Elettroforesi di Acidi Nucleici

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1 Metodiche Elettroforetiche Gel di agarosio Gel di acrilamide Southern Blot Northern Blot Western Blot Elettroforesi Capillare

2 Elettroforesi di Acidi Nucleici L elettroforesi è definita come la migrazione di particelle sotto l influenza di un campo elettrico. La mobilità della particella dipende dalla forza elettrostatica netta che agisce sulla particella. Nell elettroforesi su gel c è un mezzo di supporto che agisce impedendo disturbi meccanici e di convenzione durante la migrazione e che serve da setaccio molecolare per separare le molecole, provviste della stessa carica, in base alle dimensioni.

3 ELETTROFORESI SU GEL Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA/proteine da una miscela complessa E una tecnica fondamentale per: l l analisi (elettroforesi analitica) la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa)

4 ELETTROFORESI SU GEL Supporto elettivo nei laboratori di biologia molecolare è costituito dal gel, che rispetto agli altri supporti (carta, vetro, liquidi) presenta diversi vantaggi. Infatti: 1) Il gel non contiene cariche in quanto non sono presenti gruppi ionizzanti 2) è possibile avere gel con maglie di grandezza variabile (in base alla concentrazione della matrice da usare), per tale motivo si effettua una separazione non solo in base alla carica ma anche in base al peso molecolare. 3) si possono facilmente recuperare i campioni dopo la separazione elettroforetica. I gel maggiormente utilizzati nei laboratori di biologia molecolare sono costituiti da : - poliacrilamide, (PAGE) (<500bp) - Agarosio (da 500 bp a 20 Kb)

5 ELETTROFORESI SU GEL L'acrilamide e l'agarosio danno origine ad una gelatina che può essere racchiusa tra lastre di vetro, poste in colonne o nel caso dell agarosio stratificato su un supporto orizzontale. Il gel viene preparato in opportuni tamponi : -TBE (Tris Borato EDTA) -TAE (Tris Acetato), identici a quelli posti nella vaschetta elettroforetica, per consentire il passaggio di corrente. Usualmente per la separazione di molecole : - a più basso peso molecolare si usa come supporto del gel l'acrilamide (<500bp) -a più alto peso molecolare si usa come supporto l'agarosio (da 500 bp a 20 Kb) I gel possono essere neutri o denaturanti a seconda che essi permettano la migrazione di doppie o singole eliche. La denaturazione è di solito permessa grazie all'aggiunta di agenti quali la Formamide, Urea ecc.

6 Elettroforesi su gel di agarosio Catodo - Anodo + RNA e DNA sono carichi negativamente

7 Effetto setaccio in un gel uniforme - +

8 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO L agarosio è un polisaccaride estratto dalle alghe, costituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-L-galattosio. L' agarosio è sciolto in opportuno tampone (TBE o TAE) e fatto gelificare su un supporto di vetro o di plastica. Si crea così una matrice gelatinosa le cui maglie permettono la separazione di macromolecole a diverso PM. In linea di massima il range di concentrazione varia tra lo 0,3% - 2%.

9 Il tampone di elettroforesi è una soluzione salina che serve: a condurre la corrente elettrica a controllare il ph durante l elettroforesi T A E T B E Tris, che consente il mantenimento di un valore costante di ph della soluzione A o B sta per acido Borico o Acetico che forniscono l appropriata forza ionica al tampone EDTA, che chela i cationi divalenti, come il magnesio.

10 Preparazione del gel di agarosio pesare la polvere di agarosio Aggiungere il tampone alla polvere di agarosio le quantità di agarosio e di tampone determinano la porosità del gel, quindi si stabiliscono in base al peso molecolare della banda di DNA attesa

11 Potere Risolutivo Agarosio % Agarosio (range in DNA bp)

12 La miscela di agarosio e tampone deve essere portata a C, poichè l agarosio non solubilizza a temperatura ambiente Quando il gel è allo stato liquido ed è raffreddato può essere aggiunto il Bromuro di Etidio

13 Il bromuro di etidio

14 Etidio Bromuro (EtBr): colorante fluorescente assorbe la luce UV a 300 nm dando colore giallo-arancioarancio E utile sia per visualizzare, sia per quantificare il campione: l intensità della fluorescenza è, infatti, proporzionale alla quantità del campione.

