Lavoro di diploma 2009 Redatto da: Regazzoni Cinzia Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno

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1 Lavoro di diploma 2009 Redatto da: Regazzoni Cinzia Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno Svolto presso: Servizio Trasfusionale CRS Svizzera Italiana Responsabile: Ryser Belinda

2 INDICE INDICE RIASSUNTO/ABSTRACT INTRODUZIONE Morbo Emolitico del Neonato (MEN) Condizioni necessarie per lo sviluppo di un MEN Immunizzazione materna Valutazione prenatale Sorveglianza neonatale La profilassi anti-d A chi e quando viene somministrata la profilassi anti-d Meccanismo d azione della profilassi anti-d Causa di alloimmunizzazione La titolazione anticorpi Scopo del lavoro di diploma Obiettivi MATERIALE E METODI Materiale generale Plasma Criteri per l accettazione del prelievo Selezione eritrociti Titolo anti-d Titolo altri alloanticorpi Materiale tecnico Centrifuga lava globuli metodo in provetta Incubatore metodo provetta + gel Centrifuga per cartine metodo gel Materiale metodo in PROVETTA Siero polispecifico di Coombs Coombs-Control Soluzione salina Materiale metodo in GEL ID-Diluent Cartina gel LISS/COOMBS Metodi Principio dell analisi del test di Coombs indiretto Principio dell analisi della titolazione anticorpi Titolazione anticorpi anti-eritrocitari in PROVETTA Titolazione anticorpi anti-eritrocitari in GEL Possibili fattori influenti sui risultati d analisi RISULTATI DISCUSSIONE CONSLUSIONE GLOSSARIO BIBLIOGRAFIA RINGRAZIAMENTI ALLEGATI

3 1. RIASSUNTO/ABSTRACT INTRODUZIONE Il Morbo emolitico del neonato (MEN) é una malattia caratterizzata dalla distruzione di eritrociti del feto ad opera di anticorpi specifici, che si sono formati nella madre dopo un processo di alloimmunizzazione (antigene assente dagli eritrociti materni), diretti contro eritrociti fetali; questa situazione si può osservare durante la gravidanza o subito dopo il parto. I test di screening prenatali sono molto importanti al fine di prevenire e/o monitorare l insorgere di un MEN. Secondo le Raccomandazioni dei Ginecologi, a tutte le donne Rh negative (prive di alloanticorpi anti-d), alla 28 settimana di gravidanza e nelle 72 ore seguenti il parto, viene somministrata la profilassi anti-d (300 μg in 2 ml) sufficiente per neutralizzare ml di sangue fetale. Per monitorare la concentrazione degli anticorpi nel corso della gravidanza si esegue l analisi della titolazione anticorpi. Lo scopo del mio lavoro di diploma è quello di fare un confronto tra il metodo ID-Gel (in uso presso ST CRS SI) e il metodo in provetta (raccomandato da ISBT), trovare i fattori influenzanti per quest analisi e valutare quale valore diagnostico ha al giorno d oggi. MATERIALE E METODI L analisi della titolazione anticorpi è stata eseguita su 95 campioni (sangue EDTA) di donne in gravidanza: 82 con anti-d da profilassi, 10 anti-d immune e 3 altri alloanticorpi. Per ogni campione l analisi è stata determinata con 2 metodi: metodo ID-Gel (Diamed) con ID-Diluent 2 (LISS) per le diluizioni geometriche e metodo in provetta (Biotest) con soluzione isotonica Immusol (Medion Diagnostics); i tempi di incubazione sono diversi (15 min metodo ID-Gel; 1 ora metodo in provetta); si è constatato che i i risultati ottenuti con queste 2 metodiche non sono riproducibili. Per questo motivo si è modificato il metodo ID-Gel e come soluzione di diluizione si è deciso di utilizzare la soluzione isotonica Immusol. RISULTATI E CONCLUSIONI: Con questo lavoro si è potuto dimostrare che il metodo ID-Gel, con la soluzione isotonica Immusol, per la titolazione anticorpi fornisce dei risultati paragonabili al metodo in provetta raccomandato dalle normative internazionali ISBT. I risultati ottenuti mostrano una buona riproducibilità che al massimo evidenziano una differenza di una diluizione tra i due metodi soprattutto per i risultati con titolo basso (1 o 2). Utilizzando questa nuova metodica ID-Gel con Immusol resta valido il riferimento al valore limite definito per l anticorpo immune anti-d titolo 16. Questo metodica è già entrata in applicazione presso ST CRS SI, rispettando così gli standard internazionali. INTRODUCTION The hemolytic disease of the newborn is a disease where the fetus erythrocytes are destroyed by specific antibodies that are produced after the alloimmunization in the mother (antigen absent in the mother s erythrocytes). These antibodies are directed against fetus erythrocytes, and we can see this situation in pregnancy or immediately after the birth. Antenatal screening tests are very important for the prevention of the onset of hemolytic disease of the newborn. Gynecologists recommendations say that all Rh negative woman (without alloantibody anti-d) in the 28 week of pregnancy and in the 72 hours after the birth, must receive prophylaxis anti-d (300 μg in 2 ml), enough to neutralize ml of fetal blood. For the monitoring of the concentrations of antibody during pregnancy, we must do an alloantibody titration. The aim of my diploma study was to compare the method ID-Gel, in use at ST CRI SI (Transfusion Service CRS Italian Switzerland) and the tube method recommended by ISBT (International society of blood transfusion), find the interference factors for this analysis and evaluate the current diagnostic value. MATERIALS AND METHODS 95 plasma (EDTA) samples were analyzed for the alloantibody titration in pregnant woman: 82 with anti-d from prophylaxis, 10 with immune anti-d and 3 with other alloantibodies. All the samples were determined with the following 2 methods: method ID-Gel (DiaMed) with ID-Diluent 2 (LISS) for the geometric dilutions and tube method (Biotest) with isotonic solution Immusol (Medion Diagnostics); the incubation times were different (15 min for the method ID-Gel and 1 hour for the tube method). It was deduced that the 2 methods are not reproducible. For this reason the method ID-Gel was modified and the isotonic solution Immusol was used as dilution solution. RESULTS AND CONCLUSION With this diploma study it was demonstrated that the method ID-Gel, with isotonic solution Immusol, for antibody titration gives the same results as the tube method recommended by the international norms of ISBT. The results that we obtained have very good reproducibility, which gives a maximum difference of one dilution between the two methods for the results with a low title (1 or 2). Using this new method, ID-Gel with Immusol remains valid with reference to the significant value for the antibody immune anti-d title 16. This method is already in use at ST CRS SI, thus respecting international standards. 2

