LA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI DA HCV: STATO DELL ARTE M. Crovatto

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1 resented at CSF LA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI DA HCV: STATO DELL ARTE M. Crovatto Prevalenza dell infezione: 2% = 123 milioni di persone Shepard C W, Finelli L, Alter M Global epidemiology of hepatitis C virus infection September. Lancet Infect. Dis. 2005; 5:558-67

2 Test di screening Test supplementare Immunoblot HCV RNA qualitativo HCV RNA quantitativo Genotipizzazione Presented at CSF

3 TEST QUANTITATIVI PER HCV RNA Cobas Amplicor HCV Monitor UI/ml LCx HCV Assay UI/ml ABI 7000 UI/ml Versant HCV RNA 3.0 Assay UI/ml Cobas TaqMan HCV UI/ml UI/ml

4 EVOLUZIONE TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE PCR Real Time Presented at CSF

5 Range dinamico e sensibilità tests eseguibili con Cobas TaqMan 48 e ABI 7000 (Real Time) Test Range dinamico Sensibilità HCV UI/ML 15 UI/ML Ampliprep + Cobas TaqMan 48 ABI 7000 Test Range dinamico HCV UI/ML Cobas TaqMan 48

6 HCV Preparazione automatizzata del campione (e QS) su COBAS Ampliprep (lisi, cattura del DNAcon particelle di vetro magnetizzate, eluizione) Retrotrascrizione, Amplificazione e contemporanea rilevazione su Cobas Taqman 48, mediante segmentazione di una sonda oligonucleotidica specifica a doppia etichetta per il bersaglio ed una specifica per il QS (coloranti fluorescenti del reporter diversi) Sequenza operativa Estratto Azione AmpErase Trascrizione inversa Denaturazione Annealing Estensione Cicli PCR Presented at CSF PCR Analisi dei dati & Calcoli Risultato

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8 AmpliLink Suggerimenti Presented at CSF

9 STRUMENTAZIONI COBAS Ampliprep (CAP) COBAS TaqMan 48

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11 TaqMan HCV LOG IU/ml 7,50 6,50 5,50 4,50 y = 0,9556x + 0,11 r = 0.92 p = 0,001 3,50 3,50 4,50 5,50 6,50 7,50 Presented at CSF AMPLICOR HCV MONITOR LOG IU/m l

12 Genotipo HCV-Q Monitor HCV-Q TaqMan Differenza Log 2a/2c 4.4 x x a/2c 4.1 x x ,5 NT 7.7 x x ,6 3a 2.8 x x ,8 3a 4.9 x x ,3 2a/2c 1.2 x x ,5 3a 1.8 x x ,4 2 3 x x ,4 4c/4d 4.5 x x ,1 2a/2c 1.6 x x ,1 3a 4.4 x x c/4d 5.1 x x ,3 2a/2c 2.24 x x , x x ,4 Presented at CSF

13 Genotipo Amplicor TaqMan Diff. Log 2a 5.15 x x , gen x x , a 8.88 x x , a 8.74 x x , c 8.75 x x , a 2.02 x x , c 8.84 x x , b + 3a 2.1 x x , gen x x , b 4.32 x x , a 3.1 x x , gen x x , a 2.36 x x , gen 4 + gen1 4.8 x x , a 3.24 x x , gen x x , a 2.62 x x , Presented at CSF 2a 4.05 x x , c 3.1 x x ,

14 Amplicor TaqMan Diff. Log 2.15 x x , x x , x x , x x , x x , x x , x x , x x , TL <15 TL TL TND TND TL <15 TL TL TND TND Presented at CSF TL <15

15 Simmonds P et al. Consensus Proposals for Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes.HEPATOLOGY 2005; 42(4) : Presented at CSF

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17 Simmonds P et al. Consensus Proposals for Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes.HEPATOLOGY 2005; 42(4) : Differenza tra genotipi: 31-33% Differenza tra sottotipi: 20-25% Ricombinazione In Russia è stata evidenziato un ricombinante contenente geni strutturali del genotipo 2k e geni non strutturali del genotipo 1b che si sta diffondendo rapidamente tra i tossicodipendenti Ricombinanti 1a/1b descritti anche in Peru Rilevamento della sequenza genomica completa del ricombinante da 3 o piu soggetti Ogni nuovo ricombinante deve avere i breakpoints nella stessa posizione in ciascuna sequenza Deve essere numerato sequenzialmente in ordine di scoperta con le lettere identificanti i sottotipi in ordine alfabetico: RF 01_1b2k

