di 00
22 Tempi di Comparsa delle Riattivazioni di HHV-6 GLOBALE 22 (3-1930) giorni Entro le prime 2 settimane 17/71 23% Entro le prime 4 settimane 42/71 60% Entro le prime 6 settimane 50/71 70% 22 di 00
23 POPOLAZIONI CELLULARI DEL MIDOLLO MODIFICATE DA HHV-6 LEUCOCITI 83% PIASTRINE 67% ERITROCITI 50% 23 di 00
24 Test di Infezioni in Atto (Viremie) da CMV, EBV e HHV-6 in Pazienti Trapiantati di Midollo! Estrazione di DNA da plasma: 8-32 campioni in minuti! Quantificazione di CMV, EBV e HHV-6 (A-B): minuti per virus (max 25 campioni)! Refertazione in < 6,30 ore (minimo 90 minuti) Raccolti 334 campioni di sangue da 68 pazienti in 50 giorni. Eseguito 320 estrazioni di DNA e 600 amplificazioni 42 campioni di plasma positivi per CMV da 12 pazienti, 9 plasmi positivi per EBV da 4 pazienti e 43 campioni positivi per HHV-6 raccolti da 23 pazienti 24 di 00
25 INFEZIONE da CMV, EBV o HHV-6 in PAZIENTI TRAPIANTATI di MIDOLLO N POS NEG DUB NE CMV EBV HHV di 00
26 LightCycler Real Time PCR: Identificazione di HHV-6 DNA! 43 campioni positivi raccolti da 23 pazienti.! Viremia positiva SOLO in uno dei campioni sequenziali studiati nella maggior parte (12) dei pazienti! Viremia positiva in campioni sequenziali (fino a 5) dello stesso paziente:! 5 pazienti avevano da 3 a 5 campioni di plasma, raccolti dall 11 giugno al 30 luglio, positivi per la presenza di HHV-6 DNA! 4 pazienti con viremia persistente da HHV-6 hanno avuto problemi di attecchimento del trapianto e presentavano una marcata piastrinopenia. 26 di 00
27 Infezione da HHV-6 in Trapiantati di Midollo: Significato Clinico della Viremia? DVDe MUD HHV-6 DNA Data Giorni plasma 22 mag 0 Trapianto 11 giu 20 NEG RiAl MUD HHV-6 DNA Data Giorni plasma 15 feb 0 Trapianto 18 giu 27 POS 12 giu 117 NEG 25 giu 34 NEG 2 lug 41 POS 9 lug 48 POS 16 lug 55 POS 23 lug 62 POS 29 lug 68 NEG 19 giu 124 POS 26 giu 131 NEG 10 lug 145 POS 17 lug 152 POS 25 lug 160 POS Gravi problemi di attecchimento Marcata piastrinopenia Marcata piastrinopenia 27 di 00
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