4 2. INTRODUZIONE 2.1) Morbo emolitico del neonato (MEN) Il Morbo emolitico del neonato (in seguito MEN) é una malattia caratterizzata dalla distruzione di eritrociti del feto ad opera di anticorpi specifici, che si sono formati nella madre dopo un processo di alloimmunizzazione (antigene assente dagli eritrociti materni), diretti contro eritrociti fetali; questa situazione si può osservare durante la gravidanza o subito dopo il parto. Questa malattia viene anche denominata eritroblastosi fetale in quanto l accelerata distruzione degli eritrociti stimola un aumentata produzione da parte del midollo osseo, con la conseguenza che molti di questi eritrociti entrano in circolazione ancora in uno stadio prematuro come cellule nucleate ) Condizioni necessarie per lo sviluppo di un MEN 1) L antigene responsabile deve essere immunogenico. 2) L antigene deve essere ben sviluppato sia nel feto che nel neonato. 3) L antigene deve trovarsi essenzialmente sulla superficie degli eritrociti. 4) Gli anticorpi prodotti dalla mamma devono poter passare la placenta (ricettore del frammento Fc delle IgG sulla placenta). 5) La mamma si deve essere immunizzata in precedenza: risposta immunitaria secondaria o anamnestica per gravidanze o trasfusioni precedenti o nel corso della stessa gravidanza. Gravidanze o trasfusioni precedenti: risposta immunitaria primaria per incompatibilità antigenica degli eritrociti con cui la mamma è entrata in contatto. Nel corso della stessa gravidanza: l immunizzazione fa seguito a trasfusioni transplacentari. Al parto è il momento dove si verificano micro-trasferimenti feto-placentari di maggiore importanza, durante il quale si stima che circa 30 ml di sangue fetale passano nella circolazione materna ) Immunizzazione materna Nel corso di una prima immunizzazione non si hanno problemi dell insorgere di un MEN perché essendo una risposta immunologica primaria vengono prodotti anticorpi della classe IgM che non passano la placenta. La malattia emolitica insorge invece in occasione di un secondo contatto della madre con l antigene in questione; questo causa una risposta immunologica secondaria di tipo anamnestico con la produzione di anticorpi della classe IgG. Questi anticorpi IgG si fissano sulla membrana degli eritrociti fetali (sensibilizzazione) e ne determinano la distruzione nella milza (recettore per il frammento Fc sulla membrana dei macrofagi) provocando un emolisi. 3

5 Come conseguenza all emolisi fetale si ha un aumentata formazione dei prodotti del catabolismo dell emoglobina (soprattutto bilirubina), ma fino a quando il feto si trova nell utero non insorgono gravi problemi, perché la bilirubina viene eliminata per via transplacentare. Il problema è l incremento dei valori della bilirubina subito dopo il parto, perché il neonato non ha ancora la capacità di smaltire la bilirubina tramite il fegato (ancora immaturo). Figura 1 : grafico della risposta immunitaria. Per una risposta primaria servono 0,1 ml di sangue per stimolare il sistema immunitario a produrre alloanticorpi anti-d; per la produzione di altri alloanticorpi antieritrocitari è necessaria invece una quantità maggiore di sangue. Per la risposta immunitaria di tipo anamnestico sono invece sufficienti solamente 0,03 ml di sangue per stimolare il sistema immunitario a produrre alloanticorpi immuni IgG. [2] Nella figura 1 si nota una distinzione tra anticorpi anti-d ed altri anticorpi. Il MEN, può essere suddiviso infatti in 3 categorie: 1) MEN da anti-d; 2) MEN da altri anticorpi Rh o altri sistemi; 3) MEN da incompatibilità ABO ) Valutazione prenatale I test di screening prenatali sono molto importanti nel monitoraggio di una gravidanza a rischio per la prevenzione di un MEN. Al più tardi al termine del 1 trimestre, a tutte le donne in gravidanza, deve essere eseguito uno screening anticorpi e la determinazione completa del gruppo sanguigno. Il titolo anticorpale determinato nel corso del 1 trimestre funge da paragone con le titolazioni successive (determinate in doppio con plasma congelato in precedenza, stessa metodica e eritrociti test con medesimo fenotipo). Il titolo critico per un alloanticorpo anti-d è per definizione 16 (metodo in provetta). Alla 28 a settimana di gravidanza si deve eseguire un 2 screening anticorpi; se negativo, alle donne Rh negative si procederà con la somministrazione della profilassi anti-d (vedi capitolo 2.2.1). 4

6 In caso di presenza di alloanticorpi si consiglia un monitoraggio mensile del titolo anticorpale, questo non significa però che per forza si svilupperà un MEN. Per verificare la possibilità concreta che si sviluppi realmente un MEN si potrebbero eseguire le seguenti indagini: tipizzazione del feto tramite PCR di DNA ottenuto dal liquido amniotico/villi coriali (tecnica invasiva); amplificazione di DNA fetale presente nel plasma materno [18]; tipizzazione del papà. A causa dei rischi e dei costi dovuti da questo tipo di indagini, il monitoraggio del titolo anticorpale nel plasma resta l analisi meno invasiva e più facile da praticare. Resta però il fatto che il significato del titolo in gravidanza è controverso, in quanto esiste poca correlazione tra il titolo e gli effetti sul feto o neonato; il titolo anticorpale deve essere interpretato in relazione all alloanticorpo identificato e sull arco della gravidanza stessa: un aumento del titolo fornisce l indicazione di un immunizzazione in corso. una diminuzione del titolo anticorpale, in particolare degli anticorpi anti-d da profilassi, indica un consumo di questi anticorpi e da l indicazione alla ripetizione della profilassi anti- D, per fare in modo che la madre risulti ancora protetta. In caso di sospetto reale di MEN si deve obbligatoriamente informare il ginecologo per procedere a una sorveglianza più stretta della gravidanza ) Sorveglianza neonatale Nei neonati in cui si è sviluppato il MEN (in casi gravi si deve procedere con un exanguino trasfusione allegato 15) o in cui il rischio di MEN è molto elevato è importante prelevare al parto un campione di sangue dal cordone ombelicale per la determinazione di emoglobina, ematocrito, reticolociti e eritroblasti. Si consiglia di eseguire l analisi su sangue del cordone, perché pochi minuti dopo la nascita, una quantità di sangue variabile si trasferisce dalla placenta al bambino, rendendo difficile l interpretazione del valore dell emoglobina (Figura 2). Figura 2 : misurazione emoglobina post-parto. I cambiamenti della concentrazione di emoglobina in seguito al trasferimento del sangue placentare tendono a mascherare anemie di media gravità nei neonati. Nel caso illustrato, un neonato con MEN ha un emoglobina misurata su sangue del cordone con una concentrazione inferiore alla media, ma dopo la nascita la concentrazione di emoglobina si presenta come quella di un neonato sano. [3] 5