15 Preparazione del gel di agarosio pesare la polvere di agarosio Aggiungere il tampone alla polvere di agarosio le quantità di agarosio e di tampone determinano la porosità del gel, quindi si stabiliscono in base al peso molecolare della banda di DNA attesa

16 Come si prepara un gel d agarosio Si scioglie l agarosio in polvere in una soluzione tampone a 100 C Alla soluzione d agarosio si aggiunge Etidio Bromuro (EtBr)

17 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO generatore di corrente 100V 0,2A tampone elettroforetico Polo - Polo + scatola elettroforetica gel di agarosio 1.2% Le apparecchiature per l'elettroforesi possono erogare correnti elevate: quindi vanno manipolate SEMPRE con i cavi scollegati dall'alimentatore.

18 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

19 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

20 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

21 Per frammenti lineari di DNA e/o RNA la distanza di migrazione è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola (ovvero alla sua lunghezza in basi)

22 Conoscendo la distanza di migrazione di frammenti di dimensione nota (M) posso interpolare la lunghezza delle molecole A e B A = 2.5 kb B = 6 kb Dai Geni ai Genomi -EdiSES-

23 Il DNA circolare covalentemente chiuso (cccdna) Plasmide rilassato Supercoiled (superavvolto)

24 Non tutte le molecole di DNA sono lineari (es.: plasmidi batterici) pbr322 plasmide circolare rilassato nick migra più lentamente rispetto ad un DNA lineare o superavvolto della stessa massa plasmide superavvolto Sebbene le due forme abbiano le stesse dimensioni, esse migreranno in maniera differente pbr322 pbr322 dopo digestione plasmide linearizzato

25 Gel preparato male: poco bromuro di etidio

26 Gel migrato male: tagliato?

27 Gel migrato male: pozzetti rotti

28 Che problema c è? PCR o preparazione del gel?

29 ELETTROFORESI IN GEL D ACRILAMIDE Preparing acrylamide gels PAGE Separazione di frammenti minori di 1 kb Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA)

30 GEL D ACRILAMIDE PAGE Il gel è formato dalla polimerizzazione tra acrilamide e bis-acrilamide in presenza di catalizzatori. (TEMED e APS-Ammonio persolfato). La polimerizzazione del gel procede attraverso una reazione a catena. Il TEMED (Tetrametil-etilen-diammina) è attivato ad opera dell' APS (Ammonio Persolfato) che lascia la molecola del TEMED con un elettrone reattivo spaiato. A questo punto il TEMED può reagire con l'acrilamide che viene così attivata. Ad essa si possono legare altre molecole di acrilamide a formare un polimero la cui estremità risulta altamente reattiva. La N metilen-bisacrilamide può reagire con il polimero formato dando luogo ad una matrice ramificata.

31 Avvertenze! L'acrilammide è un potente neurotossico! Utilizzare i guanti e la mascherina durante la preparazione dei reagenti. LAVORARE SEMPRE SOTTO CAPPA!!!

32 STRUTTURA RAMIFICATA DELLA POLIACRILAMIDE

33 Caratteristiche del PAGE Variando la concentrazione di acrilamide e di bisacrilamide si creano nel gel maglie di diversa grandezza: RETE DA PESCA. La concentrazione di acrilamide può variare dal 3% al 20% rispetto al volume totale del gel. II gel possono essere polimerizzati in tubicini di vetro in modo da ottenere cilindretti di acrilamide di piccolissimo spessore (elettroforesi capillare) su cui si può stratificare un singolo campione. Comunemente si usano i cosiddetti gel piatti ottenuti per polimerizzazione del gel tra due lastre di vetro, che consentono il caricamento di più campioni.

