26. Bioinformatica. contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale

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1 26. Bioinformatica contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale Lo sviluppo delle Biotecnologie ha consentito di elevare la moderna biologia a "Big Science", e l Informatica ha introdotto nei settori delle moderne scienze biologiche una nuova branca di ricerca: la Bioinformatica. (Valle et al., 2003) 1

2 3 The field of science in which biology, computer science and information technology merge into a single discipline Biologists collect molecular data: DNA & Protein sequences, gene expression, etc. Bioinformaticians Study biological questions by analyzing molecular data Computer scientists (+Mathematicians, Statisticians, etc.) Develop tools, softwares, algorithms to store and analyze the data. 4 2

3 Tecnologie del DNA ricombinante Sequenziamento degli acidi nucleici Strumenti informatici immagazzinamento e caratterizzazione dei dati. Bioinformatica Compiti della bioinformatica: 1) Mettere a punto dei sistemi idonei per collezionare ed interrogare l enorme quantità di dati biologici. 2) Progettazione, implementazione ed applicazione di metodi matematico- statistici per: - caratterizzare a livello funzionale le sequenza biologiche, - studiare l evoluzione molecolare - studiare le strutture degli acidi nucleici e delle proteine. 6 3

4 ENORME quantità di dati Databases base pairs (16 Gbp) (NB Genoma umano 3.2 Gbp) che consentono di Comprendere gli aspetti integrativi della biologia degli organismi Correlare la sequenza, la struttura, le interazioni e le funzioni di biomolecole e loro complessi Usare dati contemporanei per dedurre eventi evoluzionistici e prevedere future modificazioni Dare precise indicazioni per la progettazione di molecole bioattive (industria, agricoltura, medicina ) Sequenza Il nuovo dogma Struttura Funzione 4

5 Comparative genomics Annotation Functional genomics Structural genomics 9 Open reading frames Annotation Functional sites Structure, function 10 5

6 CCTGACAAATTCGACGTGCGGCATTGCATGCAGACGTGCATG CGTGCAAATAATCAATGTGGACTTTTCTGCGATTATGGAAGAA CTTTGTTACGCGTTTTTGTCATGGCTTTGGTCCCGCTTTGTTC AGAATGCTTTTAATAAGCGGGGTTACCGGTTTGGTTAGCGAGA AGAGCCAGTAAAAGACGCAGTGACGGAGATGTCTGATG CAA TAT GGA CAA TTG GTT TCT TCT CTG AAT TGAAAAACGTA 11 promoter TF binding site CCTGACAAATTCGACGTGCGGCATTGCATGCAGACGTGCATG CGTGCAAATAATCAATGTGGACTTTTCTGCGATTATGGAAGAA CTTTGTTACGCGTTTTTGTCATGGCTTTGGTCCCGCTTTGTTC AGAATGCTTTTAATAAGCGGGGTTACCGGTTTGGTTAGCGAGA AGAGCCAGTAAAAGACGCAGTGACGGAGATGTCTGATG CAA TAT GGA CAA TTG GTT TCT TCT CTG AAT... Transcription Start Site... TGAAAAACGTA Ribosome binding Site ORF = Open Reading Frame CDS = Coding Sequence 12 6

7 Comparing ORFs Identifying orthologs Comparative genomics Inferences on structure and function Comparing functional sites Inferences on regulatory networks Similarity profiles Researchers can learn a great deal about the structure and function of human genes by examining their counterparts in model organisms. 7

8 Alignment preproinsulin Xenopus Bos Xenopus Bos Xenopus Bos MALWMQCLP-LVLVLLFSTPNTEALANQHL MALWTRLRPLLALLALWPPPPARAFVNQHL **** : * *.*: *:..* :. *:**** CGSHLVEALYLVCGDRGFFYYPKIKRDIEQ CGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKARREVEG ***************:***** ** :*::* AQVNGPQDNELDG-MQFQPQEYQKMKRGIV PQVG---ALELAGGPGAGGLEGPPQKRGIV.**. ** * * ***** Xenopus Bos EQCCHSTCSLFQLENYCN EQCCASVCSLYQLENYCN **** *.***:*******