7 Oltre ai parametri ematologici, sul campione di sangue dal cordone si eseguono anche le seguenti analisi determinazione del gruppo sanguigno (solo antigeni eritrocitari). Coombs diretto: se positivo richiedere un campione di sangue capillare per confermare il risultato (escludere i falsi positivi) e proseguire eventualmente con le indagini: eluizione (allegato 10) con conseguente identificazione dell anticorpo che provoca emolisi (non si tratta di un auto-anticorpo ma di un alloanticorpo IgG di provenienza materna). In casi acuti di MEN, il Coombs diretto del neonato può anche risultare negativo, in quanto gli eritrociti sensibilizzati sono stati tutti distrutti (forte emolisi; emoglobina fortemente diminuita; rischio vitale). I risultati ottenuti con il sangue del neonato devono essere obbligatoriamente confermati nel sangue materno. 2.2) La profilassi anti-d L antigene D è il più immunogenico e il più pericoloso in caso di MEN, per la severa emolisi che alloanticorpi immuni anti-d materni possono provocare nel bambino. La frequenza di un alloimmunizzazione per una madre Rh negativa con un feto Rh positivo, senza nessun trattamento profilattico, è del 16% di cui: Tabella 1: percentuali di immunizzazione [1] % Alloimmunizzazione 1,5 2 % Sensibilizzate durante la 1 gravidanza 7 % Nei 6 mesi successivi al parto 7 % Nel corso nella 2 gravidanza Rh incompatibile Un metodo per evitare l insorgere di questa grave patologia esiste ed è la profilassi anti-d. La profilassi anti-d (Rhophylac300 ditta CSL Behring AG, Berna) consiste in immunoglobuline umane IgG anti-d prodotte da persone volontarie (generalmente uomini) Rh negative alle quali viene iniettata una dose di antigene D tale da stimolare il sistema immunitario a produrre immunoglobuline. Oltre agli anticorpi anti-d il medicamento Rhophylac 300 (Figura 3) può anche contenere altri anticorpi Rh in piccole quantità come ad esempio anti-c. La dose standard iniettata è 300 μg di immunoglobuline in 2 ml di soluzione. Esistono 2 vie per la somministrazione: Iniezione intravenosa: il 100% della dose si trova nel circolo sanguigno materno immediatamente dopo la somministrazione. Iniezione intramuscolare: il titolo delle immunoglobuline aumenta lentamente; il valore massimo lo si raggiunge dopo 2-4 giorni dalla somministrazione. 6

8 La dose di 300 μg di IgG anti-d sono sufficienti per neutralizzare ml di eritrociti fetali Rh postivi che corrispondono a circa ml di sangue fetale. La presenza di anti-d da profilassi nel plasma della paziente è visibile fino a circa 6 mesi dopo il parto. Figura 3: Rhophylac 300 ditta Behring [10] 2.2.1) A chi e quando viene somministrata la profilassi anti-d La profilassi anti-d prenatale è generalmente raccomandata alla 28 a settimana di gravidanza a tutte le donne in gravidanza Rh negative, con una ricerca anticorpi negativa (la paziente non deve già possedere un alloanticorpo anti-d immune), compreso D parziale e D weak esclusi i tipi 1, 2 e 3. La ricerca anticorpi anti-eritrocitari va eseguita al controllo del primo trimestre e alla 28 a settimana di gravidanza. La profilassi è anche indicata post-parto in tutte le donne Rh negative che hanno partorito un bambino Rh positivo. È per questo motivo che viene richiesta l analisi del gruppo sanguigno del neonato per questa categoria di mamme. Le immunoglobuline anti-d devono essere somministrate nelle 72 ore che seguono il parto; in caso di dimenticanza la profilassi post-natale può essere eseguita fino a 14 giorni dopo il parto ) Meccanismo d azione della profilassi anti-d Le IgG anti-d della profilassi si legano ad eventuali eritrociti Rh positivi del feto presenti nel circolo sanguigno materno; così facendo si viene a formare un complesso antigene-anticorpo che viene eliminato, al prossimo passaggio, dalla milza. I macrofagi presenti nella milza, avendo sulla loro membrana dei recettori per il frammento Fc delle immunoglobuline, riconoscono l anticorpo legato all eritrocita e lo sequestrano con il processo della fagocitosi ) Causa di alloimmunizzazione La principale causa del fallimento della profilassi anti-d post-parto è rappresentata dall alloimmunizzazione prima del parto che può verificarsi in circa lo 0,7-1,8% delle donne con gravidanze a rischio; la combinazione di somministrazione di una profilassi anti-d prima del parto alla 28 settimana di gravidanza e di una post-parto, riducono l incidenza di contrarre un MEN fino allo 0,2%. 7

