Diagnostica in ematologia

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1 Diagnostica in ematologia Diagnostica biochimico-clinica clinica Lezione 13

2 Sangue Trasporto O 2 Trasporto materiali nutritivi Trasporto materiali di rifiuto Trasporto ioni Trasporto di cellule deputate alla difesa dell organismo

3 Ematopoiesi

4 Elementi corpuscolati del sangue CELLULE EMATICHE DURATA IN CIRCOLO FUNZIONE eritrocita 120 giorni trasporto di ossigeno monocita 3 giorni difesa dell organismo, sorveglianza immunitaria (precursore dei macrofagi dei tessuti) GRANULOCITI neutrofilo eosinofilo basofilo 7 ore difesa dell organismo?? difesa dell organismo, contro i parassiti, allergie infiammazione e allergia piastrine 7-8 giorni coagulazione del sangue linfocita T linfocita B forse qualche anno? immunità cellulare difese anticorpali (precursore delle plasmacellule)

5 Sangue

6 Esame emocromocitometrico Conta globuli rossi (RBC) Conta globuli bianchi (WBC) Conta piastrine (PLTS) Dosaggio Emoglobina (Hb) Ematocrito (Ht o PCV) Formula leucocitaria (Neutrofili, Eosinofili, Basofili, Linfociti, Monociti)

7 Ematocrito (Ht% o PCV Packed cell volume ) Esprime la % del volume degli elementi corpuscolati sul volume totale di sangue Uomini L/L Donne L/L

8 Ematocrito: metodi di misura Sangue in toto Anticoagulanti EDTA tripotassico(1.5 mg/ml) Eparina Metodi di misura MACROMETODO Capillari di Wintrobe(2.5mm x 110mm) Centrifuga x 30 a 3000 rpm Siero Coagulo MICROMETODO Capillari eparinati(1mm x 75mm) Centrifuga x 5 a rpm MISURA CON STRUMENTI ELETTRONICI

9 Emoglobina Hb(g/dL g/l mmol/l) Metodo misura: cianuro di K e ferricianuro di K (reagente di Drabkin) cianmetaemoglobina ABS 540 nm Valori normali 110 g/l bambini g/l donne 110 g/l donne in gravidanza g/l uomini

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12 Globuli rossi Valori normali x /L uomini x /L donne Indici ematici MCV: Volume Corpuscolare Medio (Ht/N GR) MCH: Quantitàmedia Hbnei GR (Hb/N GR) Valori di riferimento fl pg MCHC: [Hb] eritrocitaria media (Hb/Ht% X 100) 33% MPV: Volume Medio Piastrine MCV Anemie Microcitiche Normocitiche Macrocitiche MCH Anemie Ipocromiche Ipercromiche MCHC Inutile ai fini diagnostici

13 Globuli rossi

14 Metodi di misura Metodo dell impedenza / Metodi ottici Metodi manuali Hb/Ht/n.GR Calcolo Indici Ematici MCH/MCV/MCHC Metodi strumentali elettronici Hb/n.GR/MCV/MCHC Calcolo di MCH ed Ht=MCVx n.gr RDW(Red cell distribution width) Eterogeneità da anisocitosi (16%) HDW(Hemoglobin distribution widht) Eterogeneità da anisocromia(29%) Reticolociti ( %): Globuli rossi immaturi, i cui ribosomi reagiscono con alcuni coloranti (Blu di cresile/blu di metilene) precipitando a formare granuli o filamenti

15 Globuli bianchi Valori normali x 10 9 /L adulti 18 ±8 x 10 9 /L neonati Neutrofili 35-71% Linfociti 20-53% Monociti 1-9% Eosinofili 0.5-8% Basofili 0-2%

16 Globuli bianchi Neutrofili Basofili Linfociti Eosinofili Monociti Piastrine

17 Realizzazione di uno striscio di sangue Gocciadi sangue AVVICINAMENTO ADESIONE AVANZAMENTO

18 Striscio di sangue colorato con May-Grünwald-Giemsa La colorazione May-Grunwald Giemsa è una colorazione differenziale per differenziare i globuli bianchi. In questa colorazione, si usano gli stessi coloranti, ma con tempi e concentrazioni diverse della colorazione di Wright. I coloranti acidi, presenti in questa colorazione, colorano la parte basica della cellula, mentre i coloranti basici colorano la parte acida. Il May-Grunwald è una miscela di due coloranti: eosina e blu di metilene. Il primo comporterà una colorazione rosa/rossa, il secondo comporterà una colorazione blu/viola.

