FT3. FT3 triiodotironina libera. Elecsys 2010 MODULAR ANALYTICS E170 cobas e 411 cobas e 601 cobas e 602
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- Ada Rosalinda Gianni
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1 REF SYSTEM Italiano Finalità d uso Test immunologico per la determinazione quantitativa in vitro della triiodotironina libera nel siero e nel plasma umani. L esecuzione dell ImmunoAssay in ElettroChemiLuminescenza ECLIA è destinata all uso sugli immunoanalizzatori Elecsys e cobas e. Sommario La triiodotironina costituisce uno degli ormoni tiroidei presenti nel siero che regola il metabolismo. La determinazione della concentrazione di questo ormone è importante per la differenziazione diagnostica degli stadi di eutiroidismo, ipertiroidismo ed ipotiroidismo. La maggior parte della triiodotironina totale è legata alle proteine di trasporto (TBG, prealbumina, albumina). La triiodotironina libera (ft3) rappresenta la forma fisiologicamente attiva dell ormone tiroideo triiodotironina (T3). La determinazione della T3 libera comporta il vantaggio di essere indipendente dalle variazioni della concentrazione e delle caratteristiche leganti delle proteine di legame; non è quindi più necessaria la determinazione di un ulteriore parametro di legame (T uptake, TBG). 1,2,3 Il procedimento di test sequenziale e l impiego di un anticorpo marcato riducono la possibilità di interferenze dovute all'eventuale alterazione delle proprietà leganti del siero, come può succedere in determinazioni con un antigene marcato (metodo analogo). 4,5,6,7 Sono disponibili diversi metodi per determinare i livelli di ormoni tiroidei liberi. La zione diretta dell ft4 e dell ft3 con la dialisi all equilibrio o con ultrafiltrazione serve sostanzialmente come metodo di riferimento per la standardizzazione dei procedimenti immunologici impiegati prevalentemente nella diagnostica di routine. 4 La determinazione della triiodotironina libera nel test Elecsys avviene utilizzando un anticorpo specifico anti T3 marcato con un complesso di rutenio a). a) Complesso di rutenio (II) tris(2,2'-bipiridile) (Ru(bpy) ) Principio del test Principio di competizione. Durata complessiva del test: 18 minuti. 1 a incubazione: 15 µl di campione e un anticorpo specifico anti T3 marcato con un complesso di rutenio. 2 a incubazione: dopo l aggiunta di T3 biotinilata e di microparticelle rivestite di streptavidina, vengono occupati i siti di legame ancora liberi dell anticorpo marcato, con formazione di un complesso anticorpo aptene. Il complesso totale si lega alla fase solida mediante l interazione biotina-streptavidina. La miscela di reazione viene aspirata nella cella di dove le microparticelle vengono attratte magneticamente alla superficie dell elettrodo. Successivamente si eliminano le sostanze non legate impiegando ProCell/ProCell M. Applicando una tensione all elettrodo, si induce l emissione chemiluminescente che viene ta mediante il fotomoltiplicatore. I risultati vengono calcolati in base ad una curva di calibrazione, che viene generata in modo specifico per lo strumento con una calibrazione a 2 punti e con una curva master fornita insieme al codice a barre del reattivo. Reattivi soluzioni pronte all'uso Il rack-pack reagenti è contrassegnato con. M R1 Microparticelle rivestite di streptavidina (tappo trasparente), 1 flacone, 12 ml: microparticelle rivestite di streptavidina 0.72 mg/ml; conservante. Anticorpi anti T3~Ru(bpy) (tappo grigio), 1 flacone, 18 ml: anticorpo (pecora) monoclonale anti T3 marcato con un complesso di rutenio 10 ng/ml; tampone fosfato 100 mmol/l, ph 7.0; conservante. R2 Elecsys 2010 MODULAR ANALYTICS E170 cobas e 411 cobas e 601 cobas e 602 T3~biotina (tappo nero), 1 flacone, 18 ml: T3 