9 2.3) La titolazione anticorpi In gravidanza la titolazione anticorpi è eseguita per identificare donne con un significativo livello di anticorpi che può portare a sviluppare un MEN. La titolazione anticorpi è un analisi eseguita con una tecnica non invasiva (prelievo di sangue) sul plasma della madre. Mediante una serie di diluizioni geometriche si arriva a definire la quantità di anticorpo presente nel plasma con un valore definito come titolo anticorpale. Il titolo anticorpale è un valore di non semplice interpretazione perché non è direttamente proporzionale a conseguenze che potrebbero manifestarsi nel feto: un valore alto del titolo non significa per forza l insorgere di un MEN, come un titolo di valore basso può invece causare un MEN grave. Il valore del titolo acquisisce importanza in relazione all alloanticorpo specifico identificato nel plasma materno. 2.4) Scopo del lavoro di diploma Il progetto mira a confrontare due metodi per la titolazione degli alloanticorpi: Metodo in GEL: attualmente utilizzato presso il Servizio Trasfusionale CRS Svizzera Italiana (in seguito ST CRS SI). Il laboratorio di immunoematologia del ST CRS SI, utilizza come metodo di riferimento per le analisi il sistema ID-Gel (Diamed). L analisi della titolazione anticorpi è conseguente a una ricerca anticorpi positiva in una gestante; siccome la ricerca anticorpi è eseguita con metodo Gel, si è deciso di proseguire con questo metodo anche per la titolazione anticorpi per mantenere la sensibilità del metodo. A supporto di questo metodo non normalizzato applicato dal ST CRS SI, sta il fatto che il valore del titolo anticorpale acquisisce rilevanza sull arco della gravidanza e non come valore a sé stante; interessa la tendenza e non il singolo valore. Metodo in provetta: non in uso presso ST CRS SI ma raccomandato dalle normative internazionali International Society Blood Transfusion (ISBT): società internazionale fondata nel 1935 che coinvolge professionisti della medicina trasfusionale di 95 paesi. [19] Le normative internazionali ISBT, definiscono come metodo di riferimento il metodo in provetta con soluzione salina e fornisce come valore di riferimento per l anticorpo anti-d immune un titolo 16. Queste normative sconsigliano, per la pratica di questa analisi, l utilizzo del Gel e di soluzioni che potenziano e accelerano la reazione antigene anticorpo, perché forniscono dei valori falsamente aumentati, rispetto alla reale situazione in vivo. La tecnica GEL ha sostituito nell ultimo decennio la tecnica in provetta, riducendo i tempi d analisi, fornendo una tecnica di lavoro più semplice ed igienica, apportando una maggior sensibilità nelle analisi di immunoematologia e permettendo di identificare anticorpi che in provetta sarebbero stati di difficile individuazione, ma al tempo stesso ha portato con sé anche un numero maggiore di reazioni non specifiche che interferiscono con i risultati stessi. Si è a conoscenza che i due metodi di lavoro forniscono valori del titolo che non coincidono, proprio per la differente sensibilità dei metodi. 8

10 A questo punto le domande sono: perché gli standard internazionali non modificano la metodica di referenza per questa analisi? O per lo meno perché non danno indicazioni sul metodo di esecuzione della titolazione anticorpi in Gel? Si può dimostrare che la metodica in GEL è utilizzabile per questa analisi? Quali accorgimenti si possono adattare per ottenere la riproducibilità dei risultati con entrambi i metodi? Una volta concluso lo studio tra le due metodiche si dovrà scegliere quale metodo utilizzare in futuro presso il ST CRS SI. 2.5) Obiettivi Per raggiungere lo scopo di questo lavoro sono stati posti i seguenti obiettivi: Valutare i risultati ottenuti con le due metodiche di lavoro proposte e decidere quale metodo utilizzare presso il ST CRS SI. Da un lato tenendo presente le conseguenze che un cambiamento può portare dell interpretazione del risultato da parte dei ginecologi, dall altro se si decide di mantenere la medesima metodica Gel si avrà a supporto una serie di dati e un analisi accurata per descrivere perché non vengono seguite le normative internazionali ISBT. Tutto ciò risulta importante per un laboratorio accreditato come quello del ST CRS SI per poter dimostrare le motivazioni della messa in applicazione di un metodo non normalizzato. In questo senso il lavoro di diploma funge anche da validazione del metodo di analisi. Valutare i possibili fattori che influenzano (tecnici ed umani) l esecuzione di questa analisi e riproducibilità dei risultati per metodica di lavoro. Verificare quale significato viene attribuito dai ginecologi al valore del titolo anticorpale al giorno d oggi e quali altre misure vengono messe in atto al fine della prevenzione del MEN. 9

11 3. MATERIALE E METODI 3.1) Materiale generale 3.1.1) Plasma Il materiale utilizzato per l esecuzione di questo confronto tra metodi è plasma anticoagulato con EDTA (acido etilendiamminotetracetico Figura 4) di donne in gravidanza conosciute per la presenza di anticorpi anti-d da profilassi o alloanticorpi immuni. A B Figura 4: provette con anticoagulante EDTA: A centrifugata e B non centrifugata [12] Per evitare una diluizione degli anticorpi sono sconsigliati i prelievi da accessi venosi con infusione e l utilizzo di citrato come anticoagulante ) Criteri per l accettazione del prelievo Sulla provetta e sulla richiesta d analisi devono essere riportati: nome, cognome, data di nascita completa, data/ora del prelievo e firma dell esecutore/trice del prelievo. L identificazione corretta delle provette è un processo molto importante che deve essere eseguito con molta attenzione al fine di evitare scambi di provetta/paziente. Per poter iniziare con le analisi si deve centrifugare la provetta a 3000 rpm per 8 minuti per permettere la separazione del plasma dalla parte corpuscolata del sangue (eritrociti, trombociti e leucociti); il plasma viene poi separato in un altra provetta pronto per essere utilizzato ) Selezione eritrociti La quantità di punti antigenici è un fattore variabile che può influenzare il risultato di un titolo anticorpale, di conseguenza è fortemente raccomandato l utilizzo di eritrociti con il medesimo fenotipo nel corso del monitoraggio in gravidanza. 10

