Ruolo dei linfociti T regolatori nelle malattie linfoproliferative
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- Giustina Federici
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1 Ruolo dei linfociti T regolatori nelle malattie linfoproliferative MYRIAM FOGLIETTA Laboratorio di Ematologia Oncologica CeRMS, Torino IL RUOLO DEI LINFOCITI T REGOLATORI (TREGS) NELLA PATOGENESI E NELLA TERAPIA DELLE MALATTIE EMATOLOGICHE E NEI TRAPIANTI SIES - Discutiamone insieme 20 Novembre 2014
2 INTERAZIONI TUMORE OSPITE NEI TUMORI SOLIDI V 9V 2 T cell TUMOR GROWTH Tumor cell Natural killer cell TGFβ, IDO Suppression of innate response CCL22 Treg cell Proliferation Dendritic cell TGFβ, IDO, Suboptimal presentation Recruitment Conversion Naïve T cell Tumor associated Tregs cells Suppression of adaptive response Priming phase CD8 T cell Tumor associated macrophage Induction of a tolerogenic phenotype in myelo-monocytes CD4 T cell Effector phase Myeloid derived suppressor cell Adapted from Colombo M, Piconese S. Nature Reviews 2007,7:
3 Deplezione - Chemioterapia metronomica (CTX) Trafficking - mabs anti-ccr4, anti-cxcr4 - mabs anti-cd25 ± immunotossine Inibizione funzionale - mabs neutralizzanti anti-ctla4 - mabs agonisti anti-gitr, anti OX-40 Plasticita T cellulare - Inibizione di IDO - Inibizione di TGFβ - agenti agonisti dei TLRs
4 TREGS NELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE Deplezione delle cellule Tregs vaccini Induzione di risposte tumore-specifiche piu potenti; Regressione del linfoma; Dati quantitativi e funzionali discordanti Espressione del CD25; Marcatura singola per Foxp3 in IHC; Studi correlativi, retrospettivi, in pazienti sottoposti a trattamenti eterogenei;
5 Farinha P et al. Blood 2010; 115:
6 Farinha P et al. Blood 2010; 115:
7 ORIGINE CELLULARE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE VDJ recombination B cell precursor Somatic Hypermutation Class Switching ALL Adapted from Küppers R, Nat Rev Cancer 2005 Apr;5(4):251-62
8 TREGS E IMMUNITA UMORALE Wing J B, and Sakaguchi S Int. Immunol. 2014;26:61-69
9 ATTIVITA CITOTOSSICA DELLE CELLULE TREGS Lindqvist CA et al, Immunology 2011 Jul;133(3):
10 INTERAZIONI TUMORE OSPITE NELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE V 9V 2 T cell Tumor B cell TUMOR GROWTH? Natural killer cell TGFβ, IDO Suppression of innate response CCL22 Treg cell Proliferation Dendritic cell TGFβ, IDO, Suboptimal presentation Recruitment Conversion Naïve T cell Tumor associated Tregs cells Suppression of adaptive response Priming phase CD8 T cell Tumor associated macrophage Induction of a tolerogenic phenotype in myelo-monocytes CD4 T cell Effector phase Myeloid derived suppressor cell Adapted from Colombo M, Piconese S. Nature Reviews 2007,7:
11 ORIGINE CELLULARE DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE VDJ recombination B cell precursor Somatic Hypermutation Class Switching ALL Adapted from Küppers R, Nat Rev Cancer 2005 Apr;5(4):251-62
12 SCOPO DEL LAVORO 1) Nel linfoma follicolare i linfociti Tregs si riducono in numero dopo induzione della remissione clinica? 2) Effetto dei Tregs sulle cellule T effettrici autologhe tumore-specifiche?
