Do#.ssa Arianna MIGLIO

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PERUGIA DOTTORATO DI RICERCA IN INCREMENTO DELLE PRODUZIONI ZOOTECNICHE E PATOLOGIA DEGLI ANIMALI DA REDDITO XXIV CICLO Se#ore Scien*fico Disciplinare - SSD VET/08 MASTITI OVINE SUBCLINICHE: ASPETTI DIAGNOSTICI INNOVATIVI Do#.ssa Arianna MIGLIO RELATORE Prof. Gabriele Frugan* COORDINATORE Prof. Giovanni Vitellozzi Dip.to Scienze Biopatologiche ed Igiene delle Produzioni Animali e Alimentari A. A. 2010/2011

2 ABSTRACT 4 RIASSUNTO 6 INTRODUZIONE 9 MASTITE SUBCLINICA OVINA Definizione Eziologia Patogenesi Epidemiologia 24 INDICATORI DI MALATTIA DELLA MAMMELLA NELLA SPECIE OVINA 28 TESTS DIRETTI E INDIRETTI 31 Coltura batterica del secreto mammario 31 Conta delle cellule somatiche (SCC) 32 California Mastitis Test (CMT) 38 Enzimi 41 Conduttività/Impedenza elettrica del secreto mammario 46 Proteine di fase acuta 47 Altri indicatori d infiammazione 53 OSSERVAZIONI PERSONALI 60 MATERIALI E METODI 61 Animali e disegno sperimentale 61 Esami di laboratorio 62 Secreto mammario 62 Sangue 63 Analisi statistica 64 RISULTATI 69 Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 2

3 DISCUSSIONE 125 CONCLUSIONI 138 BIBLIOGRAFIA 143 Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 3

4 ABSTRACT Subclinical mastitis represent a limiting factor for the production of milk of the sheep; the high incidence of this pathology causes worsening of qualitative and quantitative parameters of produced milk with negative impact on the animals health, the farm income and the public health. In subclinical mastitis, mammary gland is clinically healthy, but milk shows increase in somatic cell count (we considered cut-off value of SCC = cells /ml) and positive bacteriology. The aims of this study was to compare conventional methods for diagnosis of subclinical mastitis (inspection and palpation of mammary gland and cyto-bacteriological examination of milk) with innovative markers of inflammatory condition measured on sheep milk. Furthermore, we assessed changes in some hematological and blood-chemistry parameters in sheep affected by not clinically apparent mammary disorders. The study was performed on 132 clinically healthy lactating Lacaune ewes. Udder-half milk samples and blood samples were collected from each animal. On milk samples were evaluated: SCC, presence of bacteria cause of mastitis, number of neutrophil granulocytes/ml and concentration of Milk Amyloid A (MAA). On blood samples were determined: number of leukocytes (WBC), concentration of serum total proteins, electrophoretic protein fractions, Iron (Fe), Zinc (Zn), Urea (Ur), Lysozyme (Lys), Haptoglobin (Hp) and Serum amyloid A ( SAA). The results underwent to statistical analyses and were determined: - retrospective epidemiological study (case-control study) including subjects with subclinical mastitis (case 1) and sheeps showing SCC > 500,000 cells/ml (case 2) on milk; - descriptive analysis of SCC, neutrophil granulocytes and MAA on milk, as well as of WBC, total proteins, electrophoretic protein fractions, Hp and SAA on blood serum; - univariate analysis to evaluate the correlation between serum Hp, SAA, Lys, Zn, Fe, Ur and the presence of case 1 and case 2. The prevalence of subclinical mastitis was 17,05% (22/129 ewes), in agreement with data reported on literature. 20 subjects (15.5%) showed "aseptic secretory disorders", also called "nonspecific subclinical mastitis" and 9 ewes (7%) were affected by "latent mammary infection." Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 4

5 The results showed that on lactating Lacaune ewes, the absolute number of neutrophils granulocytes/ml on milk was useful to differentiate healthy udder-halves (values < neutrophil granulocytes/ml, P 0.05) from udder-halves suffering from subclinical mastitis (values > neutrophils granulocytes/ml, P 0.05) and also to identify latent mammary infection. To the author knowledge this is the first report to evaluate the concentrations of MAA on sheep mammary secretions samples by a specific commercial kit used to detect Amyloid A in milk. In lactating Lacaune ewes MAA showed positive correlation with SCC (P 0.05). The MAA concentrations detected from healthy udder-halves (mean ± SD = ± µg/ml) are higher than MAA measured by the same commercial kit on bovine milk. The MAA concentrations identified on udder-halves suffering from subclinical mastitis (mean ± SD = ± µg/ml) are significantly (P 0.05) higher than MAA measured from healthy udder-halves. Therefore we propose MAA as a potential diagnostic marker for subclinical mastitis in ewe. Milk neutrophils granulocyte/ml and MAA are not useful to differentiate the aseptic secretory disorders from the latent mammary infections. The latter mammary disorder can be confirmed only using bacteriological examination. WBC, total proteins, electrophoretic protein fractions, A/G, Hp, SAA, Lys, Zn, Fe and Ur measured in blood showed no significant relationship with the presence of case 1 and case 2. The pathological values of Hp, Zn and Fe, detected in many ewes, were not useful to identify sheeps with mammary disease and may indicate other disorders. More studies, including dairy sheep breeds other than Lacaune, are needed to confirm the threshold values of milk neutrophils/ml and MAA useful to define a udder-half healthy. Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 5