12 ) Titolo anti-d Per la titolazione di alloanticorpi anti-d o da profilassi si utilizzano preferibilmente eritrociti con fenotipo ccd.ee (R 2 R 2 ), perché si ritiene sia quello con un numero più elevato di antigeni D sulla superficie eritrocitaria (15'800 33'300). [2] Gli eritrociti con questo particolare fenotipo (frequenza 2%) vengono scelti tra la popolazione dei donatori di sangue completamente tipizzati ) Titolo altri alloanticorpi Per la titolazione di altri alloanticorpi vengono selezionati eritrociti dove l antigene corrispondente all alloanticorpo da titolare è presente in forma omozigote. Solitamente vengono utilizzati eritrociti presenti nei pannelli della ditta DiaMed per la ricerca anticorpi; come alternativa si possono utilizzare eritrociti da donatori tipizzati ) Materiale tecnico ) Centrifuga lava globuli metodo provetta La centrifuga lava globuli (DAC III - ditta Medion Diagnostics GmbH, Düdingen) viene utilizzata per il lavaggio degli eritrociti. Si utilizzano delle provette in vetro dove sono contenuti gli eritrociti da lavare e la diluizione del plasma del paziente. Gli eritrociti vengono lavati con dei processi di risciacquo, centrifugazione e risucchio ) Incubatore metodo provetta + Gel L incubatore (ID-Incubator 37 SI ditta DiaMed AG, Cressier) viene utilizzato per mantenere provette e cartine ad una costante temperatura di 37 C (metodo in provetta 1 ora; metodo in gel 15 minuti) ) Centrifuga per cartine metodo Gel Questa centrifuga (ID-Centrifuge 12 S ditta DiaMed AG, Cressier) è appositamente creata per la centrifugazione delle cartine DiaMed (tempo centrifugazione 10 minuti; rpm variabili a seconda del tipo di centrifuga). 3.2) Materiale metodo in provetta 3.2.1) Siero polispecifico di Coombs Il siero polispecifico di Coombs (Anti-Human-Globulin Color ditta Biotest AG, Rupperswil Figura 5) è un preparato composto da antiglobuline umane ottenute in seguito all iniezione di immunoglobuline umane a un coniglio, il quale produce degli anticorpi della classe IgG antiimmunoglobuline e frazioni del complemento. Nel siero polispecifico di Coombs (Biotest) si trovano anticorpi IgG anti-igg (di coniglio) e IgM anti- C3d (di topo). 11

13 Il siero polispecifico di Coombs viene utilizzato per il test di Coombs diretto (DAT allegato 13) e indiretto (IAT). Figura 5: siero polispecifico di Coombs ditta Biotest [16] 3.2.2) Coombs-Control (Coombscell-E ditta Biotest) Il Coombs-Control (Coombscell-E ditta Biotest AG, Rupperswil Figura 8) è una sospensione di eritrociti sensibilizzati con anticorpi IgG e viene utilizzata per il controllo tecnico del procedimento, in caso di risultati negativi nel test di Coombs diretto o indiretto. Figura 8: Coombscell-E ditta Biotest [16] In caso di risultato negativo, si presuppone che gli anticorpi antiglobuline umane del siero polispecifico di Coombs siano liberi nella sospensione; con l aggiunta del Coombs-Control questi anticorpi si legano agli eritrociti sensibilizzati della sospensione di controllo, provocando agglutinazione. 12

14 3.2.3) Soluzione salina La soluzione salina (Immusol - ditta Medion Diagnostics GmbH, Düdingen, CH) è una soluzione di sodio azoturo allo 0,4% con un ph stabile a 7,3 ± 0,2 (raccomandazioni indicano un ph tra 7,0 e 7,5). [5] È utilizzata per il lavaggio degli eritrociti, diluizioni geometriche del plasma e per la preparazione delle sospensioni eritrocitarie. 3.3) Materiale metodo in gel 3.3.1) ID-Diluent 2 L ID-Diluent 2 (ditta DiaMed AG, Cressier - Figura 9), chiamato LISS (Low Ionic Strength Solution), é una soluzione a bassa forza ionica che aumenta il tasso di associazione degli eritrociti accentuando così le reazioni antigene-anticorpo, permettendo di diminuire il tempo di incubazione. Questa soluzione è stata studiata per la preparazione di sospensioni di eritrociti. In questo test viene usata una sospensione allo 0,8%. Figura 9: ID-Diluent 2 (LISS) [13] 3.3.2) Cartina gel LISS/COOMBS La cartina LISS/Coombs (ditta DiaMed AG, Cressier - Figura 10) è formata da 6 microprovette contenenti antiglobulina umana polispecifico (anti-igg e anti-c3d) nella matrice del gel. Figura 10: cartina Diamed GEL/Coombs [16] 13

15 In caso di risultato positivo gli eritrociti agglutinati formano una linea rossa sulla superficie del gel o sono distribuiti nel gel; con un risultato negativo si ottiene un bottone compatto di eritrociti sul fondo della microprovetta (Figura 11). 3.4) Metodi Figura 11: esempio positivo e negativo della reazione in gel [15] 3.4.1) Principio dell analisi del test di Coombs indiretto Con questo test si ricerca la presenza di anticorpi liberi nel siero del paziente. Il test si basa sul principio dell emoagglutinazione. L antiglobulina umana agisce come ponte di legame tra gli anticorpi (Figura 6) o fattore C3d del complemento degli eritrociti vicini e ne provoca l agglutinazione (Figura 7). Gli eritrociti che non sono sensibilizzati non si agglutinano. Figura 6: eritrociti sensibilizzati con IgG [15] Figura 7: siero polispecifico di Coombs (in verde) [15] L analisi della titolazione anticorpi è basata sul principio del test di Coombs indiretto in gel e provetta. 14

16 3.4.2) Principio dell analisi della titolazione anticorpi La titolazione anticorpi è un metodo semi-quantitativo per determinare la concentrazione di anticorpi. Si preparano delle serie di diluizioni geometriche per testare la reattività degli anticorpi. Il titolo corrisponde all ultima diluizione che mostra una reazione di 1+ (Esempio: diluizione 1:16; titolo 16). Il valore limite del titolo anticorpale è stato stabilito solo per alloanticorpi immuni anti-d (metodo in provetta): un titolo 16 è considerato significativo e necessita di successivi controlli ) Titolazione anticorpi anti-eritrocitari in PROVETTA Dopo un periodo di incubazione a 37 C tra il plasma del paziente diluito (serie di diluizioni geometriche) e la sospensione di eritrociti selezionati, si procede con una serie di lavaggi per togliere tutto ciò che non si è legato: proteine del plasma, paraproteine, più eventuali anticorpi non legati, per evitare risultati falsi positivi. Viene poi aggiunto il siero polispecifico di Coombs per identificare l eventuale presenza di eritrociti sensibilizzati. Nel caso di una reazione negativa, il bottone di eritrociti formatosi sul fondo della provetta dopo centrifugazione, si scioglie facilmente con delle leggere scosse alla provetta. Il titolo anticorpale corrisponde all ultima agglutinazione del plasma diluito visibile microscopicamente con un ingrandimento 20x. In caso di risultato negativo si deve procedere con l aggiunta del Coombs-Control. Figura 12: test di Coombs indiretto [14] 15