13 TREGS NEL LINFOMA FOLLICOLARE ALLA DIAGNOSI E IN REMISSIONE Voo and Foglietta, et al Int J Cancer 135, 2846, 2014
14 I TREGS INTRATUMORALI HANNO FENOTIPO ATTIVATO Voo and Foglietta, et al Int J Cancer 135, 2846, 2014
15 GENERAZIONE DI CLONI T LINFOMA-SPECIFICI Generazione di linee T cellulari tumore specifiche mediante 3-4 cicli di stimolazione (ogni 10 gg) in vitro con cellule tumorali autologhe attivate con CD40-L Determinazione della diversita del TCR di ciascuna linea T cellulare mediante colorazione con un panello di Mo Abs anti-tcrbv Colorazione delle linee T con CFSE e stimolazione con cellule tumorali autologhe attivate con CD40-L FACS sorting delle cellule T proliferanti dalla famiglia TCRBV di Interesse dopo colorazione con l appropriato MoAbs Determinazione della clonalita delle cellule T Lee S et al. J Immunol Methods 2008
16 I TREGS INTRATUMORALI SOPPRIMONO LA FUNZIONE DEI LINFOCITI T AUTOLOGHI TUMORE-SPECIFICI Voo and Foglietta, et al Int J Cancer 135, 2846, 2014
17 CD4 Tregs del sangue periferico di pazienti con FL sopprimono la proliferazione di linfociti autologhi antitumorali CD4 CD25 - CD4 CD25 - acd3acd28 CD4 CD25 - acd3acd28 Tregs CFSE Voo and Foglietta, et al Int J Cancer 135, 2846, 2014
18 TREGS E OUTCOME CLINICO: chemioterapia standard PACE: Prednisone, Doxorubicina, Ciclofosfamide, Etoposide* *Schuster SJ et al. J Clin Oncol 2011;29: Voo and Foglietta, et al Int J Cancer 135, 2846, 2014
19 TREGS E OUTCOME CLINICO: immunoterapia in pazienti recidivati/refrattari anti-cd20 anti-pd1: Rituximab Pidilizumab* * Westin J et al. Lancet Oncol 2014; 15:69-77 Voo and Foglietta, et al Int J Cancer 135, 2846, 2014
20 TOLL LIKE RECEPTOR SIGNALLING
21 IDENTIFICAZIONE DI AGONISTI DEI TLR CHE BLOCCHINO LA FUNZIONE DI TREGS DI PAZIENTI CON FL Voo and Foglietta, et al Int J Cancer 135, 2846, 2014
22 % Effector T cell proliferation SINERGIA TRA AGONISTI DEI TLRs TLRLs (2 concentrations) CD4 alone CD4 Tregs CD4 Tregs TLRLs CpG-B (2.5 mm) Flagellin (5 mg/ml) Pam 3 CSK4 (20 ng/ml) Pam 3 CSK4 CpG-B Pam 3 CSK4 Flagellin CpG-B Flagellin Voo and Foglietta, et al Int J Cancer 135, 2846, 2014
23 OX40 SIGNALLING E IMMUNITA ANTITUMORALE OX40 triggering blocks suppression by regulatory T cells and facilitates tumor rejection. Piconese S et al. J Exp Med 2008 Apr 14;205(4): OX40 ligand shuts down IL-10-producing regulatory T cells. Ito T et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: Cutting edge: OX40 inhibits TGF-beta- and antigen-driven conversion of naive CD4 T cells into CD25Foxp3 T cells. So T et al. J Immunol 2007; 179: OX40 engagement and chemotherapy combination provides potent antitumor immunity with concomitant regulatory T cell apoptosis. Hirschhorn-Cymerman D et al. J Exp Med 2009; 206: OX40 agonist therapy enhances CD8 infiltration and decreases immune suppression in the tumor. Gough MJ et al. Cancer Res 2008; 68:
24 TREGS DI FL ESPRIMONO OX40 Voo and Foglietta, et al Int J Cancer 135, 2846, 2014
25 IL TRIGGERING DI OX40 ROMPE LA TOLLERANZA TREGS MEDIATA CD4 CD25 - T cells autologous Tumor cells L-cell Medium Effector cells Tregs CD4CD25- T cell alone L-cell /OX40L CFSE CFSE Voo and Foglietta, et al Int J Cancer 135, 2846, 2014
26 C.P.M. (10 3 ) IFN- (Pg/ml) C.P.M. (10 3 ) SINERGIA DEI SEGNALI MEDIATI DA OX40 E TLRs 100 CD4 CD4 120 CD rhox40l (ng/ml) rhox40l (ng/ml) rhox40l (ng/ml) Medium Pam 3 CSK4 Flagellin CpGA CpG-B Voo and Foglietta, Int J Cancer 135, 2846, 2014
27 % CD4 T cell Proliferation SINERGIA DEI SEGNALI MEDIATI DA OX40 E TLRs CD4 Tregs CD4 Tregs CD4 Tregs TLRLs Pam 3 CSK4 Flagellin CpG-A CpG-B rhox40l (ng/ml) Voo and Foglietta, Int J Cancer 135, 2846, 2014