biotinilata 2 ng/ml; tampone fosfato 100 mmol/l, ph 7.0; conservante. Precauzioni e avvertenze Per uso diagnostico in vitro. Osservare le precauzioni normalmente adottate durante la manipolazione dei reagenti di laboratorio. Lo smaltimento di tutti i rifiuti deve avvenire secondo le direttive locali. Scheda dati di sicurezza disponibile su richiesta per gli utilizzatori professionali. Evitare la formazione di schiuma in tutti i reattivi e tipi di campione (campioni, calibratori e controlli). Utilizzo dei reattivi I reattivi contenuti nella confezione formano un unità inseparabile e sono pronti all uso. Tutte le informazioni necessarie per l utilizzo corretto vengono lette nello strumento dai codici a barre dei rispettivi reattivi. Conservazione e stabilità Conservare a 2 8 C. Non congelare. Conservare la confezione di reattivi Elecsys in posizione verticale in modo da garantire la completa disponibilità delle microparticelle durante il mescolamento automatico prima dell uso. Stabilità: prima dell apertura a 2 8 C dopo l apertura a 2 8 C sugli analizzatori fino alla data di scadenza indicata 12 settimane 6 settimane Prelievo e preparazione dei campioni Solo i tipi di campione elencati di seguito sono stati testati e risultano accettabili. Siero non diluito, prelevato con provette standard per prelievi di campioni o con provette contenenti gel di separazione. Plasma non diluito con litio eparina, K 2 EDTA e K 3 EDTA. Valutazione: recupero % del valore nel siero o slope intercetta < ±2 x limite di sensibilità analitica + coefficiente di correlazione > Stabilità: 7 giorni a 2 8 C, 1 mese a 20 C. 8 Congelare solo 1 volta. I tipi di campione elencati sono stati testati impiegando una selezione di provette per il prelievo di campioni disponibili in commercio al momento dell'analisi; non sono, quindi, state testate tutte le provette disponibili di tutte le case produttrici. Alcuni sistemi per il prelievo di campioni di vari produttori possono contenere diversi materiali e in alcuni casi possono interferire sui risultati del test. Quando si trattano i campioni in provette primarie (sistemi per il prelievo di campioni), seguire le istruzioni del produttore delle provette. I campioni contenenti precipitati devono essere centrifugati prima dell esecuzione del test. Non impiegare campioni inattivati a caldo. Non impiegare campioni e controlli stabilizzati con azide. Assicurarsi che i campioni, i calibratori ed i controlli al momento della siano alla temperatura di C. Per evitare un eventuale evaporazione, analizzare/re i campioni, calibratori e controlli che si trovano sugli analizzatori entro 2 ore. Materiali a disposizione Per i reattivi, vedere la sezione Reattivi soluzioni pronte all'uso. 1 / 5
2 Materiali necessari (ma non forniti) REF , CalSet, per 4 x 1 ml REF , PreciControl Universal, per 2 x 3 ml ciascuno di PreciControl Universal 1 e 2 REF , PreciControl Universal, per 2 x 3 ml ciascuno di PreciControl Universal 1 e 2 (per gli USA) Normale attrezzatura da laboratorio Analizzatore Elecsys 2010, MODULAR ANALYTICS E170 o cobas e Accessori per gli analizzatori Elecsys 2010 e cobas e 411: REF , ProCell, 6 x 380 ml di tampone del sistema REF , CleanCell, 6 x 380 ml di soluzione di lavaggio per celle di REF , SysWash Elecsys, 1 x 500 ml di additivo per l acqua di lavaggio REF , adapter per SysClean REF , AssayCup Elecsys 2010, 60 x 60 coppette di reazione REF , AssayTip Elecsys 2010, 30 x 120 puntali di pipettaggio Accessori per gli analizzatori MODULAR ANALYTICS E170, cobas e 601 e cobas e 602: REF , ProCell M, 2 x 2 L di tampone del sistema REF , CleanCell M, 2 x 2 L di soluzione di lavaggio per celle di REF , PC/CC Cups, 12 coppette per il preriscaldamento di ProCell M e di CleanCell M prima dell'uso REF , ProbeWash M, 12 x 70 ml di soluzione di lavaggio per la conclusione del run ed il lavaggio al cambio di reattivi REF , AssayTip/AssayCup Combimagazine M, 48 supporti da 84 coppette di reazione e 84 puntali di pipettaggio, sacchetti per rifiuti REF , WasteLiner, sacchetti per rifiuti REF , SysClean Adapter M Accessori per tutti gli analizzatori: REF , SysClean Elecsys, 5 x 100 ml di soluzione di lavaggio per il sistema REF , SysClean Elecsys, 5 x 100 ml di soluzione di lavaggio per il sistema (per gli USA) Esecuzione Per una performance ottimale del test, attenersi alle indicazioni riportate nel presente documento per l'analizzatore in questione. Per le istruzioni specifiche dell'analizzatore relative all'esecuzione del test, consultare il manuale d'uso dello strumento. La risospensione delle microparticelle prima dell uso avrà luogo automaticamente. Leggere i parametri test specifici nello strumento dal codice a barre del reattivo. Nel caso eccezionale che non sia possibile leggere il codice a barre, digitare la sequenza di 15 cifre. Portare i reattivi conservati al fresco alla temperatura di ca. 20 C e collocarli nel rotore portareattivi (20 C) dell'analizzatore. Evitare la formazione di schiuma. La regolazione della temperatura esatta, l apertura e la chiusura dei flaconi avranno luogo automaticamente nello strumento. Calibrazione Tracciabilità: il test ( REF ) è stato standardizzato contro il test ( REF ), il quale, a sua volta, è stato standardizzato con la dialisi all'equilibrio. 9 Ogni set di reattivi Elecsys possiede un'etichetta con codice a barre contenente le informazioni specifiche per la calibrazione del rispettivo lotto di reattivo. La curva master preimpostata viene adattata all'analizzatore impiegando l'appropriato CalSet. Frequenza di calibrazione: effettuare una calibrazione per ogni lotto con reattivo fresco (al massimo 24 ore dopo l identificazione della confezione di reattivo sull'analizzatore). Si consiglia di ripetere la calibrazione come segue: dopo 1 mese (28 giorni) se si impiega lo stesso lotto di reattivo dopo 7 giorni (se si impiega la stessa confezione di reattivo sull'analizzatore) all occorrenza: ad es. se un controllo di qualità si trova al di fuori dei limiti definiti Controllo di qualità Per il controllo di qualità, impiegare PreciControl Universal. In aggiunta, è possibile utilizzare altro materiale di controllo appropriato. I controlli per le diverse concentrazioni devono essere eseguiti individualmente almeno 1 volta ogni 24 ore quando il test è in uso, al cambio di ogni confezione di reattivi e dopo ogni calibrazione. Gli intervalli ed i limiti del controllo dovranno essere conformi alle esigenze individuali di ogni laboratorio. I valori ottenuti devono rientrare nei limiti definiti. Ogni laboratorio deve definire delle misure correttive da attuare nel caso che alcuni valori siano al di fuori dei limiti definiti. Per il controllo di qualità, attenersi alle normative vigenti e alle linee guida locali. Calcolo L analizzatore effettua il calcolo automatico della concentrazione dell analita di ogni campione (in, in oppure in ng/dl). Fattori di conversione: x = x = x 0.1 = ng/dl Limiti del metodo interferenze L ittero (bilirubina < 564 µmol/l oppure < 33 mg/dl), l emolisi (Hb < 2.7 mmol/l oppure < 4.3 g/dl), la lipemia (Intralipid < 2000 mg/dl), la biotina (< 409 nmol/l oppure < 100 ng/ml), le IgG < 7 g/dl e le IgM < 1 g/dl non interferiscono sul test. Valutazione: recupero entro ±10 % del valore iniziale. Ai pazienti sottoposti a terapia con alti dosaggi di biotina (>5 mg/die), il campione dovrà essere prelevato almeno 8 ore dopo l ultima somministrazione di biotina. Tra 18 farmaci di frequente impiego, testati in vitro, solo la furosemide a dosaggio terapeutico giornaliero ha provocato valori di ft3 aumentati. Tutte le eventuali interferenze sul comportamento legante delle proteine di legame possono provocare risultati alterati nei test per l'ft3 (ad es. farmaci/droghe, NTI (malattie non tiroidee) o pazienti affetti dall'fdh (ipertiroxinemia disalbuminemica familiare)). 