6 RIASSUNTO Le mastite subclinica rappresenta un fattore limitante la produzione delle specie lattifere, per compromissione delle caratteristiche quali-quantitative del latte e dello stato sanitario degli animali, inficianti la redditività dell allevamento; ad essa è correlabile anche il rischio di infezioni e tossinfezioni persino a carattere zoonosico. La diagnosi di mastite subclinica nella pecora viene formulata quando, in assenza di modificazioni all esame di ispezione e palpazione della mammella, il secreto mammario non alterato macroscopicamente presenta germi mastidogeni ed un numero di cellule somatiche (SCC) superiore ad un limite convenzionale. Quest ultimo è stato da noi considerato pari a elementi/ml di secreto mammario. Obiettivo del presente studio è stato quello di comparare i metodi di diagnosi di mastite subclinica attualmente in uso (ispezione e palpazione della mammella, esame citobatteriologico del secreto mammario) con la determinazione sul secreto mammario di marker dell infiammazione e con la valutazione di taluni parametri ematologici ed ematobiochimici. Lo studio è stato condotto su n 132 pecore di razza Lacaune a metà lattazione clinicamente sane, sottoposte a prelievi di campioni di secreto di ciascuna emimammella e di sangue. Sul secreto mammario sono stati valutati: SCC, presenza o assenza di microrganismi mastidogeni, numero di granulociti neutrofili/ml e concentrazione di Milk Amiloide A (MAA). Su sangue sono stati determinati: numero di globuli bianchi e dosaggio sierico di proteine totali e relative frazioni elettroforetiche, nonchè di Ferro (Fe), Zinco (Zn), Urea (Ur), Lisozima (Lys), Aptoglobina (Hp) e Sieroamilode A (SAA). Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 6

7 I risultati sono stati sottoposti ad analisi statistica, che ha previsto: (a) uno studio epidemiologico di tipo retrospettivo (studio caso controllo), nei riguardi dei soggetti affetti da mastite subclinica (capo positivo o caso 1) e di quelli mostranti secreto con SCC > a cellule/ml (caso 2); (b) l analisi descrittiva per le variabili SCC, granulociti neutrofili e MAA nei secreti mammari, nonchè per numero dei leucociti ematici, concentrazioni di proteine totali e relative frazioni elettroforetiche, Hp e SAA su sangue; (c) l analisi univariata per valutare l eventuale associazione tra Hp, SAA, Lys, Zn, Fe e Ur ematici e la presenza di emimammelle sia affette da mastite subclinica che eliminanti secreti con SCC > a /ml, indipendentemente dalla presenza o meno di mastidogeni. La prevalenza di mastite subclinica, identificata nel 17,05% dei capi esaminati (22/129), è in accordo con quanto segnalato in bibliografia nei riguardi della specie ovina. N.ro 20 soggetti (15,5%) sono risultati affetti da alterazione secretoria asettica, anche denominata mastite subclinica aspecifica, e n.ro 9 capi (7%) sono risultati portatori di infezione mammaria latente. Nell 88% dei secreti di emimammelle affette da mastite subclinica sono stati identificati Stafilococchi coagulasi negativi (S. epidermidis nel 72% e S. chromogenes nel 16%), come riferito in letteratura. La valutazione del numero dei neutrofili/ml di secreto mammario di pecore Lacaune a metà lattazione si è dimostrata di ausilio diagnostico in corso di malattie della mammella, poichè è in grado di differenziare una emimammella sana (valori < granulociti neutrofili/ml; P 0,05) da una mastitica (valori > a granulociti neutrofili/ml; P 0,05) o sospetta mastitica, nonchè di identificare emimammelle con infezione latente. Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 7

8 Il marker di infiammazione MAA, valutato per la prima volta su secreto mammario ovino con kit specifico per il latte, si mostra positivamente correlato con SCC (P 0,05). Nella pecore di razza Lacaune a metà lattazione, i valori di MAA dei secreti di emimammelle sane (media ± ds = 29,68 ± 27,98 µg/ml), sovrapponibili a quelli segnalati in bibliografia, sono superiori alle concentrazioni rilevate nel secreto mammario bovino con lo stesso kit commerciale. Le concentrazioni di MAA nei secreti mastitici (media ± ds = 114,37 ± 41,14 µg/ ml), risultano significativamente (P 0,05) più elevate rispetto a quelle del latte sano. Ciò consente di proporre tale parametro come potenziale marker per formulare diagnosi di mastite subclinica; tuttavia esso non sembra in grado di differenziare le emimammelle sane da quelle delle 29 pecore verosimilmente affette da alterazioni secretorie asettiche o portatrici di infezione latente. Per queste ultime la diagnosi può essere formulata solo attraverso l esame batteriologico del secreto mammario. I parametri testati a livello di sangue periferico (numero di leucociti) e di campioni di emosiero (proteine totali e frazioni elettroforetiche, A/G, Hp, SAA, Lys, Zn, Fe e Ur) non hanno mostrato correlazione statisticamente significativa con la presenza di mastite subclinica e di emimammelle eliminanti secreto con SCC > cellule/ml. Le modificazioni di Hp, Zn e Fe, rilevate in numerosi soggetti, non utili nell identificare pecore con affezioni non clinicamente palesi della mammella, potrebbero, tuttavia, trovare giustificazione in condizionamenti di tipo extramammario. I limiti soglia relativi ai valori indicati per i granulociti neutrofili e per MAA, al di sotto dei quali considerare il secreto mammario non mastitico sulla scorta dei risultati del presente studio, tuttavia devono trovare conferma ampliando la casistica, anche con osservazioni riguardanti pecore lattifere di razze diverse dalla Lacaune, ritenuta tra le più resistenti a contrarre malattie della mammella. Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 8