28 >2500 pg/ml PAM 3 CSK4, FLAGELLINA, E CPG S NON INDUCONO PRODUZIONE DI IL-10 DA PARTE DELLE APC FL-APC PBMCs mdcs pdcs Medium Flagellin 1.0 mg Flagellin 0.5 mg Flagellin 0.2 mg Flagellin 0.05 mg Pam 3 CSK4 1.0 mg Pam 3 CSK4 0.5 mg Pam 3 CSK4 0.2 mg Pam 3 CSK mg IL-10 (Pg/ml) Medium CpG-B 2.5 mm CpG-B 1.0 mm CpG-C 2.5 mm CpG-C 1.0 mm CpG-A 2.5 mm CpG-A 1.0 mm Flagellin 1.0 mg Flagellin 0.1 mg Pam 3 CSK4 1.0 mg Pam 3 CSK4 0.1 mg LPS 2.5 mg LPS 1.0 mg IL-10 (Pg/ml) Medium CpG-B 2.5 mm CpG-B 1.0 mm CpG-C 2.5 mm CpG-C 1.0 mm CpG-A 2.5 mm CpG-A 1.0 mm Flagellin 1.0 mg Flagellin 0.1 mg Pam 3 CSK4 1.0 mg Pam 3 CSK4 0.1 mg LPS 2.5 mg LPS 1.0 mg IL-10 (Pg/ml) Medium CpG-B 2.5 mm CpG-B 1.0 mm CpG-C 2.5 mm CpG-C 1.0 mm CpG-A 2.5 mm CpG-A 1.0 mm Flagellin 1.0 mg Flagellin 0.1 mg Pam 3 CSK4 1.0 mg Pam 3 CSK4 0.1 mg LPS 2.5 mg LPS 1.0 mg IFNa (Pg/ml) Voo and Foglietta, Int J Cancer 135, 2846, 2014
29 CONCLUSIONI 1 Tregs sono aumentati nel sangue periferico di pazienti con linfoma follicolare alla diagnosi e persistono dopo l induzione della remissione clinica Elevati livelli di Tregs circolanti pre-terapia sono associati a ridotto PFS in pazienti trattati con chemioterapia convenzionale o immunoterapia con anti- CD20 (Rituximab) e anti-pd1 (Pidilizumab) Entrambi Tregs intratumorali e periferici sopprimono potentemente la funzione effettrice di linfociti T autologhi tumore-specifici
30 CONCLUSIONI 1 Tuttavia gli effetti immunosoppressivi dei Tregs nel linfoma follicolare possono essere revertiti mediante agenti agonisti dei TLR1/2, TLR5, TLR9 e agonisti OX40-L Agenti che attivano TLR1/2, TLR5, TLR9 e/o anticorpi anti-ox40 possono essere usati come adiuvanti per migliorare l efficacia di vaccini terapeutici anti-linfoma
31 SCOPO DEL LAVORO 1) Frequenza e funzione reali dei linfociti Tregs nel midollo osseo nei pazienti con mieloma?
32 GATING STRATEGY
33 TREGS MIDOLLARI NEL MIELOMA Foglietta M et al, Hematologica 2014;99 (10)
34 Foxp3 cells #/HPF TREGS MIDOLLARI NEL MIELOMA E TUMOR BURDEN 3 2 n=10 n=2 1 n=11 0 I D ID Pattern of myeloma cells infiltration CD138 CD3 Foxp3 Foxp3 MM1 BM (control) CD138 CD3 Foxp3 Foxp3 MM2 tonsil
35 REPERTORIO TCR DEI TREGS NEL MM TCRBV subfamilies (set 1) BM PB PB CD4CD25 CD4CD25- CD8 PBMC TCRBV subfamilies (set 2) CD4CD CD8 CD4CD25- PBMC TCRBV subfamilies (set 3) CD4CD25 CD8 CD4CD25- PBMC TCRBV subfamilies (set 4) CD4CD25 CD8 CD4CD25- PBMC TCRBV subfamilies (set 5) CD4CD25 CD8 CD4CD25- CDR3 length distribution (bp) PBMC Foglietta M et al, Hematologica 2014;99 (10)
36 Foxp3 C.P.M % of inhibition C.P.M C.P.M ANALISI FUNZIONALE DEI TREGS NEL MM BM PB CTRL (n=2) BM MM (n=3) CTRL (n=7) PB MM (n=9) CD4 CD25 - acd3 AC Tregs CD4 CD25 - acd3 AC Tregs BM PB BM PB CD4 CD25 - CTRL - - acd3 AC - Tregs CTRL Tregs MM IFN IL17 Foglietta M et al, Hematologica 2014;99 (10)
37 ANALISI FUNZIONALE DEI TREGS NEL MM Foglietta M et al, Hematologica 2014;99 (10)
38 CONCLUSIONI 2 Il numero e il fenotipo funzionale dei Tregs di midollo osseo dei pazienti con mieloma alla diagnosi e altamente preservato e rimane invariato in remissione e in recidiva. La loro distribuzione nel microambiente tumorale non e correlata all infiltrato di plasmacellule tumorale Contrariamente ai linfociti T CD8 mantengono un repertorio TCRBV policlonale non perturbato dalla lunga esposizione alle cellule tumorali Contrariamente ai linfociti T CD8 mantengono un repertorio TCRBV policlonale non perturbato dalla lunga esposizione alle cellule tumorali
39 CONCLUSIONI 2 L effetto tolerogenico dei Tregs e quindi la possibilita della loro inibizione per aumentare l immunita antitumorale e strettamente dipendente dal contesto, dall interazione reciproca con le cellule tumorali e le altre popolazioni cellulari impegnate a riprogrammare il microambiente in senso pro-tumorale
40 Acknowledgements Department of Lymphoma/Myeloma MD Anderson Cancer Center Durgha Nattamai David Delgado Sattva S Neelapu Larry Kwak Department of Immunology MD Anderson Cancer Center Kui S Voo Laura Bover YJ Liu Divisione Universitaria di Ematologia Laboratorio di Ematologia Oncologica CeRMS Barbara Castella Micol Rigoni Valentina Griggio Patrizia Sciancalepore Marta Coscia Massimo Massaia Mario Boccadoro
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