18 Definizione di un nuovo genotipo: Definizione provvisoria : richiede la sequenza della regione codificante completa, la dimostrazione della diversità rispetto agli altri genotipi mediante analisi filogenetica e l assenza di ricombinazione Conferma definizione: richiede la sequenza della regione codificante di 2 o piu varianti da infezioni che non sono direttamente correlate epidemiologicamente

19 Definizione di un nuovo sottotipo: Definizione provvisoria : sequenza delle regioni core/e1 ed NS5B da 3 o piu ceppi provenienti da soggetti diversi Conferma definizione: sequenza completa di uno o più genomi

20 Nomenclatura genotipi di HCV: proposta modifica Nom. Attuale Nom. Proposta Ceppo Regione sequenziata Genotipo 2 2j 2k RU169 NS5B,3 UTR 2l 2j BA047 NS5B,3 UTR 2e 2n NL50 C/E1,NS5B 4f/2f 2o FR4 C/E1,NS5B f 2p NL33 C/E1,NS5B 2k 2q BA045 NS5b,3 UTR Genotipo 3 10a 3k HPCJK049E1 Genoma completo Genotipo 4 4a 4r Z4 C/E1 4 alfa 4n 1359 C/E1 4 beta 4o 2153 C/E1,NS5B Genotipo 6 7d 6c Th846 C/E1,NS5B 7b 6d VN235 Genoma completo 7a 6e VN540 C/E1,NS5B 7e 6f BB7 NS5B 7c 6f Th271 C/E1,NS5B 11a 6g HPCJK046E Genoma completo 9a 6h VN004 Genoma completo 9b 6i Th555 C/E1,NS5B 9c 6j Th553 C/E1,NS5B 8b 6k VN405 Genoma completo 8a 6l VN507 C/E1 Differenza tra i genotipi a livello nucleotidico: 31% - 33% Differenza tra i sottotipi: 20% - 25% Simmonds P. et al. Hepatology, October 2005: Presented at CSF

21 Nuova classificazione proposta Presented at CSF Genotipo 1 Sottotipi: 1a,1b,1c,1d,1e,1f,1g,1h, 1i,1j,1k,1l Genotipo 2 Sottotipi: 2a,2b,2c,2d,2e,2f,2g,2h,2i, 2j,2k,2l,2m,2n,2o,2p,2q Genotipo 6 Sottotipi: 6a,6b,6c,6d,6e,6f,6g,6h,6i, 6j,6k,6l,6m,6n,6o,6p,6q Genotipo 3 Sottotipi: 3a,3b,3c,3d,3e,3f,3g,3h,3i, 3k Genotipo 5 Sottotipi: 5a Genotipo 4 Sottotipi: 4a,4b,4c,4d,4e,4f,4g,4h,4i, 4j,4k,4l,4m,4n,4o,4p,4q,4r, 4t Simmonds P. et al. Hepatology, October 2005:

22 ORF ( nt) Regione strutturale Regione non strutturale 5 NC (IRES) traduzione 3 NC Precursore della poliproteina Presented at CSF Modificazioni co- e posttraduzionali Signalasi cellulari dell ospite Proteinasi NS2- NS3 Zndipendente dell HCV Proteinasi serinica dell HCV NS3 C E1 E2 p7 NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B Core Glicoproteine dell envelope Viroporina Proteinasi Zn-dipendente Proteinasi serinadipendente Elicasi NTPasi Cofattore di NS3 Ancoraggio alla membrana Proteina regolatrice dell RNA polimerasi RNA polimerasi RNAdipendente

23 Genotipizzazione mediante Ibridizzazione Inversa

24 INNOLIPA HCV

25 FREQUENZA GENOTIPI NUMERO GEN 1 22 GEN 2 16 GEN a 57 1b 522 2a/2c 332 2b 4 3a 176 4c/4d 21 5a 2 0 COINF 13 NON TIP 6 NON TIP COINF 5a 4c/4d 3a 2b 2a/2c 1b 1a GEN 4 GEN 2 GEN 1 GENOTIPI

