Sono endopeptidasi zinco e calcio dipendenti che degradano i componenti della matrice extracellulare (ECM) e risultano coinvolte in numerosi processi
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- Assunta Cirillo
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2 Sono endopeptidasi zinco e calcio dipendenti che degradano i componenti della matrice extracellulare (ECM) e risultano coinvolte in numerosi processi di rimodellamento tissutale, associati alla crescita allo sviluppo ed in varie patologie. In particolare, le MMPs sono sicuramente implicate nella maggior parte dei fenomeni degenerativi ed infiammatori, oltre che nell'attivazione linfocitaria e nella progressione tumorale - in condizioni fisiologiche, la loro attività è il risultato di un attento equilibrio fra l attivazione dello zimogeno e l inibizione da parte di inibitori specifici - in condizioni patologiche, si assiste ad una proteolisi incontrollata che causa un eccessiva degradazione della ECM con l insorgere di numerose patologie
3 Matrice Extracellulare E data da polisaccaridi e proteine altamente versatili che vengono secrete localmente e si assemblano in una rete organizzata
4 La matrice extracellulare (ECM)degradata dalle MMPs è una entità strutturale complessa che circonda e supporta le cellule all interno dei tessuti, influenzandone la crescita, la migrazione ed il differenziamento ECM L ECM viene secreta localmente ed è assemblata in una struttura reticolare nello spazio che circonda le cellule: occupa, quindi, una parte importante del volume di qualunque tessuto
5 La degradazione dell'ecm è collegata sia a processi fisiologici che patologici, che vanno dalla morfogenesi e guarigione delle ferite all invasione e metastasi tumorale Sono le MMPs che garantiscono Il turnover di queste componenti della matrice L ECM svolge diverse funzioni : per esempio, le proteine della matrice sequestrano molecole come l'acqua per garantire il turgore dei tessuti molli, o minerali per fornire rigidità ai tessuti scheletrici o fattori di crescita per costituirne un serbatoio finalizzato al controllo della proliferazione cellulare. Inoltre, l'ecm fornisce un substrato su cui le cellule possono aderire, migrare, proliferare e che può direttamente influenzare la forma e la funzione delle cellule.
6 The MMP family consists of at least 28 members Cys Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc and calcium dependent enzymes The excess syntheses of MMPs lead to the accelerated matrix degradation associated with a lot of deseases
7 Metallo proteasi: che cosa sono? Famiglia di enzimi contenenti zinco Sono note 28 differenti tipi Degradano la Matrice Extracellulare Massova I. et al.faseb J.
8 COMPLESSITA
9 Le MMP si dividono in: Cinque classi principali: gelatinasi (MMP-2, MMP-9) collagenasi (MMP-1, MMP-8, MMP-13) metalloproteasi di membrana (MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP) stromelisine (MMP-3, MMP-10, MMP-12), matrilisina (MMP-7) Tutte le MMP pur mantenendo un elevata omologia di sequenza si distinguono in base alla efficienza di proteolisi dei componenti della matrice
10 Espressione genica Attivazione dello zimogeno Glicosilazione Inibizione da parte di inibitori specifici
11 gelatin CYS
12 Glicoproteine stabili Peso molecolare compreso fra kda 6 ponti disolfuro conservati 4 tipi scoperti fino ad ora: -TIMP1 (specifico per la MMP-9) -TIMP2 (specifico per la MMP-2) -TIMP3 -TIMP4
13 Le Gelatinasi: MMP-9 e MMP-2 MMP-9 Massova I. et al.faseb J. (1998) 12:
14 L inattività dello zimogeno è attribuibile al complesso fra il gruppo sulfidrilico del residuo di cisteina del propeptide e lo zinco del sito attivo del dominio catalitico.
15 Metallo proteinasi: funzione CONDIZIONI FISIOLOGICHE Ovulazione Ciclo endometriale Gravidanza Guarigione dalle ferite Angiogenesi Rimodellamento osseo Eruzione dentaria CONDIZIONI PATOLOGICHE Disordini demielinizzanti del SNC Cancro Metastasi tumorale Disseminazione leucemica Cardiomiopatia dilatativa Fibrosi cistica Cirrosi epatica Glomerulonefrite Artrite reumatoide
16 Autoimmune disease involving inflammation, demyelinization and neurodegeneration in the CNS Characterized by the attack of myelin by immune system cells Myelin degeneration affects the ability of nerve cells to communicate with each other
17 Esistono 3 forme di Sclerosi Multipla Patologia cronica di tipo infiammatorio, demielinizzante del SNC che provoca invalidità permanente La forma RECIDIVANTE-REMITTENTE caratterizzata da fasi di recrudescenza della malattia in cui compaiono nuovi sintomi o diventano più severi i sintomi già presenti, alternati da fasi di remissione di durata variabile La forma SECONDARIA PROGRESSIVA che colpisce persone in cui è già presente la forma RR ed è caratterizzata da un progressivo aumento dell invalidità La forma PRIMARIA PROGRESSIVA, che colpisce soltanto il 10% delle persone, è data da un esordio lento con costante peggioramento dei sintomi.
