COLLANA DI MONOGRAFIE BIOLOGICHE

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1 COLLANA DI MONOGRAFIE BIOLOGICHE 3

2 Direttore Giovanni PARISI UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II Comitato scientifico Antonio ARIANI UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II Karl J. WITTMANN MEDIZINISCHE UNIVERSITÄT WIEN

3 COLLANA DI MONOGRAFIE BIOLOGICHE Negli ultimi decenni la Biologia ha compiuto, a seguito della scoperta della struttura e della funzione genetica del DNA, un decisivo balzo in avanti, che può ben richiamare quel movimento innovatore che si produsse nelle scienze fisiche dopo la scoperta, agli inizi dello scorso secolo, dei quanti di energia. La moderna teoria del gene che rapidamente si è composta come un corpo di dottrina a sé, ha permesso di chiarire numerosi meccanismi molecolari che sono alla base di fondamentali processi biologici. L analisi dei fatti fondamentali che caratterizzano il fenomeno della vita non si esaurisce, però, nella sola indagine intorno allo studio dei meccanismi molecolari che discendono dall attività dei geni. La prodigiosa diversità delle forme viventi, peculiare carattere del fenomeno vita, ha indotto a cogliere di volta in volta, ai vari livelli dell organizzazione nella gerarchia dei sistemi biologici, fatti essenziali di portata generale comuni a tutto ciò che vive. Questa Collana di monografie biologiche offre saggi sui temi dominanti della biologia generale, cellulare e molecolare, nonché della genetica nelle sue varie articolazioni comprendente l ingegneria genetica e le biotecnologie. Arricchiscono la collana in oggetto particolari monografie che illustrano il dibattito scientifico e l evoluzione delle tecnologie che hanno consentito nel tempo il progresso delle scienze biologiche. Tematiche di fondamentale importanza, uniche nella editoria italiana, che consentono al lettore di rendersi meglio conto di come sia stato possibile pervenire agli attuali livelli di conoscenze in ambito biologico. Il Consiglio scientifico, del quale hanno accettato di far parte illustri Studiosi di varie Istituzioni accademiche nazionali e internazionali, e la procedura predisposta per la valutazione dei contributi costituiscono una garanzia di qualità e di rigore scientifico.

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5 Giovanni Parisi Introduzione alla biologia molecolare Elaborazione delle principali tecniche chimico fisiche che ne consentirono la nascita Volume primo

6 Copyright MMXVII Aracne editrice int.le S.r.l. via Quarto Negroni, Ariccia (RM) (06) ISBN I diritti di traduzione, di memorizzazione elettronica, di riproduzione e di adattamento anche parziale, con qualsiasi mezzo, sono riservati per tutti i Paesi. Non sono assolutamente consentite le fotocopie senza il permesso scritto dell Editore. I edizione: gennaio 2017

7 Indice 11 Prefazione 13 Capitolo I Tecniche cromatografiche 1.1. Introduzione, Cromatografia liquido solido su colonna, Cromatografia di adsorbimento, Analisi per eluizione, Analisi frontale, Analisi per spostamento, Mikhail Semyonovich Tswett, Richard Willstätter, Charles Dhéré, Leory Sheldon Palmer, Edgar Lederer, Richard Johann Kuhn, Cromatografia su idrossiapatite, Cromatografia a scambio ionico, Cromatografia di ripartizione liquido liquido, Archer John Porter Martin, Richard Laurence Millington Synge, Cromatografia su carta, Cromatografia su strato sottile, Egon Stahl, Cromatografia di esclusione stearica o gel filtrazione, Gel filtrazione su strato sottile (o TLG), Principali applicazioni della gel filtrazione, 137 Purificazione di molecole biologiche, 137 Determinazione del peso molecolare, 139 Concentrazione delle soluzioni, 140 Desalificazione, 140 Studio delle interazioni che si stabiliscono tra un ligante ed una proteina, Jerker Porath, Cromatografia per affinità, Capitolo II Tecniche elettroforetiche 2.1. Introduzione, Elettroforesi zonale, Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, Elettroforesi su carta, Elettroforesi su acetato di cellulosa, Elettroforesi su amido, Oliver Smithies, Elettroforesi in gel di agarosio, Elettroforesi in gel di poliacrilammide, Elettroforesi degli acidi nucleici, Evidenziazione di tracciati elettroforetici di polinucleotidi, Autoradiografia, Fluorografia, Determinazione della sequenza nucleotidica del DNA, Tecnica di Maxam e Gilbert (o metodo di degradazione chimica), Walter Gilbert, 230 7