26 Richieste ripetute di genotipizzazione ( ): 2x 131 3x 19 4x 7 Media: 17 mesi Range x 1 6x 7 8x 1 Tot. 166=236 test Il genotipo è risultato sempre lo stesso

27 Genotipizzazione mediante sequenziamento Presented at CSF

28 TRUGENE TM HCV 5 NC KIT Viral RNA (9400 nucleotides) Cy5.5 5 NC C E1 HCV-RNA Virale (9400 nucleotidi) E2 NS2 NS3 NS4 NS5A NS5B 3 NC Cy5 Core Envelope Glicoproteine Metallo proteasi Proteasi Elicasi RNA Polimerasi La regione sequenziata dell HCV-RNA è la 5 NC ( 186 basi )

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30 A C T G MicroCel Cassette T G Filters Laser Excitation of Cyanine Dyes B. Chanzy, CH Annecy, 2000 Presented at CSF Photomultiplier Tubes

31 OpenGene System Optical Array Object Lenses Filters Image Lenses Cy5.5 Image Lenses Photo detector Cy5 Photo detector Cy5.5 Gel Laser

32 OpenGene System Optical Array Object Lenses Filters Image Lenses Cy5 Image Lenses Photo detector Cy5 Photo detector Cy5.5 Gel Laser

33 Correlazione con un cromatogramma N N

34 Allineamento e Chiamata delle Basi A C G T

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38 Campioni CQ NeQas 7531 HCV NeQas HCV NeQas HCV NeQas HCV NeQas HCV NeQas HCV NeQas HCV NeQas Reattività InnoLipa Genotipo Sequenziamento 3,4,6 1b 1b 3,4,6,13,14,15 1b + 3a 1b 13,14,15 3a 3a 13,14,15 3a 3a 3,4,6 1b 1b 6,19,20 5a 5a 6,13,14,15 3a+5a 3a+5a 3,4,5 1a 1a

39 CONFRONTO InnoLipa-Sequenziamento su 90 campioni Per 82 (91,1%) i genotipi sono risultati concordanti 5 (5,6%) campioni non tipizzabili con il test InnoLipa sono stati tipizzati mediante sequenziamento In 3 (3,3%) casi il test InnoLipa ha evidenziato la presenza di coinfezione mentre il sequenziamento ha rilevato un genotipo unico

40 SEQUENZIAMENTO 1 1a 1b 2 2a 2b 2c 3a 4 4a 4c InnoLipa a 4 1b a/2c b 1 3a c/4d 1 3

41 Risultati ottenuti mediante sequenziamento di una porzione della regione 5 UTR di ceppi provenienti da soggetti con doppia infezione con il test InnoLipa Sequenziamento InnoLipa 2b + 3a 1b + gen4 2a/2c + 4c 3a gen1 2a

42 Risultati ottenuti mediante sequenziamento di una porzione della regione 5 UTR di ceppi con reattività non interpretabili secondo il test InnoLipa Pattern di reattività con il test di ibridizzazione inversa Sequenziamento 6 1b 3,6,9 1b 6,9,10,11 2a 6,9,10,11 2a 5,6,16,17,18 Gen 4

43 Evoluzione.. Test di screening e conferma : Preparazione e valutazione di un chip per rilevare simultaneamente anticorpi anti- HCV diversi (anti-core, NS3,NS4 ed NS5): evidenziate sensibilità e specificità elevate maggiori del test ELISA ed elevata concordanza con il RIBA Zhang W. et al Mol. Diagn. 2005;9(2):81-7 Presented at CSF

44 Genotipizzazione: Sequenziamento contemporaneo di altre regioni Evoluzione.. TaqMan Real-Time Laperche S. et al J Clin Microbiol 2005;43(2): Rolfe K.J. et al J Clin Virol 2005;34: Pyrosequencing Elahi E. et al J Virol Meth 2003;109: Spettrometria di massa Kim YJ et al Clin Chem 2005;51: Cook L. et al Clin Chem 2005; Presented at CSF