34 Preparazione PAGE

35 IMPIEGHI DELLA PAGE Controllo di omogeneità (purificazione di proteine) Caratterizzazione chimico-fisica (det. del PM) Ricerca (e quantificazione) di specifiche proteine Studi di sistemi complessi (membrane, ribosomi, virus) Screening di liquidi fisiologici o tessuti (per variazioni genetiche, patologiche, tassono-miche)

36 Elettroforesi: criteri di separazione PAGE nativa PAGE-SDS densità di carica (pi), dimensioni, (forma) solo dimensioni

37 Trattamento del campione Proteico SDS denatura le proteine (stessa forma a bastoncino ) conferisce la stessa densità di carica (negativa) 2-Mercaptoetanolo HS-CH 2 CH 2 OH 2 2 rompe eventuali ponti disolfuro Temperatura (100 C) accelera la completa denaturazione Blu di Bromofenolo/glicerolo Si aggiungono un colorante per marcare il fronte e un addensante

38 Trattamento con SDS

39 L elettroforesi in presenza di SDS separa proteine secondo la dimensione PAGE-SDS SDS-poliacrilammide gel elettroforesi È la tecnica più usata

40 Concentrazioni di acrilammide e intervalli di pesi molecolari (Dalton) 15 % % % % fino a

41 PAGE-SDS nella valutazione di pesi molecolari di proteine Standard di pesi molecolari Proteine incognite

42 PAGE-SDS e determinazione del peso molecolare di una proteina

43 Vantaggi di PAGE-SDS I complessi proteina-sds sono altamente carichi e tutti negativi (vanno all anodo) Separano in base alla dimensione e rimuovono microeterogeneità SDS solubilizza quasi tutte le proteine (anche idrofobiche) La carica mantiene le proteine in forma allungata (non si riavvolgono) Le bande si fissano e si colorano facilmente

44 PAGE per acidi nucleici: ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI Gli acidi nucleici a singolo filamento (come l RNA) tendono a formare complesse strutture secondarie, pertanto la loro corsa elettroforetica è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano. NB NB L RNA prima di essere separato per elettroforesi deve essere prima denaturato, al fine di mantenere le molecole in forma lineare Agenti denaturanti comunemente usati: calore, formaldeide, formammide, urea

45 Separazione in gel d agarosio di molecole di RNA in condizioni denaturanti 28S (3400 nt) 18S (1800 nt) Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la corsa nel gel, l RNA deve essere denaturato, ossia le molecole devono essere liberate sia da appaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intramolecolari. La denaturazione si ottiene bollendo (90-95 C) il campione e aggiungendo formaldeide al gel. Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poichè contiene formaldeide e formammide.

46 RIASSUMENDO Acido nucleico Agarosio PAGE Condizioni denaturanti dsdna ssdna oligo RNA > 1kb (mrna, rrna ecc.) piccoli RNAs (sirna, mirnas ecc.)

47 Blotting di Acidi Nucleici: Southern e Northern Blot Permettono di studiare: Struttura ed organizzazione del genoma Regolazione dell espressione genica 1. Elettroforesi su gel 2. Trasferimento (blotting) su membrana 3. Ibridazione con una sonda marcata radioattivamente

48 Elettroforesi capillare L elettroforesi capillare (CE) consiste in una famiglia di tecniche di separazione che utilizzano dei capillari in silice fusa per separare sistemi complessi di molecole grandi e piccole. In CE vengono utilizzati alti voltaggi e la separazione è funzione della carica e delle dimensioni molecolari. In dipendenza del tipo di capillare e del mezzo solvente, l elettroforesi capillare può articolarsi in più tipi di tecniche. Effettuare l elettroforesi in un capillare di piccolo diametro permette di utilizzare campi elettrici molto elevati poiché i capillari dissipano efficacemente il calore prodotto. Aumentare il campo elettrico significa avere separazioni molto efficienti e ridurre i tempi di separazione.