17 Procedura: [11] 1. Preparare delle diluizioni geometriche del plasma con Immusol Tabella 2: diluizioni geometriche del plasma Diluizione 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 Immusol μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Plasma 100 μl 100 μl Trasferire 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 2. Preparare la sospensione eritrocitaria al 2% con eritrociti selezionati (1000 μl Immusol + 20 μl eritrociti) 3. Pipettare 100 μl di sospensione in ogni provetta 4. Incubare 1 ora a 37 C (ID-Incubator 37 SI) 5. Lavare gli eritrociti per 3 volte (DAC III) 6. Aggiungere 2 gocce di siero polispecifico di Coombs 7. Centrifugare 20 secondi a 3000 rpm 8. Esaminare il risultato macroscopicamente e microscopicamente (ingrandimento 20x) 9. Ad ogni reazione negativa aggiungere una goccia di Coombscell-E e centrifugare: risultato positivo (agglutinazione) indica che il test con il siero polispecifico di Coombs è realmente negativo. risultato negativo (nessuna agglutinazione) significa che si è verificato un errore tecnico nell esecuzione del test (p.es. lavaggio insufficiente degli eritrociti) ) Titolazione anticorpi anti-eritrocitari in GEL Il seguente metodo è attualmente in uso presso il ST CRS SI. In una prima fase vengono messi a contatto il plasma del paziente diluito (serie di diluizioni geometriche) con eritrociti test (selezionati sulla base dell anticorpo che si vuole titolare); dopo un periodo di incubazione a 37 C si centrifuga la cartina Gel. Durante la fase di centrifugazione eventuali eritrociti sensibilizzati vengono a contatto con il siero polispecifico di Coombs, il quale provoca la formazione di una macromolecola che ha difficoltà a precipitare tra le maglie del GEL e da luogo ad una reazione positiva. 16

18 Una reazione negativa significa che gli eritrociti test non sono stati sensibilizzati e quindi l assenza di alloanticorpi di importanza clinica (gli eritrociti precipitano sul fondo del micro-pozzetto). Ultimo risultato positivo visibile con 1+. Figura 13: serie di diluizioni con ultimo risultato 1+ [16] Procedura 1 diluizione con ID-Diluent 2 (LISS): 1. Preparare delle diluizioni geometriche del plasma con ID-Diluent 2 (LISS): Tabella 3: diluizioni geometriche del plasma Diluizione 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 ID- Diluent2 Plasma 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Trasferire 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 2. Preparare la sospensione eritrocitaria allo 0,8% con ID-Diluent 2 (1000μl ID-Diluent μl eritrociti) utilizzando eritrociti selezionati 3. Pipettare 50 μl di sospensione eritrocitaria in ogni pozzetto (cartina LISS/Coombs) 4. Aggiungere 25 μl delle rispettive diluizioni 5. Incubare 15 minuti a 37 C (ID-Incubator 37 SI) 6. Centrifugare 10 minuti (ID-Centrifuge 12 S) 7. Leggere e protocollare i risultati 17

19 Procedura 2 diluizione con Immusol: La metodica è identica alla procedura 1 con un'unica modifica: le diluizioni geometriche e la sospensione eritrocitaria allo 0,8% vengono eseguite con Immusol e non con ID-Diluent ) Possibili fattori influenti sui risultati d analisi I fattori che possono influenzare questa analisi possono essere dovuti a problemi tecnici e di materiale: Metodo gel: Cartine che presentano bolle d aria o gocce di gel nella parte superiore del micro pozzetto devono essere centrifugate prima dell uso. Eventuali residui di fibrina possono aderire agli eritrociti non agglutinati e farli apparire come una sottile linea rossa sulla superficie del gel (falso positivo). Metodo provetta: Il risultato del test deve essere letto immediatamente dopo la centrifugazione in quanto l eventuale legame antigene-anticorpo, formatosi in seguito all aggiunta del siero di Coombs, è un legame piuttosto debole e tende a dissociare rapidamente per effetto osmotico: antigene/anticorpo antigene+anticorpo. Metodo gel + provetta: Una sospensione di eritrociti troppo concentrata o troppo diluita può causare reazioni anomale. È importante utilizzare eritrociti con lo stesso fenotipo (per mantenere approssimativamente il numero di punti antigenici) per un confronto corretto con il plasma analizzato precedentemente. Eritrociti vecchi sono da evitare per un problema di emolisi e di perdita di micro particole della membrana, che portano alla perdita di numerosi punti antigenici. Altri fattori influenzanti sono dovuti a fattori umani, non tutti/e i/le tecnici/che in analisi biomediche lavorano nello stesso modo; ci possono essere delle piccole differenze a livello di: Tecnica di diluizione - Diluizioni geometriche - Sostituzione puntale nella serie di diluizione - Preparazione della sospensione eritrocitaria Lettura ed interpretazione del titolo anticorpale. Risospensione non adeguata del plasma precedentemente congelato 18

20 4. RISULTATI Per il confronto tra i due metodi sono stati analizzati 82 campioni di donne in gravidanza alle quali è stata somministrata la profilassi anti-d, 10 campioni di donne in gravidanza con un anti-d immune e 3 campioni di donne in gravidanza con altri alloanticorpi (anti-m e anti-e). Le tabelle con i risultati completi delle tre casistiche sono riportate nell allegato 1 e allegato 2. I risultati sono stati rappresentati con degli istogrammi e non con delle linee di tendenza in quanto sono dei risultati valutati per singolo paziente esaminato con i due metodi. Nelle figure 14 e 15 sono rappresentati graficamente i risultati degli 82 campioni di pazienti con anti-d da profilassi analizzati con il metodo in gel con la diluizione in LISS (procedura 1 capitolo 3.4.3) e il metodo in provetta. Figura 14: grafico dei risultati dei campioni da 1 a 41 19

21 Figura 15: grafico dei risultati dei campioni da 42 a 82 Come risulta evidente si nota come i risultati ottenuti siano discordanti tra di loro, le analisi effettuate con il metodo in provetta hanno un titolo di 2-3 diluizioni inferiore al metodo in gel con la diluizione in LISS. Nelle figure 16 e 17 sono rappresentati i risultati degli 82 campioni di pazienti con anti-d da profilassi analizzati con il metodo in gel con Immusol (procedura 2 capitolo 3.4.3) e il metodo in provetta. Figura 16: grafico dei risultati dei campioni da 1 a 41 20