9 INTRODUZIONE L allevamento degli ovini ha un ruolo economico innegabilmente importante sia in Italia che negli altri paesi del Mediterraneo, peraltro accresciutosi in questi ultimi anni in considerazione dell aumento anche della richiesta del latte di pecora da parte dell industria casearia e dei prodotti di trasformazione da parte del consumatore. Ma l intensificazione della produzione di latte ovino ed il miglioramento della sua qualità chiamano in causa condotte allevatoriali e nutrizionali appropriate, l applicazione di idonee misure concernenti la biosicurezza e l adozione di oculate pratiche igienico-sanitarie riguardanti la mungitura e tutte le operazioni e fasi correlate. Non a caso gli Operatori del Settore Alimentare (OSA), a partire dall allevatore medesimo e dal veterinario aziendale, a livello sia nazionale che comunitario, sono ben consapevoli, anche sulla scorta delle informazioni diramate dalle Autorità competenti e dalle Associazioni di categoria e professionali (si tenga conto anche del Protocollo di Intesa- Veterinario di Fiducia dell 11 gennaio 2012, della necessità di applicare i principi della prevenzione e della sicurezza alimentare, come indicato dal Regolamento CE 852/2004 e, più recentemente, della PAC-Condizionalità. Ma tra gli strumenti significativamente irrinunciabili per raggiungere tali obiettivi vanno tenuti ben in considerazione tutti quegli aspetti intesi a favorire il benessere dell animale in allevamento, preservare il suo stato di salute, ed in particolare quello della mammella, se trattasi di animale lattifero, da ogni insulto capace di inficiare le produzioni. Le malattie della mammella che più frequentemente si riscontrano nella pecora, così come è noto verificarsi nella specie bovina, sono di natura infiammatoria. La mastite è la risposta Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 9

10 del tessuto mammario ai cambiamenti fisiologici e metabolici, a traumi, a fenomeni di natura allergica e, più frequentemente, all intervento di microorganismi patogeni. Si tratta, pertanto, di una malattia altamente multifattoriale nel cui determinismo sono comunque strettamente correlati animale, ambiente e microrganismi, tanto da caratterizzare i differenti gradi d intensità, durata e conseguenze del processo morboso (Albenzio et al, 2002). Le perdite economiche derivanti dalla presenza delle mastiti in un allevamento di pecore lattifere non solo sono riconducibili alle alterazioni qualitative e quantitative della produzione di latte, che può ridursi persino del 60% (Mavrogenis et al, 1995), ma sono dovute anche alle morti degli agnelli e talvolta delle madri o alla loro riforma, quando si presenti agalassia od ipogalassia per mammelle poco o non più funzionanti, in relazione alla rarefazione del tessuto ghiandolare ed alla sua sostituzione con tessuto connettivo. A tali aspetti si devono aggiungere, inoltre, in riferimento alle perdite dovute alle alterazioni delle caratteristiche igienico-sanitarie del prodotto e la sua scarsa o nulla lavorabilità ed accettazione da parte dell industria lattiero-casearia, quelle implicazioni inficianti la qualità igienica (in considerazione anche della Direttiva EU 46/92 e quella 71/94 che ne definiscono le caratteristiche batteriologiche) e la presenza di eventuali patogeni a carattere zoonotico (Winter et al., 2006). Gli aspetti di natura economica richiamati e quelli in termini di salute pubblica mai trascurabili giustificano, pertanto, la necessità di provvedimenti concernenti il controllo delle malattie della mammella anche nell allevamento ovino. Già nel 1887 Edmund Nocard affermava che la mastite della pecora, quale peste delle greggi destinate alla produzione di formaggio, è una condizione morbosa non ben conosciuta dai veterinari e la riteneva, tra le malattie ovine, quella più inficiante la redditività dell allevamento. Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 10

11 A distanza di circa 130 anni, l interesse nei confronti delle mastiti ovine è ancora vivo, sebbene il numero dei contributi sull argomento da parte della collettività scientifica sia da considerare sicuramente limitato, se comparato con quello riguardante, invece, le malattie della mammella delle bovine da latte. Particolarmente scarsa, peraltro, è la bibliografia esistente sulle mastiti ovine a decorso cronico e clinicamente subdolo, nonché, e soprattutto, sulla c.d. mastite subclinica. La mastite subclinica, a differenza delle forme palesi acute e croniche individuabili sulla scorta del riscontro di modificazioni della mammella all esame di ispezione e palpazione e di alterazioni macroscopiche del secreto, rappresenta un problema sul piano diagnostico e, di conseguenza, anche riguardante il suo possibile controllo. Le mammelle affette da tale forma, infatti, proprio poiché non sono identificabili all esame di ispezione e di palpazione ed eliminano secreto macroscopicamente non modificato, sfuggono all osservazione. Ne deriva che la produzione lattea si riduce, vengono eliminati e diffusi i patogeni più spesso con le operazioni di mungitura ad altri animali e le forme subcliniche possono trasformarsi in mastiti palesi. A complicare ulteriormente il problema della diagnosi, della terapia e del controllo delle malattie della mammella delle pecore è da sottolineare anche l esistenza di importanti differenze tra le specie di ruminanti da latte, tale da dover essere esaminate attentamente nel loro complesso le mastiti ovine e la forma subclinica in particolare, evitando l applicazione tout court di quanto noto sull argomento a proposito delle mastiti delle bovine da latte (Contreras et al, 2007). Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 11

12 1. MASTITE SUBCLINICA OVINA 1.1. Definizione La mastite subclinica, che rappresenta uno dei più importanti problemi gestionali e sanitari nei greggi di ovini da latte, ma anche nelle bovine lattifere, è un infiammazione della mammella in grado di ridurre insidiosamente le capacità produttive (Kiossis et al, 2007; Moretti, 1991). Si tratta di un infiammazione sierosa o sieroso-purulenta degli alveoli e del sistema duttale, che può coinvolgere anche la mucosa della cisterna della mammella e del capezzolo, la quale, persistendo, causa proliferazione del connettivo interstiziale. Gli animali affetti da mastite subclinica, infatti, spesso presentano un accresciuto tessuto cicatriziale in alcune aree della mammella, con conseguente riduzione della capacità produttiva del tessuto ghiandolare. A differenza delle forme di mastite catarrale acuta e cronica, individuabili in base alle modificazioni rilevabili mediante ispezione e palpazione della mammella, cui si associa anche eliminazione di secreto macroscopicamente alterato e quantitativamente ridotto, quella subclinica viene diagnosticata soltanto sulla scorta dei risultati dell esame cito-batteriologico del secreto. Nella specie ovina, infatti, la diagnosi di mastite subclinica, così come si effettua nella bovina, viene formulata quando il secreto macroscopicamente non modificato, prelevato da una mammella non mostrante alterazioni all esame di ispezione e palpazione, presenta un numero di cellule somatiche elevato, superiore ad un limite convenzionale di riferimento, e germi mastidogeni. Secondo Kiossis et al. (2007) si dovrebbe considerare affetta da mastite subclinica un emimammella di pecora, quando in 2 esami successivi del suo secreto, eseguiti a distanza di qualche giorno, viene evidenziato lo stesso agente mastidogeno ed il numero di cellule somatiche per millilitro risulta superiore al limite di riferimento. Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 12

