TEST PER LA VALUTAZIONE DEI FARMACI ANTIINFIAMMATORI

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1 TEST PER LA VALUTAZIONE DEI FARMACI ANTIINFIAMMATORI

2 GLUCOCORTICOIDI FARMACI ANTIINFIAMMATORI FANS (farmaci antiinfiammatori non steroidei) altri farmaci utilizzati nella terapia delle malattie infiammatorie comprendono i composti dell oro utilizzati per trattare l artrite reumatoide resistente ai FANS, i farmaci usati nella terapia della gotta e i farmaci attivi sulla sintesi dei leucotrieni

3 BIOSINTESI DEGLI EICOSANOIDI leucotrieni non sono sensibili ai FANS lipoossigenasi acido arachidonico fosfolipasi (A 2, C, D) acidi grassi di membrana cicloossigenasi 1 (COX1) o PGHS-1 cicloossigenasi 2 (COX2) o PGHS-2 X X prostaglandine trombossano sintasi (TX-sintasi) trombossani glucocorticoidi FANS

4 BIOSINTESI DEGLI EICOSANOIDI prostaglandine e trombossani leucotrieni

5 FUNZIONI BIOLOGICHE DEGLI EICOSANOIDI quando si considerano le funzioni biologiche degli eicosanoidi occorre tenere presente che: le COX sono essenzialmente ubiquitarie, ma la COX-1 è costitutiva e la COX-2 è inducibile gli effetti degli eicosanoidi possono variare da organo a organo

6 INFIAMMAZIONE: liberazione di mediatori quali istamina, serotonina, bradichinina ed altri STIMOLI FISICI: traumi, ischemia, etc. Biosintesi PG STIMOLI FARMACOLOGICI attivi in qualche maniera sulla cascata dell acido arachidonico X AGENTI INFETTIVI es: lipopolisaccaride FARMACI ANTIINFIAMMATORI

7 GLUCOCORTICOIDI FARMACI ANTIINFIAMMATORI azione a monte FANS (farmaci antiinfiammatori non steroidei) azione a valle la differenza fondamentale nel meccanismo d azione di FANS e glucocorticoidi si traduce in una diversa severità dei loro effetti collaterali

8 DIFFERENZE NELLA CINETICA DI AZIONE DEI FANS l acido acetilsalicilico è l unico FANS che presenta un meccanismo di inibizione delle COX irreversibile

9 EFFETTI DEI FARMACI ANTIINFIAMMATORI TERAPEUTICI Antinfiammatori Antidolorifici Antipiretici COLLATERALI Antiaggreganti/anticoagulanti cardioaspirina Ulcerogeni su mucosa gastrica

10 EFFETTI DEI FARMACI ANTIINFIAMMATORI è importante sottolineare che gli effetti dei vari farmaci, sebbene presentino dei tratti comuni, possono variare a seconda delle molecole considerate il paracetamolo è l unico FANS dotato di attività antiinfiammatoria trascurabile

11 DIPENDENZA DEGLI EFFETTI COLLATERALI DEI FANS DALLE ISOFORME DI COX un farmaco attivo sulle COX-2 appare più desiderabile di uno che agisce sulle COX-1 (o su entrambe le isoforme dell enzima TUTTAVIA alcuni farmaci attivi sulle COX-2 (Rofecoxib, o Vioxx) sono stati ritirati dal mercato perché mostravano evidenti effetti di cardiotossicità

12 VALUTAZIONE DELL EFFETTO ANTIINFIAMMATORIO E ANALGESICO

13 INFIAMMAZIONE Sintomi Alterazioni morfologiche Alterazioni biochimiche Rossore Calore Dolore Tumescenza Lesione Modificazioni dei vasi Essudazione Migrazione di cellule Proliferazione Necrosi Attivazione dei mediatori ed enzimi (istamina,5ht,pg) Denaturazione proteica Alterazioni metaboliche l infiammazione è in genere descritta dalla triade: rubor, tumor, dolor