22 Figura 17: grafico dei risultati dei campioni da 42 a 82 A differenza dei grafici nelle figure 14 e 15 si può notare come i risultati ottenuti siano riproducibili tra loro. 22 SDG 25 SDG PARTO 20 SDG Figura 18: decorso di un titolo in una paziente con anti-d immune Figura 19: decorso di un titolo in una paziente con anti-d immune Nelle figure 18 e 19 sono rappresentati i grafici delle uniche due pazienti con un anti-d immune in gravidanza. 21

23 PARTO 20 SDG 17 SDG 25 SDG 13 SDG 35 SDG Figura 20: decorso di un titolo in una paziente con anti-d da profilassi Figura 21: decorso di un titolo in una paziente con anti-d da profilassi Le figure 20 e 21 rappresentano i grafici di due pazienti con somministrazione della profilassi anti- D che sono state monitorate durante la gravidanza. 22

24 5. DISCUSSIONE Come si evidenzia dalle figure 14 e 15 i risultati ottenuti con il metodo gel/liss e con il metodo in provetta sono discordanti e non riproducibili proprio come enunciato nello scopo iniziale del lavoro di diploma. Questo è dovuto sostanzialmente alla differente sensibilità dei metodi utilizzati ed alla soluzione di diluizione utilizzata (LISS o Immusol): infatti come noto la soluzione LISS funge da potenziatore ed acceleratore della reazione antigene-anticorpo. La tecnica d analisi con il metodo gel (matrice) deve la sua maggiore sensibilità al principio di filtrazione su colonna, dove gli eventuali complessi antigene-anticorpo formatisi vengono filtrati in fase di centrifugazione ed intrappolati tra le maglie del gel, dando luogo ad una reazione positiva. Tutto questo non si verifica con il metodo in provetta, dove dopo l ultima centrifugazione la lettura del risultato consiste unicamente nella risospensione degli eritrociti. È inoltre noto che il metodo in gel è più standardizzato, preciso e oggettivo mentre il metodo in provetta é più soggetto alla tecnica individuale di lavoro del/della TAB: scuotimento provette (risultato falsamente negativo) ed interpretazione visiva della reazione a livello macroscopico e microscopico. Attualmente non è raccomandato l utilizzo della tecnica in gel per lo studio della titolazione anticorpi prenatale, per la mancanza di dati che dimostrino una correlazione tra i titoli ottenuti con la tecnica in gel e con la tecnica in provetta [1]. Per questo motivo il mio lavoro di diploma risulta essere una novità in quanto non sono state trovate pubblicazioni riguardanti il paragone dei titoli ottenuti con le tecniche enunciate. Le figure 16 e 17 confermano in pratica quanto viene detto in teoria, cioè che soluzioni di potenziamento della reazione possono aumentare in modo falso il valore del titolo anticorpale non rispecchiando la situazione reale in vivo. I risultati ottenuti con la procedura 2 con l utilizzo dell Immusol come mezzo di diluizione, ci hanno permesso di verificare la riproducibilità dei risultati in rapporto al metodo in provetta, raccomandato dalle normative internazionali ISBT, e di trovare quell accorgimento necessario per dimostrare che la metodica in gel è comunque utilizzabile per questo tipo di analisi. La procedura 1 fornisce dei valori più elevati del titolo rispetto alle altre due procedure, come già descritto precedentemente (Figure e 20-21). Sul piano strettamente medico, questo non cambia però di molto l interpretazione del risultato, per esempio la paziente 1 con la metodica Gel/LISS mostra un aumento del titolo da 4 a 16, mentre con metodo GEL/NaCl e provetta mostra un aumento del titolo da 1 a 8. Con tutte le metodiche si nota un aumento del titolo che a livello medico deve suonare come campanello di allarme e fare in modo che la paziente sia monitorata mensilmente nel corso della gravidanza. In termini di valore definito dalle normative ISBT il titolo di questa paziente è inferiore al valore limite 16. Per quel che concerne la paziente 2 si vede come il titolo determinato con la procedura 1 al parto mostra un aumento di una diluizione (da 64 a 128), mentre con la procedura 2 e metodo in provetta si ha un valore stabile di 32 (comunque sopra il valore limite di 16): in questo caso per la gravidanza in corso non sussistono particolari problemi in quanto la paziente si trova al parto, ma ciò va considerato in un eventuale futura gravidanza, dove, se il bambino dovesse essere Rh positivo, si potrebbe avere una risposta immunitaria di tipo anamnestico (Figura 1), dove una minima dose di antigeni fetali D (0,03 ml di sangue) potrebbero causare una rapida produzione di anticorpi immuni anti-d. 23

25 Facendo un paragone tra le figure 18 e 19, dove sono riportati i titoli di due pazienti con anticorpi anti-d immuni, e le figure 20 e 21, dove sono riportati i titoli di due pazienti con un anti-d da profilassi, si può notare il diverso decorso del titolo anticorpale nel tempo. Il titolo degli anticorpi anti-d immuni rimane costante o tende ad aumentare nel tempo, mentre il titolo degli anticorpi anti-d da profilassi tende a diminuire (o per consumo o per degradazione degli anticorpi). Le normative internazionali ISBT raccomandano un monitoraggio mensile degli anticorpi nel corso della gravidanza ma nel mio lavoro di diploma ho potuto verificare che ciò non è sempre rispettato. Infatti solo i pazienti riportati nelle figure e sono stati regolarmente monitorati; sicuramente i medici sono più sensibili alla presenza di alloanticorpi immuni (Figura 18-19) rispetto alla presenza di anticorpi anti-d da profilassi (Figure 20 e 21) senza curarsi però delle possibili implicazioni come ad esempio un consumo rapido della profilassi anti-d (passaggio di sangue fetale > di ml) che espone a rischio di immunizzazione la paziente a causa di una mancata protezione. Un altro dato che emerge dal mio lavoro di diploma è che i tempi di somministrazione della profilassi (28 a settimana di gravidanza), definiti dalle raccomandazioni dei ginecologi, non sono sempre rispettati (allegato 1 e 2: settimana di gravidanza e data somministrazione profilassi). 24