9 Ultraconserved Elements in the Human Genome Gill Bejerano, Michael Pheasant, Igor Makunin, Stuart Stephen, W. James Kent, John S. Mattick, & David Haussler (Science : ) There are 481 segments longer than 200 base pairs (bp) that are absolutely conserved (100% identity with no insertions or deletions) between orthologous regions of the human, rat, and mouse genomes. Nearly all of these segments are also conserved in the chicken and dog genomes, with an average of 95 and 99% identity, respectively. Many are also significantly conserved in fish. These ultraconserved elements of the human genome are most often located either overlapping exons in genes involved in RNA processing or in introns or nearby genes involved in the regulation of transcription and development. There are 156 intergenic, untranscribed, ultraconserved segments 17 Junk: Supporting evidence Junk is real! 18 9

10 Genome-wide profiling of: mrna levels Protein levels Functional genomics Co-expression of genes and/or proteins Identifying protein-protein interactions Networks of interactions 19 Understanding the function of genes and other parts of the genome 20 10

11 Structural genomics Assign structure to all proteins encoded in a genome Marti-Rebon et a., 2000 Archivi di dati Databank / Database sono stati messi a punto sistemi per collezionare e interrogare l'enorme mole di dati biologici disponibili. 11

12 What is a database? a collection of structured, searchable and up- to- date data. In bioinformatics there are literally hundreds of public, free accessible databases. The data are usually deposited in databases and assigned a unique identifying number for quotation in publications. 23 Databases public versus private 12

13 Most of the databases are public. This means they are free accessible for everybody everywhere in the world. But in recent years it has become more and more common that private companies sequence genomes of commercially or scientifically interesting organisms Companies make profit: they do not make their sequence data available to the public free of charge, which means that if you want to gain access to the information contained in these databases it comes with a cost. Academics normally are not able to pay the money required for accessing these databases and they are mainly used by the pharmaceutical and biotech industries. This means that some sequence information is available to everyone, whereas a lot of sequence information is only available to the big industries. 25 Sometimes, databases that have been public turn private on the 1st of June 2002 the former public genome database of Saccharomyces cerevisiae (yeast) and Caenorhabditis elegans, widely studied eukaryote model organisms, changed from a free to a chargeable service. Incyte Genomics in year 2000 charged US$2000 per lab and year. This made thousands of researchers all over the world very upset: informations mostly derive from published studies 26 13

14 Databank / Database Archivi di informazioni biologiche Archivi di informazioni derivate Archivi bibliografici Archivi di siti web Databank / Database Archivi di informazioni biologiche Sequenze annotate Strutture Pattern di espressione di proteine 14

15 Databank / Database Archivi di informazioni biologiche Archivi di informazioni derivate Patterns, signature, consensus motifs Mutazioni e varianti Classificazioni o relazioni (es. classificazione gerarchica della struttura di proteine) Databank / Database Archivi di informazioni biologiche Archivi di informazioni derivate Archivi bibliografici Tutti i riferimenti bibliografici con link al pdf, se consentito 15

16 Databank / Database Archivi di informazioni biologiche Archivi di informazioni derivate Archivi bibliografici Archivi di siti web Archivi degli archivi di cui sopra Collegamenti tra archivi Cosa possiamo chiedere al database? Data una sequenza, trovare sequenze simili (blasting) Data la struttura di una proteina, trovare strutture simili 16

17 Quali gli aspetti rilevanti dell era post- genomica? ² STUDI DI GENOMICA FUNZIONALE Caratterizzazione funzionale dei geni Umani e degli altri organismi modello mediante lo studio del TRASCRITTOMA e del PROTEOMA ² GENOMICA COMPARATA Analisi comparativa fra i genomi a supporto della Genomica Funzionale ² FARMACOGENOMICA Lo studio dell influenza dell eredità genetica sulla risposta al farmaco da parte di ciascun individuo. Tipi di banche dati: Banche dati di letteratura scientifica (PubMed) Banche dati di sequenze nucleotidiche (EMBL, GenBank, DDBJ) Banche dati di geni (LocusLink, GeneCards, RefSeq, UniGene) Banche dati di genomi (Ensembl) Banche dati di prodotti di trascrizione (dbest, UniGene) Banche dati di profili di espressione (GEO, ArrayExpress) Banche dati di polimorfismi e mutazioni (dbsnps, HGMD) Banche dati di sequenze proteiche (SwissProt, UniProt, PIR) Banche dati di motivi e domini proteici (PROSITE, Pfam) Banche dati di strutture proteiche (PDB, CATH e SCOP) Banche dati di profili di proteomica (OPD) Banche dati di pathways metabolici (ENZYME, PATHWAYS) Banche dati mitocondriali (MITOMAP) Banche dati di malattie genetiche (OMIM) 17