18 I leucociti per poter entrare nel SNC producono le MMPs. LE MMPs prodotte in eccesso nel SNC provocano da un lato un ulteriore danno di barriera e dall altro demielinizzazio ne incremento dell infiammazi one e neurotossicità
19 In particolare nella Sclerosi Multipla le placche (che si evidenziano con la risonanza magnetica )sono caratterizzate da un cuffing perivascolare al cui epicentro della zona infiammatoria un gradiente di chemochine attira i leucociti che si attivano a secernere la gelatinasi B o MMP9 che andrà a distruggere i componeti la BBB come pure la mielina con conseguente risposta autoimmune e perpetuando l infiammazione
20 1. interazione ad alta affinità (nm): Legame fra i domini C- terminali di entrambe le molecole Bassa affinità 2. Interazione a bassa affinità (µm): Legame fra il dominio N- terminale del TIMP1 e il sito attivo dell enzima Alta affinità
21 Plasminogen activation upa,tpa Plasminogen Plasmin Pro-collagenase MMP1,8,13 Collagenase MMP1,8,13 Pro-Stromelysin MMP3,10,11 Stromelysin MMP3,10,11 TIMP1 TIMP2 Pro-gelatinase B MMP-9 Gelatinase B MMP-9 Pro-gelatinase A MMP-2 Gelatinase A MMP-2 Membrane Metalloproteinase MMP14,15,16,17
22 Matrix Metalloproteinase-9 (MMP9) is present in biological fluids in different forms, as we can see by zymography MMP-9 Inactive form or Pro-MMP-9 ( 92 kda) Partially activated form (84-82kDa) Fully activated form (66 kda). ACTIVE FORMS
23 MMP9 secreted as proenzyme (92KDa) Activated by APMA TRYPSIN MMP3 83 kda inactive 74KDa e 68KDa 70KDa 67 kda active 64KDa 64KDa active
24 MW Zimografia 92 kda 82 kda 72kDa 68kDa A B C D MMP9 standard MMP9 standard + APMA CSF CSF+APMA
25 Ki=nM TIMP-1 Non-active enzyme (zymogen), 92 KDa
26 Ki=nM TIMP-1 Partially activated form 82Kda
27 TIMP-1 Ki= M TIMP-1 fully activated form (66 kda). Is the really dangerous form!!!!
28 Così abbiamo differenziato il dosaggio analizzando solo la quantità di MMP-9 attiva nel liquor e nel siero di pazienti con Sclerosi Multipla raggruppando i pazienti in relazione al tipo di SM (RR, SP,PP), allo stato clinico al momento del prelievo,ed al risultato delle indagini della Risonanza Magnetica.
29 La MMP2 a differenza della 9 sembrerebbe essere coinvolta nella riparazione dei tessuti come per es per la mielina e il danno assonale Siamo andati a vedere allo stesso modo della 9 come varia l attività della mmp2 e del suo inibitore timp2 nel siero e nel liquor di pazienti SM Il rapporto MMP-2attiva /timp2 aumenta nel liquor e nel siero di pazienti RR stabili alla risonanza rispetto a quelli in fase attiva
30 J Biochem May;151(5): Epub 2012 Feb 17. Matrix metalloproteinase-9 activity detected in body fluids is the result of two different enzyme forms. Bellini T, Trentini A, Manfrinato MC, Tamborino C, Volta CA, Di Foggia V, Fainardi E, Dallocchio F, Castellazzi M. Separation of MMP-9 from MMP-2 by affinity chromatography and immunoprecipitation shows that the 66 kda form of MMP-9 is present in serum of healthy donors The 66 kda MMP-9 lacks of the hemopexin domain required for the high affinity binding of the tissutal inhibitor TIMP-1, a nd can be evaluated by activity assay in the presence of TIMP-1 This opens the possibility to investigate the role of this form of MMP-9 that escapes the physiological regulation.
31 TIMP-1 ECM MMP-9 (82Kda) MMP-2 X MMP-9 (66Kda) TIMP-1
32 MMP-9 MMP-2 MS disease activity could be easily monitored. Serum active MMP-9/TIMP-1 ratio indicators of MS inflammatory disease activity Serum active MMP-2/TIMP-2 ratio indicator of resolution of MS inflammation
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