14 MODELLI ACUTI MODELLI DI INFIAMMAZIONE MODELLI CRONICI

15 MODELLI DI INFIAMMAZIONE ACUTA Esposizione a raggi UV ( 20 sec) modelli di eritema e ipertermia modelli di edema e aumentata permeabilità vascolare Applicazione cutanea irritanti (estere furfurilico, acido nicotinico, acido retinoico, raggi X) Iniezione sottocute di pro-infiammatori (tubercolina, lipopolisaccaridi, lievito di birra 20%, carragenina 1%) Induzione di pomfi per iniezione di irritanti nel coniglio Iniezione di irritanti in aponeurosi plantare di ratto (formalina, destrano, albume uovo, caolino) Pleurite sperimentale nel ratto

16 MODELLI DI ERITEMA E IPERTERMIA CUTANEA coniglio (preferito) o ratto depilazione dell addome 24h somministrazione dell antiinfiammatorio 1h applicazione dell irritante e valutazione la valutazione in genere impiega una scala che valuta l intensità dell irritazione e va da 0 (minimo) a 1 (massimo)

17 potenza antiinfiammatoria MODELLI DI ERITEMA E IPERTERMIA CUTANEA: EFFICACIA DI VARI ANTIINFIAMMATORI SULL ERITEMA INDOTTO DA RAGGI U.V. farmaco I.C. 50 (mg/kg)

18 MODELLI DI EDEMA E AUMENTATA PERMEABILITA VASCOLARE coniglio depilazione dell addome 24 h somministrazione dell antiinfiammatorio 1 h iniezione dell irritante 10 min iniezione e.v. del colorante Tripan Blu valutazione la valutazione considera il grado di colorazione e il tempo di comparsa/scomparsa dei pomfi

19 MODELLI DI EDEMA E AUMENTATA PERMEABILITA VASCOLARE VASODILATAZIONE iniezione sottocutanea di agente irritante aumentato afflusso di sangue e colorazione uniforme EDEMA colorazione a cerchio intorno a un area più chiara

20 MODELLI DI EDEMA E AUMENTATA PERMEABILITA VASCOLARE ratto somministrazione del farmaco antiinfiammatorio 1 h iniezione dell irritante nell aponeurosi plantare di una zampa misurazione dell aumento del volume della zampa iniettata la misurazione può essere fatta a tempi variabili dall iniezione, per avere un dato che rispecchi l andamento temporale degli effetti del farmaco

21 Pletismografo di Lence misura l aumento di volume di una zampa edematosa

22 zampa ratto FUNZIONAMENTO DEL PLETISMOGRAFO DI LENCE mercurio H2O l aumento del volume della zampa provoca uno spostamento del liquido, la cui entità sarà ricavabile dalla scala graduata. Maggiore sarà l effetto antiinfiammatorio, minore sarà l edema e minore sarà il volume di acqua spostato

23 Analgesimetro di Randall e Selitto misura dolore associato all edema il scala graduata terminate con un peso appuntito che insiste sulla zampa del ratto

24 MISURA DELL ANALGESIA CON IL METODO DI RANDALL E SELITTO effetto analgesico dell acido acetilsalicilico l incremento della potenza antiinfiammatoria è associata a un aumento del peso applicato che il ratto è in grado di sopportare

25 DIVERSA EFFICACIA DI FARMACI ANTIINFIAMMATORI SULL EDEMA SPERIMENTALE PRODOTTI BENZIDAMINA FENILBUTAZONE INDOMETACINA CORTISONE EDEMA DA: Carragenina Lievito di birra Formalina Serotonina la scelta della sostanza utilizzata per indurre l edema deve essere valutata anche sulla base del tipo di farmaco che si sta valutando

26 ALTRI TEST DI ANALGESIA UTILIZZABILI PER I FARMACI ANTIINFIAMMATORI Contorcimento dopo CH 3 COOH (1%) [writhing test] Formalina (5%) nella zampa