18 Banche dati di letteratura scientifica (PubMed) 35 PUBMED ( E considerata la banca dati per eccellenza della letteratura medica e biologica. E consultabile in modo gratuito e permette il link diretto ai siti delle riviste per visionare o scaricare l articolo (gratuitamente o a pagamento a seconda della policy della rivista). Le ricerche in PubMed possono essere effettuate tramite diverse opzioni: 1. Autore 2. Rivista 3. Parole chiave usando anche le possibilità offerte dal database 18

19 Esempio PUBMED Esempio Risultato (febbraio 2007) 19

20 Banche dati di sequenze nucleotidiche (EMBL, GenBank, DDBJ) 39 Principali Database biologici Sequenze di acidi nucleici ottenute da: DNA genomico Trascritti (mrna) EST (corte sequenze di trascritti) La maggior quantità di dati biologici presenti nei database è rappresentata da sequenze di acidi nucleici Sequenze proteiche ottenute da: Sequenziamento diretto Traduzione informatica delle sequenze nucleotidiche Studi di espressione proteica (gel bidim e spettrometria di massa) 20

21 Sequenze di DNA DNA genomico frammentato e poi amplificato (es. inserimento frammenti all interno di cloni batterici che replicandosi riproducono anche il DNA esogeno). I differenti frammenti vengono poi sequenziati. Assemblaggio sequenze ottenute da frammenti: lunghe sequenze di DNA presenti nei database. Sequenze parziali Sequenza assemblata NB per Sequenze di mrna: mrna (meno stabile del DNA) deve essere preventivamente trasformato in cdna. Nota: l insieme dei batteri contenenti gli inserti di DNA viene detto libreria di DNA (o libreria di cdna) perché sequenziare l mrna? Ø Per individuare i geni negli eucarioti superiori (in uomo solo l 1,5-3% del genoma è codificante). Questo permette anche di studiare le sequenze fiancheggianti e quindi la regolazione della trascrizione. Ø Per conoscere e studiare la relativa proteina. Ø Per conoscere varianti (splicing alternativi) dello stesso gene e quindi probabili funzioni differenti. Ø Per conoscere l espressione genica: individuare quando (sviluppo o momento particolare) e dove (quale tessuto) un gene viene espresso Nota: l insieme degli mrna messaggeri (trascritti) espressi in un organismo viene definito trascrittoma. 21

22 Sequenze EST (Expressed Sequence Tag) Per individuare un trascritto non serve conoscere tutta la sua sequenza, ma è sufficiente identificarne una parte. sequenziamento di corte sequenze di cdna chiamate EST: profili trascrizionali (espressione genica di un particolare tessuto o in un particolare momento o in presenza di una particolare malattia genetica). Attualmente nei database esistono più di 30 milioni di sequenze di EST di cui oltre 8 milioni relative a Homo sapiens e quasi 5 milioni relative a topo 5 UTR ATG Seq. codificante 3 UTR polya TAA AAAAAAAAA EST 5 EST 3 database di acidi nucleici contengono tutte le sequenze prodotte nel mondo e rese disponibili alla comunità scientifica. Memorizzano sia le sequenze che altre informazioni generiche correlate (laboratorio dove è avvenuto il sequenziamento, data, specie, descrizione ) Collaboration among: DDBJ - DNA Data Bank of Japan EMBL - European Molecular Biology Laboratory, UK GenBank - National Center for Biotechnology Information, NLM, NIH I tre database si aggiornano quotidianamente scambiandosi i dati ricevuti durante la giornata, in modo che sia sufficiente interrogare solo uno dei tre. 22