19 Striscio di sangue

20 Alterazioni degli eritrociti Ipocromia Emazie pallide e ipocromiche, talvolta con zona centrale chiara Anisocitosi e anisocromie Emazie di grandezza/colorazione diversa Macrocitosi MCV>102 fl Microcitosi MCV< 80 fl Poichilocitosi Presenza di eritrociti a forma diversa In condizioni fisiologiche in vitro: diametro : 7-8 µm Area superficiale : µm 2 volume : µm 3

21 Alterazioni degli eritrociti Ellissocitosi Eritrocita ellittico (non ipocromico) Leptocitosi Cellule ipocromiche sottili con diametro normale ed MCV diminuito Schistocitosi Eritrociti frammentati piccoli di forma triangolare Sferocitosi Presenza di eritrociti piccoli a palla non ipocromici con diametro e spessore ridotti

22 Alterazioni degli eritrociti Target cells Cellule con l aspetto di bersaglio a cerchi Acantocitosi Emazie dotate di 5-10 spicole di varia lunghezza e numero,irregolarmente distribuite Alterato metabolismo lipidico

23 Alterazioni degli eritrociti Drepanocitosi Forma a falce, soprattutto in condizioni di ipossia

24 Alterazioni degli eritrociti Anemia megaloblastica Carenza di ferro Talassemia Sferocitosi ereditaria Anemia falciforme Ellissocitosi ereditaria Acantocitosi

25 Anemie Riduzione della quantità totale di emoglobina circolante negli eritrociti del sangue periferico Per convenzione si considera la concentrazione di Hb supponendo che il volume ematico rimanga costante. Ciò non avviene in alcune situazioni cliniche: Emorragia acuta Gravidanza (> volume plasmatico) Ritenzione idrica Anemia Valori di emoglobina inferiori a: 11 g/dl Bambini 12 g/dl Donne 11 g/dl Donne in gravidanza 13 g/dl Maschi Anemie da carenza di Ferro: Ferritina sierica <12 ng/ml Transferrina (TIBC) Sideremia Emoglobinopenia

26 Struttura dell emoglobina

27 Emoglobina EMBRIONALI ξ(tipo α) ε e γ(tipo β) Gower 1 ξ2 ε2 Gower 2 α2 ε2 Portland ξ2 γ2 FETALE α e γ HbF α2 γ2 NEONATO α β γ δ ADULTA α β γ δ HbA α2 β2 20% HbA2 α2 δ2 0,5% HbF α2 γ2 80% HbA α2 β % HbA2 α2 δ2 1,8-3,5% HbF α2 γ2 0,2-2%

28 Disordini genetici dell emoglobina TALASSEMIE Alterazioni di tipo quantitativo: sintesi alterata o soppressa di catene globiniche normali EMOGLOBINOPATIE Alterazioni di tipo qualitativo della composizione per sostituzione, perdita o aggiunta di aminoacidi in una delle catene globiniche Catene β 1 Gene su Cromosoma 11 (Aploide) Catene α 2 Geni su Cromosoma 16 (Aploide)

29 Separazione delle emoglobine mediante HPLC

30 Emoglobinopatie Alterazioni geneticamente determinate della molecola di emoglobina (Anemie ipocromiche micronormocitiche di tipo emolitico) varianti 1/3 associato a manifestazioni cliniche CAUSE: Sostituzione amminoacidica(più frequenti nelle catene β) Aggiunta di amminoacidi all N-terminale Delezione di uno o più amminoacidi Crossing-over tra cromosomi omologhi (Hb Lepore) HbS -HbE -HbC-HbM-Emoglobine instabili Hb S Gluβ 6 Val Modifica della carica elettrica della globina-emazie rigide-falcemia Hb C Gluβ 6 Lys Emazie trasformate in eritrociti a bersaglio o microsferociti Hb E Gluβ 26 Lys Diminuita sintesi di catene globiniche Hb M 6Varianti Ossidazione del Fe dell eme (Metaemoglobina) EMOGLOBINE INSTABILI ( 100 varianti): Alterazioni strutturali a livello molecolare che compromettono la stabilità e la solubilità della molecola Precipitati intracellulari per la presenza di Hb denaturata (corpi di Heinz)