27 MODELLO DELLA PLEURITE SPERIMENTALE NEL RATTO Iniezione nello spazio pleurico di 5 ml di sospensione di carragenina (0.025%) in fisiologica + colorante blue di Evans (0.075 % in NaCl) in vena giugulare 7 h Anestesia con cloroformio e raccolta di liquido pleurico. Il liquido raccolto si fa incubare in formamide e si quantifica il colorante nell estratto a 620 nm con densitometro ottico. il test si basa sul fatto che con l aumento dell essudato pleurico il colorante avrà un maggiore volume di liquido in cui distribuirsi, e quindi il segnale spettrofotometrico sarà meno intenso gli antiinfiammatori contrastano questo effetto

28 MODELLI DI INFIAMMAZIONE CRONICA Granuloma indotto da cotton pellet Artrite da adiuvante di Freund riproduce una condizione simile all artrite reumatoide umana

29 MODELLO DEL GRANULOMA DA COTTON PELLET ratto taglio dell addome e introduzione di cotton pellets sterili sotto ciascuna ascella e bilateralmente a livello dell inguine 7 giorni sacrificio dell animale e rimozione dei granulomi essiccamento dei granulomi in stufa e valutazione del loro peso

30 MODELLO DEL GRANULOMA DA COTTON PELLET il trattamento con antiinfiammatori è associato a una riduzione del peso dei granulomi

31 MODELLO DELL ARTRITE INDOTTA DA ADIVUANTE DI FREUND 0,05 ml sospensione in cuscinetto plantare muramilpeptide, estratto dalla parete di micobatteri uccisi l incorporazione nell adiuvante di Freund rende immunogeniche basse dosi di antigene che altrimenti non avrebbero effetto l adiuvante si inietta in una zampa posteriore dando luogo a lesioni locali, che si diffondono progressivamente a tutto il corpo

32 MODELLO DELL ARTRITE INDOTTA DA ADIVUANTE DI FREUND progressione il trattamento con antiinfiammatori attenua i sintomi provocati dall adiuvante di Freund

33 ANALOGIE TRA L ARTITE DA ADIUVANTE DI FREUND E ALCUNE FORME ARTRITICHE UMANE

34

35 VALUTAZIONE DELL EFFETTO ANTIPIRETICO

36 MECCANISMO DELLA FEBBRE batteri virus tumori danni ai tessuti attivazione dei mediatori dell infiammazione FEBBRE sintesi di agenti pirogeni endogeni (IL1, TNF) azione sul centro termoregolatore dell ipotalamo camp, PG sensibilie agli antiinfiammatori

37 MECCANISMO DELLA FEBBRE

38 MODELLI PER LO STUDIO DELL ATTIVITA ANTIPIRETICA Ipertermia da lipopolisaccaridi di Escherichia coli Ipertermia da somministrazione lievito di birra

39 IPERTERMIA DA ESCHERICHIA COLI coniglio somministrazione in vena marginale di 0.03 cc/kg di E. coli attenuata con formalina misurazione rettale della temperatura ripetuta per 6h consecutive gli antiinfiammatori attenuano l innalzamento della temperatura causato dal pirogeno

40 IPERTERMIA DA LIEVITO DI BIRRA ratto somministrazione s.c. di una sospensione di lievito di birra 15% in gomma arabica al 2% (1ml/100 mg) 14h misurazione rettale della temperatura lo schema di misurazione della temperatura prevede in genere: -misurazione prima dell antiinfiammatorio -misurazione 30 minuti dopo l antiinfiammatorio -misurazione 1h30 minuti dopo l antiinfiammatorio -misurazione 3h dopo l antiinfiammatorio -misurazione 5h dopo l antiinfiammatorio gli antiinfiammatori attenuano l innalzamento della temperatura causato dal lievito di birra

41 REGOLAZIONE DELLA TEMPERATURA CORPOREA sudorazione gli antiinfiammatori possono far aumentare la sudorazione (es: paracetamolo) PERDITA DI CALORE CORPOREO respirazione gli antiinfiammatori possono far aumentare la frequenza respiratoria (tipico effetto dei salicilati) urine e feci questi effetti si combinano naturalmente con un effetto diretto a livello del centro regolatore della temperatura corporea

42 EFFETTO DELL ASPIRINA SULLE DINAMICHE DI PRODUZIONE E DISSIPAZIONE DEL CALORE CORPOREO in un soggetto con la febbre, l aspirina aumenta la dissipazione del calore corporeo e porta a una diminuzione della temperatura in un soggetto con una temperatura corporea normale, l aspirina non ha effetti significativi sulla dissipazione del calore