13 Nella diagnostica routinaria, però, tale giudizio viene generalmente formulato sulla base dei risultati di 1 solo esame cito-batteriologico. E da tenere presente, tuttavia, che l esecuzione di 1 solo accertamento può non comportare l emissione di diagnosi di mastite subclinica, poiché, pur in presenza di un numero elevato di cellule somatiche, l agente mastidogeno può essere eliminato con il secreto mammario in maniera discontinua o la negatività batteriologica essere motivata da un trattamento antibiotico recente o da scarsa concentrazione del patogeno, insufficiente a garantirne l isolamento (Anderson et al, 2002; Moretti, 1986). La presenza di mastite subclinica può essere sospettata anche nelle pecore di razze da carne quando vengano rilevati crescita stentata degli agnelli, stati di malnutrizione neonatale ed aumento della mortalità degli stessi. In quelle da latte, invece, il sospetto di mastite subclinica può essere avanzato con il rilievo di ridotta produzione giornaliera di latte e di eventuali sue alterazioni delle caratteristiche chimico-fisiche ed igieniche non idonee alla trasformazione, nonchè dall eliminazione prematura dei capi per decadimento delle condizioni generali (Kiossis et al, 2007; Arsenault et al, 2008; Anderson et al, 2002; Van den Borne et al, 2011). Si è stimato che le pecore affette da mastite subclinica presentano una riduzione della produzione media individuale giornaliera di latte superiore a 18 grammi (Mavrogenis et al, 1995) e che essa può ridursi fino al 50% (Saratsis et al, 1999). Sembra, peraltro, che la specie ovina, in relazione all infiammazione della ghiandola mammaria, sia più vulnerabile, in termini di riduzione della produzione lattea, rispetto alla specie bovina e caprina (Contreras et al, 2007). Secondo Lafi et al. (1998) la mastite subclinica può presentarsi nel gregge in forma sporadica oppure enzootica, in relazione all agente patogeno che la sostiene ed assume decorso variabile. La mastite subclinica, infatti, può mantenersi tale per tutta la vita produttiva della pecora, può anche regredire spontaneamente durante il periodo dell asciutta o può evolvere in malattia palese della mammella, come forma acuta o più spesso catarrale cronica. Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 13

14 1.2. Eziologia La maggior parte delle patologie infiammatorie della mammella sono di origine batterica. Staphylococcus spp. rappresentano i microrganismi che più frequentemente vengono associati ad infiammazione ed infezione mammaria della pecora. Ma anche altri batteri, come Streptococcus spp, Enterobacteriaceae, Micrococcus spp, Mannheimia haemolitica, Corynebacterium spp., Pasteurella haemolitica e/o multocida, e funghi possono indurre mastite nei piccoli ruminanti, anche se meno frequentemente. Aspergillus fumigatus, Serratia marcescens o Burkholdelia cepacia diventano temibili mastidogeni in occasione di introduzioni per via diatelica di preparati contenenti antibiotici a scopo terapeutico o preventivo non correttamente effettuate (Gonzalo et al, 2004; Corrales et al, 2004; Contreras et al, 2007). Ma non vanno dimenticate le mastiti sostenute da Mycoplasma agalactiae e da Brucella melitensis secondarie ad infezioni sistemiche, nonchè da Actinobacillus ligneresii, Pseudomonas aeruginosa e Cryptococcus neoformans. E opinione comune che S. aureus sia più frequentemente isolato nelle forme di mastite gangrenosa e che i patogeni Streptococcus agalactiae e Streptococcus bovis, Pasteurella haemolitica e/o multocida siano responsabili di mastite contagiosa, mentre i patogeni ambientali (Escherichia coli, Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Corinebacterium pyogenes, Corynebacterium pseudotuberculosis ovis, Streptococcus uberis, Staphylococcus chromogenes e altri stafilococchi coagulasi negativi) siano responsabili di mastiti ad insorgenza sporadica (Fruganti et al, 1983; Albenzio et al, 2002). In corso di mastite subclinica ovina, in particolare, possono essere isolati differenti batteri, tra i quali Bacillus spp, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus (presente dal 3 al 37% dei Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 14

15 casi, principalmente nelle forme che poi evolvono in mastiti croniche), Staphylococcus spp., Streptococcus spp, E. coli, P. aeruginosa, A. (Actinomyces, Corynebacterium) pyogenes, Micrococcus spp, A. pseudotuberculosis, Klebsiella spp, E.coli, nonchè patogeni ambientali (Anderson et al, 2002) (Tabella 1). MASTITI SUBCLINICHE (frequenza %) Staphylococcus spp (59,1%)-12 specie S. aureus (17,2%) S. epidermidis (14,2%) S. capitis (12,8%) Bacillus spp (30%) Coliformi (4,3%) Micrococcus spp (2,6%) Streptococcus spp (2%) Arcanobacterium (1,5%) Pseudomonas spp (0,7%) MASTITI (frequenza %) Staphylococcus epidermidis (24,6%) Escherichia coli (11%) Pseudomonas aeruginosa (8%) Staphylococcus aureus (7%) Arcanobacterium pyogenes (3%) Enterobacter cloacae (3%) Streptococcus spp (3%) Pseudomans putida (1%) Bacillus spp (1%) Klebsiella pneumoniae (1%) Cocchi Gram + (1%) MASTITI CRONICHE (frequenza %) Cultura positiva (60,7%) Staphylococcus aureus Streptococchi Beta-emolitici Streptococcus agalactiae Stafilococchi coagulasi negativi Staphylococcus spp Aracnobacterium pyogenes Pseudomonas spp Pasteurella spp Tabella 1: Patogeni isolati da campioni di secreto mastitico ovino (modificata da: Anderson et al, 2002) Viene segnalato, inoltre, che il 40% delle pecore affette da mastite unilaterale clinicamente manifesta, sostenuta da S.aureus, presenta anche un infezione subclinica da parte dello stesso microrganismo a livello dell emimammella controlaterale (Bergoiner et al, 2003; Mork et al, 2007). Anche Listeria monocitogenes e Salmonella spp. possono causare mastiti subcliniche e croniche, seppure raramente. Il fatto che nella Sindrome di Agalassia Contagiosa più organi od apparati sono coinvolti nel processo morboso, oltre la mammella, può far escludere erroneamente che Mycoplasma spp. venga annoverato come microrganismo anche responsabile di mastite subclinica. Ma almeno in aree in cui la sindrome citata è endemica, la responsabilità di Mycoplasma spp., nel determinare sia la Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 15