10 Gli autoanticorpi contro gli ormoni tiroidei possono interferire con il test. Anomalie delle proteine leganti riscontrate in pazienti affetti dall'fdh (ipertiroxinemia disalbuminemica familiare) possono, per esempio, provocare valori che sono caratteristici della condizione, ma presentano una deviazione dai valori di riferimento. 11 In casi rari possono riscontrarsi interferenze causate da titoli estremamente alti di anticorpi diretti contro anticorpi specifici anti analita, di anticorpi anti streptavidina o di anticorpi anti rutenio. Tali effetti sono ridotti al minimo attraverso un procedimento appropriato del test. Ai fini diagnostici, i risultati devono sempre essere valutati congiuntamente con la storia clinica del paziente, con gli esami clinici e con altre evidenze cliniche. Limiti ed intervalli Intervallo di oppure (definito dal limite di sensibilità inferiore e dal massimo valore della curva master). I valori al di sotto del limite di sensibilità inferiore vengono indicati come <0.400 oppure < I valori al di sopra dell'intervallo di vengono indicati come >50.0 oppure >32.6. Limiti inferiori di Limite di sensibilità inferiore del test Limite di sensibilità inferiore: oppure Il limite di sensibilità inferiore rappresenta la minima concentrazione bile dell analita che può essere distinta dallo zero. Viene calcolato come il valore che si trova 2 deviazioni standard al di sopra dello standard più basso (calibratore master, standard DS, studio relativo alla ripetibilità, n = 21). 2 / 5
3 Diluizione I campioni per la determinazione dell'ft3 non possono essere diluiti, dato che la T3 nel sangue si trova in una situazione di equilibrio tra forma libera e forma legata a proteine. Ogni cambiamento nella concentrazione delle proteine leganti modificherà questo rapporto di equilibrio. Valori di riferimento La definizione di valori in studi relativi all'intervallo di riferimento avviene principalmente in base a campioni ottenuti da ambulatori, ospedali e laboratori commerciali in cui i livelli di TSH e di ft4 sono risultati nell'intervallo eutiroideo. Tali pazienti spesso presentano malattie non tiroidee, che possono influire sulla funzionalità tiroidea in generale, e specialmente sul livello di ft3. Così possono spiegarsi le differenze osservate durante il confronto degli intervalli di riferimento basati su differenti popolazioni, impiegando lo stesso metodo per l'ft3. Oltre alle differenze locali relative all'assunzione di iodio, lo stato di salute generale dei soggetti coinvolti svolge un ruolo decisivo per i valori di riferimento riscontrati. Il test Elecsys è stato impiegato per determinare gli intervalli di riferimento nei seguenti gruppi di soggetti provenienti da differenti località in Germania: Adulti ( ) 5366 campioni di routine, ottenuti da un laboratorio commerciale situato alla costa tedesca, con concentrazioni di TSH comprese tra 1 e 3 µiu/ml sono stati valutati, mediante un calcolo non parametrico dei centrali limiti del 95 % e dei corrispondenti intervalli di confidenza (IC) al 95 %, per la concentrazione di ft3: Mediana 2.5 del del 97.5 Unità di ( ) 870 campioni prelevati da donatori di sangue apparentemente sani all'età di 20 69, provenienti da un sito nella Germania centrale, sono stati valutati, mediante un calcolo non parametrico dei centrali limiti del 95 % e dei corrispondenti intervalli di confidenza (IC) al 95 %, per la concentrazione di ft3: Mediana 