26 6. CONCLUSIONE L obiettivo principale del lavoro era quello di confrontare il metodo in Gel (in uso presso ST CRS SI) ed il metodo in provetta (raccomandato da ISBT) per verificare la riproducibilità dei risultati ottenuti. Dopo aver modificato la soluzione di diluizione ed aver valutato accuratamente i risultati, si è giunti alla conclusione che il metodo in Gel con l utilizzo di soluzione salina Immusol fornisce gli stessi risultati del metodo in provetta, con al massimo una differenza di una diluizione riscontrata sui valori bassi del titolo (1 e 2) dovuto alla differente sensibilità del metodo. Tutti i campioni sono stati analizzati con l accorgimento adottato nella procedura 2 e sono considerati come base della validazione del metodo non normalizzato della titolazione anticorpale. La nuova metodica ed i risultati ottenuti sono già stati sottoposti agli accreditatori del Servizio di Accreditamento Svizzero (SAS) ed è già stata iscritta nel registro ufficiale delle analisi in applicazione presso il ST CRS SI. Il personale del laboratorio di immunoematologia del ST CRS SI è stato informato e ha compreso le motivazioni che hanno portato all esecuzione di questo lavoro ed in ultima analisi hanno portato alla modifica della metodica per la titolazione anticorpi. Per la TAB l interpretazione dei risultati, ottenuti con la nuova metodica, non porta dei cambiamenti rispetto a quanto praticato precedentemente. Il valore del titolo viene sempre commentato sul referto di analisi, dando indicazioni riguardo alla tendenza (se la paziente ha dei risultati precedenti), e dando raccomandazioni specifiche ai ginecologi sulla tempistica del monitoraggio dell anticorpo identificato. Per quanto concerne l interpretazione dei risultati da parte dei ginecologi, si è giunti alla conclusione, d accordo anche con l accreditatore, di non informarli direttamente tutti, ma di scrivere una frase informativa ( risultato ottenuto secondo nuova metodica allegato 12) direttamente sul referto d analisi nel caso in cui il titolo attuale, determinato con la nuova procedura, dovesse essere diverso dal precedente, determinato con la vecchia procedura. Questo per chiarire degli aumenti o delle diminuzioni del valore del titolo nel corso della stessa gravidanza. Si lascia libera scelta al medico sulla necessità di richiedere ulteriori informazioni in merito. La valutazione dei fattori che possono influenzare il risultato dell analisi, già descritti nel capitolo 3.5, hanno fatto in modo di sensibilizzare ulteriormente il personale di laboratorio, soprattutto per quello che riguarda il fattore umano. Tenendo presente l insieme di questi fattori, all interno del laboratorio è stato deciso di accettare come valida al massimo una differenza di una diluizione tra il controllo del titolo del campione precedente, eseguito in parallelo sul campione odierno e sul campione congelato, ed il risultato precedentemente ottenuto. Nel campo ginecologico (da colloquio avuto con la Dr.ssa Sophie Venturelli) gli anticorpi ai quali viene attribuita un importanza clinica nell ambito di un MEN sono: anti-d, anti-c, anti-c, anti-e, anti-e, anti-kell e anti-duffy. Tra questi anticorpi non risulta l anti-d da profilassi in quanto per i ginecologi non ha importanza clinica: da un lato è risaputo che possono passare la placenta, essendo delle immunoglobuline IgG, causando un emolisi modesta, dall altro si ritiene che un consumo rapido delle immunoglobuline da profilassi iniettate può risultare solo dopo un evento traumatico. Siccome nel mio lavoro di diploma ho notato che la profilassi anti-d non viene sempre somministrata alla 28 a settimana di gravidanza, ho chiesto al ginecologo il perché di questa situazione: mi è stato risposto che ci sono alcuni casi particolari che richiedono una profilassi 25

27 anticipata, come ad esempio prelievo dei villi coriali, amniocentesi, incidenti con traumi e tutti quei casi dove ci potrebbe essere uno scambio di sangue fetale con sangue materno. La regola vuole però che se la profilassi anti-d viene somministrata prima della 28 a settimana di gravidanza deve essere ripetuta ogni 12 settimane. È in questi casi che il ginecologo fa un monitoraggio dell anti-d da profilassi per essere a conoscenza se la paziente è ancora protetta oppure se la profilassi è stata interamente consumata, in questo caso il ginecologo procede con la somministrazione di una nuova dose. Sempre secondo la fonte contattata, in Ticino in caso di sofferenza fetale per un MEN conclamato esistono i seguenti metodi di sorveglianza (allegato 14): Determinazione della bilirubina nel liquido amniotico (curva di Liley). Sonografia doppler per monitorare il cuore che potrebbe essere ingrossato, verificare la presenza di ascite e la velocità media del flusso dell arteria cerebrale media (più veloce è il flusso, più anemico è il bambino). Nei casi gravi la mamma deve essere trasferita in un ospedale universitario per l esecuzione di trasfusioni intra-uterine. In Ticino attualmente la determinazione del DNA fetale nel sangue materno non è ancora in applicazione. Dal colloquio e dalle risposte avute dal ginecologo, è nata un ulteriore analisi della situazione presso il laboratorio di immunoematologia del ST CRS SI, tra la capo settore UMTE (Unità di Medicina Trasfusionale e Emovigilanza) e Dr.Scali (vice primario ST CRS SI), per quanto riguarda le raccomandazioni riportate sul referto di analisi per le donne in gravidanza Rh negative che hanno ricevuto la profilassi anti-d. Visto che questo tipo di anticorpi non è ritenuto di importanza clinica, si è deciso che non verrà più fatta la raccomandazione di monitorare mensilmente il titolo anticorpale, la decisone sarà prettamente di competenza medica. Per quanto concerne la questione costi si è a conoscenza che la tecnica in provetta è più economica della tecnica in gel. Per il ST CRS SI il tutto rimane invariato in quanto la tecnica gel era già precedentemente utilizzata per quest analisi. Come conclusioni personali di questo lavoro posso dire di essere molto soddisfatta dei risultati ottenuti, in quanto la metodica in Gel con la procedura 2 è già entrata in uso presso il ST CRS SI ed è già stata sottoposta ed approvata dagli accreditatori del SAS. È stato un lavoro molto interessante, dove all inizio ci sono stati alcuni problemi dovuti ai risultati non comparabili ottenuti con le prime analisi, ma che si è concluso nei migliore dei modi. Mi ha dato la possibilità di capire il significato di un confronto tra metodi, organizzare il lavoro in modo autonomo e trarne le dovute conclusioni. 26