16 riduzione della produzione lattea che l aumento del numero di cellule somatiche nel secreto mammario, dovrebbe invece indurre a considerare tale microrganismo tra i più importanti patogeni di mastiti subcliniche (Contreras et al, 2007; Corrales et al, 2004; Bergonier et al, 2003). Gli stafilococchi coagulasi negativi rappresentano la principale causa di mastite subclinica della pecora e sembra che la ghiandola mammaria ovina sia più colpita da tali microrganismi rispetto a quella caprina (Leitner et al, 2004). Essi sono presenti dal 25% al 93% dei casi con S. epidermidis al primo posto (identificato nel 40% delle osservazioni); seguono poi S. simulans, S. haemolyticus, S. caprae, S. chromogenes, S. xylosus (Cullor et al, 1990; Watkins et al, 1991; Mavrogenis et al, 1995; Cuccuru et al, 1996; Las Heras et al,1999; Cosseddu et al, 2005; Contreras et al, 2007; Vautor et al, 2009) (Figura 1). Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 16

17 Stafilococchi coagulasi negativi Streptococchi Stafilococchi Gram - 4% Altri batteri S. aureus Corynebacterium spp. 3% 3% 6% 9% 75% Figura 1: Principali agenti eziologici batterici di mastite subclinica ovina (modificata da:cosseddu et al, 2005) Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 17

18 In considerazione della presenza di batteri mastidogeni nel secreto mammario e per minimizzare i rischi per il consumatore, il latte viene generalmente trattato con il calore. Ciò escluderebbe i rischi per la salute umana e potrebbe far abbassare la guardia nei confronti delle misure utili al controllo della mastite ovina, indipendentemente dall essere palese o subclinica, che invece devono rappresentare una priorità per tutti gli OSA in quelle regioni dove il formaggio e gli altri derivati vengono preparati da latte non trattato termicamente. Peraltro, proprio a questo proposito, va puntualizzato che alcuni batteri sono in grado di produrre tossine anche nel latte pastorizzato, come S. aureus, con ovvie ripercussioni in termini di salute pubblica. Le tossine (enterotossine termostabili) elaborate da tale microrganismo contribuiscono alla patogenesi della mastite e giocano un ruolo importante nelle zoonosi di origine alimentare. Pertanto, dal momento che S.aureus è responsabile sia di mastiti palesi (mastite gangrenosa) sia di forme subcliniche e che la produzione delle enterotossine termostabili deriva da ceppi isolati in entrambe le forme, seppure risultino meno enterotossici quelli isolati da pecore con mastite subclinica, le infezioni intramammarie causate da questo patogeno necessitano di particolare attenzione. Da ciò consegue la messa in atto di programmi di eradicazione di S.aureus dagli allevamenti di ovini da latte (De Santis et al, 2005; Contreras et al, 2007), anche attraverso percorsi di informazione e formazione degli allevatori, atteso anche il contenuto della Direttiva Comunitaria 92/46 (ECC Council, 1992), che rende obbligatorio il controllo di S.aureus nel latte ovino, bovino e caprino. Oltre alle enterotossine, S. aureus è in grado di produrre fattori di virulenza, quali leucotossine e esopolisaccaridi. Le prime possono selettivamente distruggere i leucociti polimorfonucleati ed i monociti dell ospite. Tali cellule del sistema immunitario sono però più resistenti agli effetti delle leucotossine prodotte da S.aureus nei piccoli ruminanti rispetto al bovino (Reinard et al, 2003). Gli Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 18

19 esopolisaccaridi, invece, formano una barriera protettiva che riduce l efficacia della risposta immunitaria sia dell ospite che degli antibiotici. Proprio per le ragioni anzidette, la migliore strategia per il controllo dell infezione mammaria da S.aureus è rappresentata dalla rimozione degli animali infetti dal gregge, ancorchè vengano poste in atto tutte quelle misure relative all igiene della mungitura e venga anche effettuata la c.d. terapia in asciutta (Contreras et al, 2007). Il latte non pastorizzato ovino può, inoltre, trasmettere altri agenti di zoonosi, quali Streptococcus zooepidemicus, Listeria monocitogenes e Nocardia farcinica (Winter et al, 2004; Balter et al, 2000; Las Heras et al, 2002; Maldonado et al, 2004). Sebbene meno patogeni di S.aureus, anche gli Stafilococchi coagulasi negativi possono produrre tossine termostabili. Ceppi di tali di microrganismi, isolati nel 60-80% dei casi di mastiti subcliniche ovine, sono in grado di produrre alfa e delta emolisine ed inducono un aumento delle cellule somatiche del secreto mammario superiore a quello determinato da ceppi non emolitici. La loro patogenicità è, quindi, ampiamente variabile e i meccanismi patogenetici che sottostanno alle infezioni subcliniche sono ancora da chiarire. La presenza di differenti specie di Stafilococchi coagulasi negativi è attribuibile verosimilmente ad errate pratiche di controllo delle mastiti, in particolare riferite ai metodi non appropriati di pulizia e disinfezione del capezzolo prima della mungitura ed ai trattamenti in asciutta (Contreras et al, 2003; Contreras et al, 2007). Secondo Mavrogenis et al. (1995) anche la presenza di Stafilococchi coagulasi negativi nel secreto mammario dovrebbe indurre ad approntare ogni possibile misura di prevenzione ad evitare l insorgenza di mastiti e problemi di salute pubblica. Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 19