8 8 Indice Tecnica di Sanger e Coulson (o metodo enzimatico), Determinazione della sequenza nucleotidica dell RNA, Tecnica di Peattie (o metodo di degradazione chimica), Sequenziamento nucleotidico dell RNA mediante parziale digestione con endonucleasi specifiche per una determinata base, Capitolo III Tecniche spettroscopiche 3.1. Introduzione, Spettrofotometria di assorbimento nel visibile e nell ultravioletto, Fenomeni di luminescenza: fluorescenza e fosforescenza, Arnold Orville Beckman, Aleksander Jabłoński, Capitolo IV Impiego di radioisotopi nella ricerca biologica 4.1. Introduzione, Isotopi stabili e radioattivi, Brevi cenni sulla radioattività, Isotopi radioattivi artificiali nella ricerca biologica, Isotopi stabili nella ricerca biologica, Capitolo V Centrifugazione ed ultracentrifugazione 5.1. Introduzione, Rotori di differenti tipi, Tecniche di centrifugazione, Centrifugazione differenziale, Centrifugazione in gradiente di densità, Centrifugazione zonale, 323 Purificazione di virus mediante centrifugazione in gradiente di saccarosio, 326 Frazionamento di DNA mediante centrifugazione in gradiente di saccarosio, 328 Frazionamento di RNA mediante centrifugazione in gradiente di saccarosio contenente metilmercurio idrossido, Centrifugazione isopicnica, 328 Sedimentazione di DNA in differenti stati conformazionali, 333 Sedimentazione a ph alcalino in gradiente di saccarosio, 333 Sedimentazione all equilibrio in gradiente di CsCl contenente bromuro di etidio, 334 DNA lineare e DNA sotto forma di cerchio interrotto, 334 DNA circolare chiuso covalentemente, 334 DNA in superelica, 335 Determinazione del peso molecolare, Ultracentrifughe preparative e analitiche, Capitolo VI Tecniche di microscopia ottica 6.1. Introduzione, Microscopia in campo oscuro, Microscopia in contrasto di fase, Microscopia in contrasto interfe-

9 Indice 9 renziale, Microscopia a luce polarizzata, Microscopia a fluorescenza, Ernst Karl Abbe, Capitolo VII Tecniche di microscopia elettronica 7.1. Introduzione, Potere risolutivo del microscopio elettronicon]microscopio elettronico, potere risolutivo, Microscopio elettronica a trasmissione, Microscopia elettronica a trasmissione di campioni biologici, 399 Fissazione, 402 Inclusione ed allestimento di sezioni ultrasottili, 404 Colorazione negativa e ombreggiatura, Microscopia elettronica a trasmissione degli acidi nucleici, Microscopio elettronico a scansione, Capitolo VIII Combinazione delle tecniche autoradiografiche con la microscopia ottica o elettronica 447 Indice dei nomi 454 Indice analitico

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11 Prefazione Negli anni Quaranta dello scorso secolo, gran parte della cellula vivente era rimasta praticamente inesplorata. L esame morfologico delle cellule e dei tessuti era essenzialmente limitato dalla scala delle dimensioni del potere di risoluzione del microscopio ottico; al tempo stesso l analisi chimica e chimico fisica forniva ben poche informazioni relativamente alle strutture molecolari e ai meccanismi che sottendono il biochimismo cellulare. Mancava ai biologi un quadro organico nel quale collocare i concetti acquisiti e principalmente occorreva completare, almeno nelle sue linee generali, la teoria del gene. Si rendeva necessario studiare i fenomeni dell ereditarietà dei caratteri su di una razionale base molecolare, in maniera più generale e più elementare di quanto era mai stato possibile in precedenza. Grazie ai notevoli progressi delle scienze fisiche e chimiche, registratisi nella seconda metà del XIX secolo e gli inizi del XX, è stato possibile che la Biologia cominciasse, nel nuovo secolo, a subire un graduale processo di trasformazione in seguito alla convergenza di discipline che erano rimaste per molto tempo indipendenti sia per la problematica che per i materiali e la metodologia utilizzati. Occorreva disporre di una adeguata strumentazione che consentisse non soltanto di osservare con sempre maggior dettaglio il mondo della cellula, ma anche di isolare organuli cellulari e. al tempo stesso, studiarne la struttura e la funzione. A ciò provvidero le nuove tecnologie sviluppate dai fisici e dai chimici le quali consentirono che si rendessero gradualmente disponibili strumenti dalle prestazioni sempre più accurate grazie alle quali si posero le basi della nascente biologia molecolare permeata da concetti informazionali derivati dalla teoria dell informazione. In particolare l evoluzione della microscopia ottica ed elettronica, la disponibilità di ultracentrifughe analitiche e preparative, la messa a punto di tecniche cromatografiche ed elettroforetiche, nonché l im- 11

12 12 Prefazione piego di radioisotopi hanno avuto un ruolo fondamentale affinché, a partire dagli anni Ottanta, la biologia molecolare potesse rapidamente progredire sia nei contenuti teorici sia nelle applicazioni pratiche. Il volume che, per i tipi dell Aracne editrice, ho il piacere di sottoporre al giudizio dei lettori è stato concepito con l intento di fornire una panoramica relativamente all evoluzione delle principali tecniche chimico fisiche che in larga misura hanno contribuito al progresso delle scienze biologiche, dal principio del XX secolo fino a circa gli anni Ottanta. Numerose altre tecniche, anch esse di notevole importanza, come la spettrometria di massa, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, la cromatografia in fase liquida ad alta pressione (HPLC), la reazione a catena della polimerasi (PCR) e tante altre, che richiedono una particolare strumentazione e hanno avuto un prevalente sviluppo dopo gli anni Ottanta, saranno trattate in altro volume. Un particolare debito di riconoscenza ho verso alcuni colleghi e principalmente i miei Studenti che hanno sempre stimolato e condiviso il mio interesse per la Biologia. Non posso esimermi, infine, dal ringraziare mia moglie per la sua preziosa collaborazione.