49 Elettroforesi capillare il campione (solitamente 5-10µl) viene introdotta dall'estremità anodica di un capillare in silice fusa contenente un tampone appropriato. L introduzione si ha applicando una differenza di pressione fra le estremità del capillare Per la separazione viene applicato una differenza di potenziale tra le due estremità del capillare. Le molecole del campione cominciano quindi a migrare con velocità differenti lungo il capillare, e la migrazione elettroforetica vede lo spostamento dei cationi (+) verso il catodo (-), mentre gli anioni(-) si muovono verso l anodo(+).

50 Capillare Sistema di Rivelazione Sistema di iniezione del campione Generatore di corrente elettrica 1

51 IL CAPILLARE di dimensioni ridotte: diametro 20 e 200 µm, lunghezza cm facilmente ionizzabile (silice fusa) termostatato (potenziale elevato tra 20 e 30 KV effetto Joule) chimicamente ed elettricamente inerte Capillare trasparente agli UV/visibile flessibile, resistente alle trazioni Inserire figura

52 Il flusso elettroendosmotico Benché gli analiti siano separati in base alle diverse velocità di migrazione elettroforetica, essi vengono tutti spinti verso il catodo per il fenomeno dell'elettroosmosi, dovuto alla ionizzazione della silice che costituisce il capillare.

53 Il flusso elettroendosmotico Le pareti del capillare sono infatti rivestite di gruppi silanolici acidi, che a ph>3 saranno ionizzati negativamente: tali gruppi attirano i cationi del tampone, e questi, concentrandosi alla periferia del capillare attirano l acqua del tampone per osmosi. I cationi che si trovano vicino alla I cationi che si trovano vicino alla parete però hanno un elevata mobilità, e migrando verso il catodo formando un cosiddetto flusso elettroendosmotico la cui velocità è molto più elevata della velocità di migrazione degli analiti, così tutti gli ioni, indipendentemente dalla loro carica, si spostano verso il catodo.

54 A causa del flusso elettroendosmotico, tutti i componenti del campione migrano verso l elettrodo negativo. I capillari possono anche essere riempiti di un gel che elimina il flusso elettroendosmotico. In questo caso la separazione avviene come una elettroforesi convenzionale, ma la risoluzione è più alta, la sensibilità è maggiore e si può utilizzare un rivelatore posto in serie al capillare.

55 ELETTROFORESI CAPILLARE SU GEL (CGE) La separazione si ottiene usando un capillare riempito con una matrice gel, p.es. poliacrilammide reticolata o agarosio; questo permette di separare soluti che hanno un rapporto carica/massa simile, ma diverse dimensioni. Per questo motivo questa tecnica è molto utilizzata per separare macromolecole biologiche.

56 Electrokinetic Injection & Electrophoresis Capillary and electrode are placed into the sample Voltage is applied Charged DNA enters in the capillary and it migrates toward the electrode

57 Fluorescence Excitation & Detection DNA fragments labeled with one of up to five different dyes electrophorese past the laser Laser excites dyes causing them to emit light at wavelengths longer than that of the laser Emitted light is collected by a CCD camera Software converts pattern of emissions into coloured peaks

58 Dal cycle sequencing all elettroforetogramma... Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all intensità di emissione.

59 Size marker CF patient: G1244E/dele CF patient: F508del/F508del 23/23 Healthy subject 18/18

60 Size marker 1 CF patient: G1244E/dele2 19/19 2 CF patient: F508del/F508del 18/18 3 Healthy subject 18/19 bp

61 Tipi di molecole separabili con CE amminoacidi peptidi proteine acidi nucleici ioni inorganici acidi e basi organiche intere cellule

62 Vantaggi alta efficienza di separazione piccola quantità di campione (1-10 µl) separazione rapida (da 1 a 45 min) selettività automazione possibilità di quantificazione riproducibilità

63 Applicazioni della PAGE Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) CHEMICAL CLEVAGE MISMATCH (CCM) PROTEIN TRUNCATION TEST (PTT)

64 SSCP

65 SSCP Questo metodo sfrutta la proprietà di migrazione del DNA a singola elica in gel di acrilamide NON DENATURANTE in base alla sua composizione nucletidica. Se due frammenti di DNA differiscono per una singola base migreranno in modo differente ed il frammento mutato sarà identificabile per una diversa velocità di migrazione. Questa tecnica si applica a prodotti di PCR resi a singola elica. I frammenti sono visualizzati su gel non denaturante per autoradiografia, se marcati con isotopi radioattivi, o mediante colorazione con nitrato d'argento.