20 1.3. Patogenesi I piccoli ruminanti ed i bovini condividono alcuni aspetti fisiopatologici riguardanti le malattie della mammella; anche taluni fondamenti concernenti la diagnosi e la terapia acquisiti e consolidati per l allevamento bovino e le patologie mammarie possono essere adattati a quello ovino e caprino. I meccanismi patogenetici responsabili di infiammazione della mammella nella pecora, infatti, sono sovrapponibili a quelli noti per la mastite della bovina da latte (Radostits et al, 1999). Il momento in cui l infezione batterica si insedia nella mammella ed i fattori che la rendono suscettibile all infezione stessa sono componenti peculiari del processo mastitico, sebbene ancora necessitino di ulteriori acquisizioni ed approfondimenti, anche a motivo dell esistenza di pareri discordi nel merito precipuo (Madel, 1986). I mastidogeni si insediano o vengono sollecitati nella virulenza allorchè intervengono lesioni prodotte da cause esterne. Quali fattori predisponenti vanno ricordati le carenze di ordine igienico nella sala di mungitura e nell allevamento (animali con mammelle costantemente sporche, imbrattate da deiezioni e liquami diversi), le procedure di mungitura non adeguate, sia che essa possa essere a mano o meccanica (all insufficiente o mancata preparazione della mammella alla mungitura si correla sempre la incompleta eiezione ), il malfunzionamento della mungitrice, le condizioni climatiche freddoumide, le aree fangose, le mammelle morfologicamente poco adatte ad essere munte meccanicamente e lo stress nutrizionale. In buona sostanza in tutti i casi in cui si viene a ridurre il flusso di sangue alla mammella e/o viene compromessa la funzione immunitaria locale (secondariamente all aumento del rilascio del cortisolo stress-indotto) aumenta l esposizione ad agenti infettanti. Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 20

21 Anche il pascolo nei terreni più freschi e le pratiche nutrizionali intese a favorire una produzione elevata di latte, specialmente durante lo svezzamento, possono rappresentare fattori concomitanti. Secondo l opinione di ricercatori francesi (Bernier et al, 2003), infatti, la gravità della mastite da stafilococco, indotta sperimentalmente, aumenta quando la mammella contiene una grande quantità di latte. Madel (1986) sostiene che il periodo di maggiore suscettibilità all infezione della ghiandola mammaria degli ovini da latte sia quello in cui l agnello viene svezzato ed allontanato dalla madre. Secondo altri autori (Anderson et al, 2002), invece, tale periodo coincide con il parto e, in particolare, è più facile che si sviluppino mastiti batteriche tra il parto e lo svezzamento, sebbene possano anche presentarsi durante la lattazione e nel corso dell asciutta. E unanimemente condiviso, comunque, il fatto che è particolarmente delicato e critico per le infezioni della mammella il periodo tra le 4 e le 6 settimane d età post partum, quando gli agnelli affamati, soprattutto di pecore poco produttrici di latte, possono indurre traumi da suzione a livello del capezzolo. La maggiore suscettibilità all insorgenza della mastite nel precoce post partum e nei primi stadi dell involuzione della ghiandola mammaria successiva allo svezzamento sembrerebbe dovuta al declino, che si instaura in queste fasi, della capacità fagocitica dei neutrofili e dei macrofagi, con conseguente compromissione dell immunità locale. L efficacia di queste cellule, invece, è elevata nel secreto della ghiandola mammaria a partire dal 30 giorno dallo svezzamento ed è massima quando la mammella ha completato l involuzione (Tatarczuch et al, 2002; Rupp et al, 2009). Si ritiene che l infezione mammaria si verifichi generalmente per via ascendente; i microrganismi, penetrati attraverso l apertura del capezzolo, raggiungono le cisterne, i dotti e poi gli alveoli, dove svolgono la propria attività patogena. L infiammazione (alveolite) e l infezione, successivamente, si diffonderebbero a livello delle vie duttali anche per via discendente. Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 21

22 L infiammazione proliferativa dei dotticini, costituita da formazione di tessuto di granulazione, provoca inevitabilmente proliferazione del connettivo inter-intralobulare e trasformazione degli alveoli in tessuto non secernente. Da una serie di ricerche istologiche effettuate su di un gruppo di mammelle affette da mastiti subcliniche e mastiti catarrali croniche, si è potuto appurare che in riferimento a tali due forme morbose esiste soltanto una differenza di ordine quantitativo, ma non di ordine morfologico e che la formulazione della diagnosi di mastite palese o meno sulla base dei rilievi dell esame di ispezione e palpazione dipende dall entità delle lesioni infiammatorie essudative o proliferative (Seffner et al, 1981). In buona sostanza il fatto che nelle emimammelle colpite da mastite subclinica possono venire evidenziate alterazioni istologiche anche su vaste aree, che, comunque, non sono rilevabili clinicamente, da un lato giustifica la definizione di mastite subclinica intra vitam e dall altro dimostra che l esame di ispezione e di palpazione della mammella è in grado di evidenziare soltanto alterazioni molto grossolane della stessa. Va anche puntualizzato che gli eventuali rilievi desumibili alla palpazione, suscettibili di far avanzare il sospetto dell esistenza di una mastite catarrale iniziale, possono essere sovrapponibili a quelle modificazioni del parenchima mammario che si verificano fisiologicamente durante il ciclo della lattazione o per l età avanzata, dovute nell uno e nell altro caso ad una relativa proliferazione del connettivo inter-intralobulare (Moretti, 1991). Tra i disordini secretori della mammella non svelabili all esame di ispezione e palpazione della stessa, la quale peraltro elimina secreto macroscopicamente non modificato, possono presentarsi anche le cosiddette alterazioni secretorie asettiche, secondo Moretti (1991), o mastiti subcliniche non specifiche, secondo Albenzio et al. (2002). Tali disordini sono diagnosticati mediante l esame cito-batteriologico del secreto mammario, che consente il rilievo di un contenuto cellulare superiore al limite convenzionale di riferimento della specie considerata, ma in assenza di un agente infettivo Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 22