2.5 del del 97.5 Unità di In tali soggetti si sono determinati i seguenti parametri: la concentrazione di TSH, di ft4 e di autoanticorpi anti Tg e anti TPO; il volume e la densità della tiroide, ti mediante ultrasuoni; l'anamnesi del caso particolare, le anamnesi familiare e personale di patologie tiroidee; il sesso, l'età e l'assunzione di iodio; nonché il fumo (o meno) o l'assunzione di contraccettivi orali (o meno). Per i risultati basati su vari differenti criteri di inclusione ed esclusione, si prega di consultare le informazioni separate riportate nel fascicolo Reference Intervals for Elecsys Thyroid Assays ( ) 211 campioni prelevati da pazienti dializzati sono stati ti, in una valutazione multicentrica (studio pilota), con il test Elecsys. I dati rappresentano il 2.5 ed il ( ), mediana: 3.2 oppure campioni prelevati da pazienti con gravi patologie non tiroidee (non thyroidal illness: NTI) sono stati ti, in una valutazione multicentrica (studio pilota), con il test Elecsys. I dati rappresentano il 2.5 ed il Bambini e adolescenti Campioni prelevati da neonati, bambini e adolescenti all'età di fino a 19, caratterizzati come apparentemente sani dagli esperti di un centro medico situato nella Germania centrale: Età N Mediana giorni 2-12 mesi Età N Mediana giorni 2-12 mesi del del Unità di Unità di Per tali soggetti (sia ambulatori che ospedalizzati) sono stati definiti i seguenti criteri di esclusione: nessuna malattia tiroidea precedente o acuta, nessuna anamnesi familiare di patologie tiroidee, nessuna patologia coronarica, nessuna terapia intensiva e nessuna terapia medica postoperatoria. Stato: Adulti: MCE, studio pilota e studio del sito β con il test Elecsys, REF , febbraio 2004, e citazione da MCE Reference Ranges Thyroid, giugno Bambini e adolescenti: studio sugli intervalli di riferimento per i valori tiroidei in bambini, giugno Per ulteriori informazioni relative agli intervalli di riferimento in bambini, adolescenti e donne gravide, consultare il fascicolo Reference Intervals for Children and Adults ; inglese: REF , tedesco: REF Tale fascicolo contiene anche risultati di uno studio dettagliato sui fattori che influenzano i parametri tiroidei, condotto in un gruppo di riferimento di adulti ben caratterizzato. Sono stati applicati differenti criteri di inclusione ed esclusione (ad es. risultati sonografici (volume e densità del tessuto tiroideo) nonché criteri conformi alle linee guida della National Academy of Clinical Biochemistry NACB). Ogni laboratorio deve controllare l applicabilità dei valori di riferimento alla propria popolazione di pazienti e, se necessario, determinare intervalli di riferimento propri. Dati specifici sulla performance del test Qui di seguito sono riportati i dati rappresentativi delle prestazioni sugli analizzatori. I risultati dei singoli laboratori possono differire da questi. La precisione è stata determinata impiegando reattivi Elecsys, pool di sieri umani e controlli, eseguiti in base ad un protocollo modificato (EP5 A) del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute): 6 volte al giorno per 10 giorni (n = 60). sull'analizzatore MODULAR ANALYTICS E170, n = 21. Sono stati ottenuti i seguenti risultati: 3 / 5