66 DGGE Il metodo DGGE è una tecnica elettroforetica per la separazione di frammenti di DNA in base alle loro differenti proprietà di dissociazione o melting. Il DNA amplificato, wild type e mutante, è frazionato attraverso un gradiente denaturante: Chimico (urea and formamide ) Temperatura (TGGE) Quando i due filamenti iniziano a dissociarsi si ha una riduzione della velocità di migrazione rispetto alla molecola di DNAds. La presenza di mutazioni, modifica la proprietà di melting del DNA amplificato rispetto a quello wild type. Questi due tipi di molecole si dissoceranno quindi in punti diversi del gradiente denaturante e saranno distinguibili in base alla diversa migrazione elettroforetica, se caricati l uno accanto all altro su gel DGGE.

67 DGGE Soluzione urea/formamide Più Concentrata Soluzione urea/formamide Più Concentrata

68 CCM La metodica si basa sulla determinazione della presenza di mismatch (bolla dell eteroduplex) che inducono la rottura del DNA mediante agenti chimici (CCM). Fondamentale è l induzione dell eteroduplex nel prodotto di PCR: il prodotto di PCR è mescolato con un prodotto di PCR di controllo wt. L analisi CCM implica l utilizzo di due reagenti chimici che riconoscono e modificano le basi pirimidiniche non appaiate: Hydroxylamine (NH 2 OH) modifica la citosina (C) in mismatch attraverso la formazione di addotti attraverso il doppio legame del carbonio in posizione 5,6. Potassium permanganate (KMnO 4 ) modifica I residui di Timidina (T) in mismatch attraverso l ossidazione del doppio legame del carbonio 5,6. Entrambe le modifiche hanno come effetto l apertura dell anello pirimidinico: esponendolo alla beta-eliminazione indotta dalla piperidina che taglia lo scheletro di zucchero-fosfato del DNA nel sito di modifica.

69 CCM (CHEMICAL CLEVAGE MISMATCH)

70 CCM Analisi

71 PROTEIN TRUNCATION TEST (PTT) Questa tecnica è finalizzata ad evidenziare mutazioni responsabili della formazione di codoni di stop e quindi della sintesi di proteine tronche. La metodica prevede la trasformazione ed amplificazione in cdna dell RNA del gene in esame mediante RT-PCR. Questo amplificato viene quindi trascritto in RNA messaggero mediante il sistema della T7 RNA polimerasi e quindi utilizzato per la sintesi in vitro della proteina. La dimensione della proteina prodotta potrà essere verificata con elettroforesi su gel di SDS- poliacrilamide. Il PTT è efficiente per prodotti di amplificazione fino a 5Kb ed è particolarmente indicato per patologie in cui sono particolarmente frequenti mutazioni che generano codoni di stop prematuri quali la distrofia muscolare di Duchenne e la sclerosi tuberosa. Metodica molto indaginosa per la fase di sintesi in vitro della proteina.

72 Fasi della metodica PTT Retrotrascrizione del mrna in cdna. Amplificazione del cdna utilizzando un primer forward che include un promotore T7, un iniziatore della traduzione eucariotica con un codone ATG e una sequenza gene-specifica 3 disegneta in modo che la sequenza risulti in frame dall ATG. Si aggiunge un sistema di traduzione in vitro, in modo da produrre un polipettide che sarà valutato per il PM in un gel SDS-PAGE.

73 PROTEIN TRUNCATION TEST SDS-PAGE Gel Ex58-68 Wt Ex58-68 Mut Ex67-69 Mut Ex67-69 Wt exons give normal (47 kda) exons give normal (48 kda) Paz# 1 Paz# 2