23 mastidogeno. Essi possono rappresentare il prestadio della mastite subclinica, quale prioritaria conseguenza della mungitura non appropriata (l apparato meccanico, se non opportunamente tarato o controllato, ad esempio, può esercitare un vuoto troppo elevato, le pulsazioni del sistema possono essere esageratamente frequenti, le guaine possono essere ossidate, può determinarsi il fenomeno della summungitura, quando non viene a staccarsi dai capezzoli tempestivamente il gruppo di aspirazione, ecc.), oppure possono costituire l esito di una mastite subclinica eziologicamente guarita. La constatazione della presenza di tali alterazioni rappresentano uno step importante della lotta alle mastiti per il motivo che le emimammelle colpite sono particolarmente recettive alle infezioni stesse. Se in un allevamento intensivo esse insorgono in più animali, le cause vanno ricercate nelle operazioni di mungitura meccanica per essere prontamente eliminate e, nel contempo, i soggetti colpiti andrebbero munti a mano. La eventuale persistenza del disordine secretorio deve allora indurre a sospettare una mastite subclinica e quindi va ripetuto più volte l esame batteriologico del secreto mammario. In corso di mastite subclinica, infatti, ma talvolta anche nelle mastiti croniche, i mastidogeni possono essere eliminati con il secreto mammario in maniera discontinua oppure in numero troppo scarso, per cui il laboratorio di batteriologia può non attestarne la presenza. Invece in altri disordini secretori della mammella, cioè nella c.d. infezione mammaria latente (Moretti, 1991) o subclinica latente (Albenzio et al, 2002), si possono mettere in evidenza microrganismi mastidogeni in un secreto che macroscopicamente e dal punto di vista del numero di cellule somatiche non è modificato, come si può verificare ad esempio nella fase iniziale dell infezione da S. agalactiae nella bovina da latte. I soggetti colpiti da infezione latente vanno isolati, trattati e ripetutamente esaminati. Non è da trascurare poi il fatto che la mastite presentatasi nel corso di una lattazione può manifestarsi anche nella successiva e che, d altra parte, un alterazione subclinica della ghiandola Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 23

24 mammaria, può facilmente diventare palese. Lo stato attuale della mammella affetta da mastite subclinica, infatti, può essere l espressione di risoluzione o di miglioramento di un affezione pregressa, come anche di comparsa di un nuovo fatto infiammatorio e di aggravamento per l infezione (Fruganti et al,1985b) Epidemiologia La mastite può colpire l 8% - 20% degli ovini da latte, con le debite variazioni a seconda delle zone geografiche e del tipo di allevamento (Fruganti et al, 1983; Madel, 1986; Anderson et al, 2002; Bergonier et al, 2003). L incidenza annuale delle mastiti manifeste viene stimata attorno al 5%, con la possibilità di aumenti sporadici fino al 50%. Essa sembra più elevata nei primi mesi (2-3 mesi) della lattazione. In alcune greggi di pecore di razza Lacaune l eliminazione di soggetti per mastite clinicamente palese arriva fino al 7% (Bergonier et al, 2003). Secondo Mavrogenis et al. (1995), Contreras et al. (1999) e Albenzio et al. (2002) le mastiti più frequentemente rilevate nella specie ovina e caprina sono, però, quelle subcliniche. La loro prevalenza, nelle pecore adibite alla produzione di latte, infatti, sembra variare dal 5% al 30% con punte che raggiungono anche l 80% (Fruganti et al,1983; Watkins et al,1991; Radostits et al,1999; Bergonier e Bertelot, 2003; Contreras et al, 2003; Kiossis et al, 2007). Pochi sono gli studi epidemiologici che indicano i tassi di diffusione aggiornati di tale forma morbosa nelle diverse aree del Mediterraneo. Gonzalez-Rodriguez e Carmenes (1996) identificano una prevalenza di mastite subclinica, su 1366 campioni di secreto da emimammelle di pecore di tre razze lattifere autoctone spagnole (Churra, Castellana, Assaf), pari al 43%. In Grecia la prevalenza della mastite subclinica in razze autoctone varia tra greggi di ovini da latte dal 29% al 43% Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 24

25 (Stefanakis et al, 1995). In Italia, sondaggi effettuati su pecore di razza Comisana indicano che il tasso di prevalenza varia dal 17,5% al 45% (Albenzio et al, 2002; Dario e Bufano,1994; Puccio e Mazza, 1994). La prevalenza delle mastiti subcliniche è influenzata da diversi fattori, tra i quali età, razza, stadio e numero di lattazioni, gestione generale dell allevamento e della mungitura, condizioni igieniche dell allevamento, nonchè numerose variabili ambientali (Sevi et al, 2000; Kiossis et al, 2007). Essa aumenta particolarmente quando il gregge è stipato in ambienti ristretti, in cui gli agnelli rappresentano i vettori di mastidogeni da mammelle di capi infetti a mammelle di soggetti sani (Cullor et al, 1990), e non è correlabile, secondo McDougall et al. (2001), invece, all avanzare dell età. Ma differenti gruppi di ricerca (Kirk et al, 1996; Leitner et al, 2001; Bergonier et al, 2003) dimostrano che vi è un rischio maggiore di insorgenza di mastite subclinica all inizio della lattazione e subito dopo lo svezzamento, oltre che con l aumentare dell età dei soggetti. La persistenza delle infezioni mammarie subcliniche è variabile in accordo con l agente patogeno responsabile e con lo stadio della lattazione. Generalmente essa è alta durante la lattazione, dal momento che Staphylococcus spp. rappresentano la causa più frequente e tali forme d infezione sono in genere poco diagnosticate e, quindi eradicate, in questa fase produttiva. Durante il periodo dell asciutta, invece, la persistenza è più bassa, dal momento che sembra verificarsi la guarigione spontanea nel 35-67% degli ovini (Menzies e Ramanoon, 2001; Bergonier et al, 2003). FONTI DI INFEZIONE E FATTORI ASSOCIATI La fonti primarie di infezione sono il trasporto degli animali e i soggetti affetti da mastiti subcliniche e croniche. Questo tipo di mastiti rappresentano i serbatoi più importanti di Staphylococcus spp., anche se gli Stafilococchi coagulasi negativi e S.aureus possono essere Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 25