23 Per semplificare la ricerca d informazioni in più banche dati biologiche simultaneamente sono stati sviluppati dei sistemi integrati. I principali sono: v ENTREZ associato a GenBank v SRS associato a EMBL v DBGET associato a DDBJ FORM DI QUERY PAGINA DI RISPOSTA PC UTENTE 1 5 RETE 2 SISTEMA INTEGRATO 4 COMPUTER SERVER REMOTO 3 DB 1 DBn SRS è un sistema aperto, può essere installato su server differenti e può integrare banche dati strutturate su altri server SRS o altre banche dati previa strutturazione o indicizzazione nel sistema SRS. ENTREZ sistema disponibile via web per la ricerca e l estrazione dei dati da banche dati di sequenze nucleotidiche, proteiche, dalla banca dati bibliografica MEDLINE, dalla banca dati delle malattie mendeliane OMIM, e da ogni banca dati sviluppata dall NCBI. Ø E un sistema chiuso e non è possibile ottenere il software che gestisce il sistema. 23

24 EMBL - EBI European Bioinformatics Institute (Hinxton Cambridge, UK) NCBI 24

25 DDBJ NUCLEOTIDE 25

26 Esempio di ricerca in Nucleotide Quanti e che tipo di record vengono trovati. Nome ufficiale del gene. ID per il mrna che ci interessa. Analizziamo meglio un record v LOCUS un codice v DEFINITION descrizione della sequenza v ACCESSION un codice v ORGANISM l organismo a cui appartiene la sequenza (e tassonomia) v REFERENCE Riferimenti bibliografici a quella sequenza o chi l ha sottomessa 26

27 Continua da precedente v COMMENT molto utile ma purtroppo non sempre presente v FEATURES alcune caratteristiche e link importanti, ad esempio: le coordinate cromosomiche il gene la sequenza codificante la traduzione in proteina Continua da precedente e molte altre informazioni E per concludere la sequenza nucleotidica 27

28 Questo è un record speciale in cui sono definiti i principali campi Come già visto, anche in questo database nucleotidico si possono raffinare le ricerche tramite l utilizzo dei LIMITS ex. organismo sus scrofa E possibile selezionare solo alcuni dei record risultanti ed effettuare delle operazioni solo su essi. Ad esempio visualizzarne la sequenza, salvarli su file... 28

29 Proviamo a limitare ulteriormente la ricerca LIMITS Con DISPLAY SETTINGS si può impostare il formato con cui visualizzare i dati 29

30 Con SEND è possibile scegliere se mandare i risultati come testo a video o se downloadarlo come un file locale sul PC (ad esempio per successive elaborazioni) Con clipboard si possono salvare informazioni sul sito per 8 ore FORMATO FASTA v v Spesso i programmi che effettuano analisi bioinformatiche sulle sequenze richiedono che esse vengano date come input in questo formato particolare. FASTA è un formato standard per la rappresentazione di una sequenza in formato testo. Consiste in una intestazione, di solito limitata a una linea di testo, e in una o più linee che riportano una sequenza di DNA o di amminoacidi usando l alfabeto standard. Ecco un esempio: Riga di intestazione >37463.f1 g83244 telethonin ecc. Interruzione di riga ACGTGACTGCTACGTACGGGCGTTACGACTGCTACGACGCATGCTATGTC GTAGCAGCCGTGTACACGTGTTTATTCGTAGGGCTTCTA > Simbolo d inizio della riga di intestazione Sequenza L intestazione (la prima riga del file precedente) è riconoscibile perchè ha inizio con il simbolo >. Il testo che segue tale simbolo nella stessa riga può essere strutturato liberamente: di solito, la prima cosa che si trova scritta è un accession number, ossia l identificatore della sequenza che ne permette il reperimento. 30

31 Una volta visualizzato un record di sequenza è pure possibile estrarne solo una parte È anche possibile visualizzarne la sequenza inversa complementare: Il database OMIM cataloga le malattie genetiche e fornisce descrizioni particolareggiate delle malattie e delle possibili cause (mutazioni). Mutazioni (alterazioni sequenza nucleotidica) possono riflettersi in alterazioni della funzionalità della proteina da esso codificata. Questo mutazioni possono causare le cosiddette malattie genetiche. Esempio: una mutazione a carico del gene della β globina fa sì che una particolare base del gene venga sostituita con un altra, ciò altera il codone e nella proteina ciò si riflette nella sostituzione di un glutamato con una valina e in una ridotta funzionalità della proteina che causa una malattia genetica detta anemia a cellule falciformi (anemia falciforme). 31