31 Corpi di Heinz

32 Separazione delle emoglobine mediante elettroforesi Elettroforesi su Acetato di cellulosa a ph 8,6 Elettroforesi su Agar a ph 6,2 Elettrofocalizzazione

33 α Talassemie α : Sintesi catene α completamente soppressa α + : Sintesi ridotta catene α αα/ -- TALASSEMIA MINOR HbBart (γ4) alla nascita (5-15%) α-/ α- Adulti HbA2 normale o α/β= /-- IDROPE FETALE Incompatibile con la vita PLACENTARE Hb Bart 80% α-/ αα PORTATORE SILENTE Hb Bart 1-2% --/ α- MALATTIA HbH Feto e Neonato HbBart (γ4) 20-40%. Adulto HbH(β4) 5-30% HbA 70-90% QUADRO CLINICO Anemia microcitica Maggiori resistenze osmotiche HbA2 normale o ridotta (NB βtalassemie) α/β < 1 HbA % Hb GR Parametri relativi al metabolismo del Fe vicini alla normalità

34 β Talassemie β / β : Sintesi catene β soppressa β + / β + : Sintesi catene β ridotta dal 5 al 30% HbA HbA2 HbF Hb Lepore β / β assente N/ 95% β + / β + Pres.10-20% N/ 70-80% β / β + presente N/ variabile β / HbLepore assente assente 80% 20% QUADRO CLINICO HbA2 aumentata (3.5 7%) Microcitosi e poliglobulia Hb Resistenze osmotiche aumentate DIAGNOSI TALASSEMIE Elettroforesi Hb

35 Anemie ANEMIE NORMOCITICHE Alterazione primitiva a carico del midollo eritropoietico ANEMIE MEGALOBLASTICHE Deficit di folato e vitamina B12 Asincronia di maturazione tra citoplasma e nucleo Ridotta sintesi del DNA Nucleo ridotto rispetto al citoplasma FeSiero UIBC ANEMIE MICROCITICHE Anemia sideropenica Carenza di Fe Ferritina sierica Transferrina (TIBC) Sideremia Anemia delle malattie croniche Fe spostato nel sistema monocitico-macrofagico Ferritina sierica Transferrina (TIBC) Sideremia Anemia sideroblastica Incapacità di usare il Fe per la sintesi dell eme Ferritina sierica Transferrina (TIBC) Sideremia Talassemie Difetto di sintesi dell Hb a livello delle catene α e/o β TIBC

36 Anemie ANEMIE EMOLITICHE Malattie in cui la vita eritrocitariamedia èaccorciata rispetto al normale. Si sviluppa quando l eritropoiesi non è sufficiente a compensare l emolisi. CAUSE DELLA RIDOTTA SOPRAVVIVENZA FATTORI LEGATI ALL ERITROCITO (Anemie emolitiche intraglobulari) FATTORI ESTERNI DANNOSI ALL ERITROCITO (Anemie emolitiche extraglobulari)

37 Anemie FATTORI LEGATI ALL ERITROCITO (Anemie emolitiche intraglobulari) Quadro clinico Emoglobinopatie, talassemie (Volume globulare ridotto) Anemia da deficit enzimatico: G6PD-PK (Deficit enzimatico) Sferocitosi, ellissocitosi, acantocitosi(difetti di membrana eritrocitaria) Conta reticolocitaria aumentata Iperbilirubinemia di tipo indiretto (>catabolismo dell eme) Aumento urobilinogeno urinario e fecale Ipersideremia Riduzione Aptoglobina Presenza di metalbumina(hb si lega all albumina)

38 Anemie FATTORI ESTERNI DANNOSI ALL ERITROCITO (Anemie emolitiche extraglobulari) Immunologiche Alloanticorpi Anemie autoimmuni: Presenza di anticorpi anti-eritrociti (Autoanticorpi) Non immunologiche Anemie emolitiche da cause cardiache Anemie emolitiche da marcia Anemie emolitiche nelle infezioni (Plasmodio della malaria, veleno dei serpenti, punture di insetto)