26 identificati sulla cute sana dei capezzoli o di altre sedi anatomiche. Altri batteri come S.agalactiae, A.pyogenes, M. hemolitica possono essere trasmessi da cavità orale, nasofaringe e tonsille degli agnelli che suggono il latte dalle mammelle materne (Bergonier et al, 2003). Ulteriori fonti di infezione della mammella sono di tipo ambientale: sono molto diffusi Enterobacteriaceae spp. e Enterococchi nella lettiera, Pseudomonas spp. nell acqua o negli ambienti umidi, come pure A.fumigatus e altri funghi nel foraggio, nella lettiera e nell aria (Bergonier et al, 2003). I fattori associati ad un elevata suscettibilità alle infezioni della mammella sono rappresentati principalmente dalle strumentazioni e dai metodi di mungitura, dalle pratiche di infusione intramammaria di antibiotici in asciutta o in lattazione, responsabili spesso di traumatismi a livello dell apice del capezzolo, nonchè dagli eventi stressanti e turbe endocrino-metabolico. La carenza di selenio e di vitamine A ed E è stata recentemente segnalata avere un ruolo predisponente nelle mastiti ovine e la valutazioni sierica di tali parametri sembra essere in grado di indicare animali a rischio di sviluppare mastite (Giadinis et al, 2011). D altronde, anche Morgante et al. (1999) affermano che la somministrazione per via parenterale di vitamina E e selenio negli ovini, durante il periodo di asciutta, può ridurre il numero delle cellule somatiche e aumentare la percentuale dei granulociti neutrofili presenti nel latte nella successiva lattazione, abbassando così la suscettibilità all insorgenza di un infezione mammaria. Recenti studi condotti su alcune razze ovine (Lacaune e Churra) correlano, inoltre, fattori genetici ereditabili con la resistenza alle mastiti. Ciò grazie al ritrovamento di specifici locus genici, localizzati nel cromosoma 6 e 16 del genoma, definiti come segmenti legati alla produttività (regioni del DNA associate a particolari caratteri quantitativi, Quantitative traits Loci-QTLs), che assumono, quindi, notevole importanza economica. In particolare, in Francia, nell ambito di un programma di miglioramento genetico delle pecore di razza Lacaune, è stata definita una strategia indiretta di selezione per la resistenza alle mastiti, sulla base dei parametri genetici associati al numero di cellule somatiche nel latte, i quali, a loro volta si Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 26

27 mostrano geneticamente correlati con i tratti produttivi (QTLs). Tale programma è ad oggi possibile limitatamente alla selezione nei confronti della mastite subclinica. Linee di sangue con un particolare parametro genetico della qualità del latte, il cosiddetto punteggio di cellule somatiche o Somatic Cell Score (SCS), più basso, infatti, si mostrano più resistenti alle mastiti. La maggiore resistenza, rispetto a linee di sangue aventi un SCS elevato, sembra correlabile alla migliore abilità a limitare il processo infiammatorio e le relative sue conseguenze cliniche, nonchè ad evitare l insorgenza delle infezioni durante il post partum e ad eliminare le infezioni durante la lattazione (El Saied et al, 1999; Barillet et al, 2001; Bergonier et al, 2003; Rupp et al, 2009; Bergonier et al, 2009). Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 27

28 2. INDICATORI DI MALATTIA DELLA MAMMELLA NELLA SPECIE OVINA In un azienda di ruminanti da latte possono essere individuati due principali livelli intesi a valutare i parametri indicatori di mastite e qualità del latte: il livello individuale o del singolo soggetto nel gregge e quello di massa del gregge. Nonostante l analisi del latte di stalla sia, per l allevatore, un metodo di valutazione della produzione lattea rapido e di più fattibile esecuzione per i ridotti costi, porre l attenzione sul secreto della singola mammella significa individuare i capi responsabili delle eventuali alterazioni quali-quantitative del latte di massa e poter, quindi, migliorare lo stato sanitario e la redditività dell allevamento (Pyorala, 2003). La recente Direttiva Europea 89/362/EEC, d altronde, indica che gli allevatori devono valutare l aspetto macroscopico del secreto mammario di ogni singolo capo prima della sua mungitura. Secondo l International Dairy Federation (IDF) la diagnosi di mastite bovina viene formulata sulla base dei rilievi desumibili dall esame di ispezione e palpazione della mammella in associazione ai risultati di quello cito-batteriologico del secreto mammario. Volendo approfondire il grado di diffusione e l età delle lesioni, si può ricorrere all esame istologico di un frustolo di parenchima mammario prelevato con biopsia (Fruganti et al, 1983; Moretti, 1991; Pyorala, 2003). Parimenti sarebbe auspicabile, nell allevamento di pecore da latte, l esecuzione routinaria oltre che dell ispezione e della palpazione della mammella, anche del conteggio quali-quantitativo cellulare e dell esame batteriologico del secreto mammario ad intervalli regolari e soprattutto riguardanti i nuovi animali introdotti nel gregge. Dott. ssa Arianna Miglio - Tesi di Dottorato in Incremento delle Produzioni Zootecniche e Patologia degli Animali da Reddito - Università degli Studi di Perugia 28