43 VALUTAZIONE DELL EFFETTO SULLA COAGULAZIONE DEL SANGUE

44 COAGULAZIONE DEL SANGUE PIASTRINE ADESIONE A SUPERFICI ESTRANEE MODIFICAZIONI MORFOLOGICHE DELLE PIASTRINE AGGREGAZIONE SECREZIONE DI MATERIALI ENDOPIASTRINICI

45 COAGULAZIONE DEL SANGUE IL SAGGIO SI ESEGUE SUL SANGUE PRELEVATO DA UN ANIMALE CONIGLIO vena marginale dell orecchio vena giugulare arteria carotide RATTO decapitazione prelievo dal cuore

46 PROCEDURE DI PRELIEVO DEL SANGUE la procedura impiegata dipende sia dalla quantità di sangue necessaria, sia dal fatto che i prelievi siano o meno ripetuti nel tempo

47 PROCEDURE DI PRELIEVO DEL SANGUE prelievo dalla vena marginale dell orecchio di coniglio piccole quantità

48 PROCEDURE DI PRELIEVO DEL SANGUE prelievo dal seno orbitale di topo piccole quantità

49 PROCEDURE DI PRELIEVO DEL SANGUE prelievo dal seno orbitale di ratto piccole quantità

50 PROCEDURE DI PRELIEVO DEL SANGUE prelievo dal cuore di ratto prelievi ripetuti

51 PROCEDURE DI PRELIEVO DEL SANGUE prelievo dal cuore di cavia prelievi ripetuti

52 PROCEDURE DI PRELIEVO DEL SANGUE prelievo per incannulazione della vena femorale di ratto prelievi ripetuti

53 PROCEDURE DI PRELIEVO DEL SANGUE prelievo per incannulazione della vena femorale di ratto prelievi ripetuti

54 TRATTAMENTO DEL SANGUE

55 TRATTAMENTO DEL SANGUE SANGUE CENTRIFUGAZIONE SUPERNATANTE PRECIPITATO seconda centrifugazione PLASMA RICCO IN PIASTRINE (PRP) PLASMA POVERO IN PIASTRINE (PPP)

56 VALUTAZIONE DELL AGGREGAZIONE PIASTRINICA PRP = 0% PPP = 100% onda primaria: legame tra fibrinogeno e piastrine attivate onda secondaria: liberazione del contenuto delle piastrine angolo di salita dell onda: velocità di aggregazione

57 PRINCIPALI AGENTI AGGREGANTI TROMBINA innalza i livelli di Ca 2+ ACIDO ARACHIDONICO stimola la sintesi di trombossano ADP stimola la sintesi di acido arachidonico COLLAGENE può agire sia su Ca 2+ che su acido arachidonico RISTOCETINA ADRENALINA PAF ANALOGHI ENDOPEROSSIDICI IONOFORI DEL CALCIO SEROTONINA il PRP proveniente da animali trattati con antiinfiammatori sarà meno suscettibile alla coagulazione di quello proveniente da animali non trattati

58 VALUTAZIONE DELL EFFETTO ULCEROGENO SULLA MUCOSA GASTRICA

59 EICOSANOIDI E MUCOSA GASTRICA regola la produzione del rivestimento mucoso dello stomaco

60 ULCEROGENESI INDOTTA DA ANTIINFIAMMATORI ratto digiuno 24h trattamento con composti ulcerogeni di riferimento fenilbutazone 200 mg/kg per os prelievo stomaco (5h) reserpina 5 mg/kg i.p. prelievo stomaco (18h) aspirina 300 mg/kg per os prelievo stomaco (5h) il farmaco valutato deve avere un potere ulcerogeno inferiore a quello dei composti di riferimento

61 ULCEROGENESI INDOTTA DA ANTIINFIAMMATORI scala di valutazione delle ulcere 0 = nessuna lesione 1 = lesione < 1mm 2 = lesione < 5mm 3 = lesione > 5mm

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