4 Camp. Analizzatori Elecsys 2010 e cobas e 411 intermedia Media DS CV DS CV % % SU b) SU SU PC U c) PC U b) SU = siero umano c) PC U = PreciControl Universal Analizzatori MODULAR ANALYTICS E170, cobas e 601 e cobas e 602 Media DS CV % SU SU SU PC U PC U Analizzatori MODULAR ANALYTICS E170, cobas e 601 e cobas e 602 intermedia Media DS CV % SU SU SU PC U PC U Qui di seguito sono riportati i risultati ottenuti dalle zioni di precisione secondo l'nccls (National Committee for Clinical Laboratory Standards), eseguite in un laboratorio francese nell'ambito di uno studio multicentrico effettuato per la valutazione delle prestazioni del test Elecsys. Tali dati rappresentano le prestazioni delle zioni di routine eseguite sull'analizzatore Elecsys 2010 in centri clinici. Analizzatori Elecsys 2010 e cobas e 411 intermedia Media CV CV % % SU SU SU PC U PC U Confronto tra metodi Il confronto del test, REF , (y) con il test, REF , (x), impiegando campioni prelevati da pazienti ospedalizzati, ha prodotto le seguenti correlazioni (): Numero dei campioni ti: 964 Passing/Bablok 12 Regressione lineare y = 0.97x 0.33 y = 1.0x 0.44 τ = r = Le concentrazioni dei campioni erano comprese tra ca e 48.5 (tra ca e 31.6 ). Specificità analitica Per gli anticorpi impiegati sono state riscontrate le seguenti reazioni crociate: L T4: 0.24 %; D T4: 0.40 %; L rt3: n.r. d) ; 3,5 diiodo L tirosina: 0.41 %; acido 3,3',5 triiodotiroacetico: 58.2 %; acido 3,3',5,5' tetraiodotiroacetico: 0.11 %. d) n.r. = non rilevabile Letteratura 1 Wheeler MH, Lazarus JH. Diseases of the Thyroid. London, Glasgow, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras: Chapman and Hall Medical,1994: Pfannenstiel P, Saller B. Schilddrüsenkrankheiten Diagnose und Therapie. Berliner Medizinische Verlagsanstalt GmbH 1995;2:30-32, Fisher DA. Physiological variations in thyroid hormones; physiological and pathophysiological considerations. Clin Chem 1996;42: Klee GG. Clinical usage recommendations and analytic performance goals for total and free triiodothyronine measurements. Clin Chem 1996;42: Surks MI, Chopra IJ, Mariash CN, et al. American Thyroid Association guidelines for use of laboratory tests in thyroid disorders. JAMA 1990;263: Becker DV, Bigos ST, Gaitan E, et al. Optimal use of blood tests for assessment of thyroid function (letter). JAMA 1993;269: Wild D. The Immunoassay Handbook. Stockton Press, 1994: Tietz NW. Clinical Guide To Laboratory Tests. 3rd ed. Philadelphia, Pa: WB Saunders Co, 1995: Method: Nichols Institute, CA, USA. 10 Demers LM, Spencer CA. Laboratory support for the diagnosis and monitoring of thyroid disease. National Academy of Clinical Biochemistry, 2002;Section 3B. 11 Wada N, Chiba H, Shimizu C, et al. A Novel Missense Mutation in Codon 218 of the Albumin Gene in a Distinct Phenotype of Familial Dysalbuminemic Hyperthyroxinemia in a Japanese Kindred. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1997;82(10): Bablok W, Passing H, Bender R, et al. A general regression procedure for method transformation. Application of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry, Part III. J Clin Chem Clin Biochem 1988 Nov;26(11): Per ulteriori informazioni, consultare il manuale d uso appropriato per il relativo analizzatore, i rispettivi fogli di applicazione, la Product Information e le metodiche di tutti i componenti necessari (se disponibili nel vostro paese). In questa metodica, per separare la parte intera da quella frazionaria in un numero decimale si usa sempre il punto. Il separatore delle migliaia non è utilizzato. Simboli Oltre a quelli indicati nello standard ISO , Roche Diagnostics impiega i seguenti simboli: CONTENT SYSTEM Contenuto della confezione Analizzatori/strumenti su cui i reagenti possono essere usati Reattivo Calibratore Volume dopo ricostituzione o mescolamento Le aggiunte o modifiche significative sono indicate mediante una linea verticale posizionata al margine. 4 / 5
5 2013, Roche Diagnostics Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, D Mannheim Distribuzione negli USA: Roche Diagnostics, Indianapolis, IN US Customer Technical Support / 5
CEA. FASE POST-ANALITICA: I dati ottenuti vengono validati tecnicamente poi clinicamente e quindi firmati digitalmente.
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