SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica VI CONGRESSO NAZIONALE FITeLab Slow Medicine Laboratory: IT s the Future 1-2-3 Ottobre 2015 Ospedale Borgo Roma (Verona) La farmacogeneticanella gestione del paziente con tumore colorettale, l esperienza traslazionaleal CRO di Aviano Parte tecnico-pratica Franca SARTOR TLBM Farmacologia Sperimentale e Clinica CRO Aviano
Screening pre-terapeutico di markers farmacogenetici correlati alle tossicitàda chemioterapia 0 alleli varianti DPYD Dose Standard Pazienti candidati a chemioterapia a base di Fluoropirimidinee/o Irinotecano UGT1A1*28/*28 Dose IRI 70% Screening genetico pre-terapia DPYD*2A DPYD*13 DPYD-2846A>T UGT1A1*28 UGT1A1*1/*1 UGT1A1*1/*28 Possibile inclusione negli studi di fase 1b 1 allele variante DPYD 2 o piùalleli varianti DPYD Riduzione Dose Fluoropirimidine del 50% Prediligere una terapia alternativa
DESCRIZIONE DEL PROCESSO Diagramma di flusso INIZIO Arrivo campione da analizzare Accettazione e registrazione Identificazione campione CORRETTA NO Ricontattare il richiedente SI Analisi immediata NO Stoccaggio temporaneo SI Analisi campione SI NO Analisi effettuata correttamente SI Emissione del referto e stoccaggi del campione biologico residuo FINE
SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica TIPO DI ANALISI RICHIESTE/DISPONIBILI
Polimorfismi del gene DPYDe tossicitàsevera da fluoropirimidine Metabolismo cellulare dei Fluoro-derivati DPD E L ENZIMA CHIAVE LIMITANTE PER LA DETOSSIFICAZIONE DEI FLUORO-DERIVATI NELLE CELLULE Polimorfismi indagati: DPYD *2A (IVS14+1A/G, rs3918290) DPYD *13 (1679T/G, rs55886062) DPYD 2864 A/T (rs67376798)
Polimorfismi delle isoforme UGT1A1 e UGT1A7 e terapia basata sull IRINOTECANO UGT1A1 E UGT1A7 SONO LE ISOFORME DELL ENZIMA UGT MAGGIORMENTE IMPLICATE NEL CATABOLISMO DELL IRINOTECANO
UO Complessa di Farmacologia Sperimentale e Clinica STRUMENTI UTILIZZATI PER L ANALISI Pyrosequencing e Sequenziatore per analisi frammenti
Pyrosequencing PSQ 96 MA (BiotageAB) PyroMark Q96 ID (Qiagen)
Pyrosequencing Reazione di Minisequenziamento per sintesi Tale metodica si basa su una quantificazione luminometrica indiretta dei gruppi pirofosfato (PP i ) che vengono liberati dai nucleotidi man mano incorporati durante la sintesi di un filamento di DNA complementare ad un templato stampo.
Assay design Richiesti 3 PRIMERS Due primers (di cui uno biotinilato) per l amplificazione tramite PCR della zona target contenente lo SNP Primer biotinilato[conc]< 0,2µM Prodotto PCR 200-300 bp Un primerdi sequenza Complementare al filamento biotinilato Tm: 40 C-50 C Lunghezza: circa 15 basi. Posizionamento flessibile: terminale 3, dopo appaiamento col filamento biotinilato (toglierei), deve risultare collocato adiacentemente al sito polimorfico Quando la base polimorfica forma un omopolimerocon le basi adiacenti il primerdi sequenza deve sovrapporsi alla regione omopolimerica
Forward / Reverse Pyrosequencing assay
Pyrosequecing Assay 1) 2) 3) PREPARAZIONE del CAMPIONE Amplificazione della regione di DNA contenente lo SNP (Y/R)tramite PCR con un primer BIOTINILATO (B) separazione del singolo filamento biotinilato Y/R B appaiamento con il primer di sequenza primer di sequenza Y/R B IMPIEGO del PYROSEQUENZIATORE Aggiunta di un nucleotide alla voltasecondo un preciso ordine di dispensazione primerdi nucleotidi incorporati sequenza NNNNNNN Y/R B 1) liberazione di gruppo PPi 2)emissione di luce visibileche viene evidenziata nel pirogramma tramite un picco proporzionale ai dntps incorporati 3)spegnimentodel segnale (apirasi) e aggiunta del nucleotide successivo Sequenza nucleotidica 4) sintesi del filamento complem. e determinazione della sequenza Nucleotidi aggiunti
Pyrosequecing: esempio di risultati C/C wild type C/T eterozigote T/T mutato
DPYDin DIAGNOSTICA SNP analizzati DPYD *2A (IVS14+1A/G, rs3918290) DPYD *13 (1679T/G, rs55886062) DPYD 2864 A/T (rs67376798)
SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica SEQUENZIATORE PER ANALISI DEI FRAMMENTI
Sequenziatoreper analisi frammenti geneticanalyzerabi PRISM 3100
Analisi dei frammenti Metodica basata su una elettroforesi capillare associata ad un analisi di fluorescenza impiegata per studiare STR (short tandem repeats) o delezioni/inserzioni in quanto permette di separare frammenti di DNA di lunghezza diversa, amplificati utilizzando un primer marcato con un fluoroforo, in base alla loro dimensione. 2 1 3 Schema del processamento di frammenti di DNA all interno dello strumento Genetic Analyzer ABI Prism 3100 4 Interpretazione dei risultati con il software Gene Scan Separazione di frammenti di DNA di varie dimensioni marcati con differenti fluorofori (rosso=rox, verde=joe, giallo=liz) Il più piccolo èil piùveloce ed esce per primo (t 1 ) mentre il più grande esce per ultimo (t 3 ).
Esempio: determinazione dell UGT1A1*28 94bp 6/6 ripetizioni 94bp 96bp 6/7 ripetizioni 96bp 7/7 ripetizioni
SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica ANALISI DEI DATI E REFERTAZIONE
DNLAB
DNfirma
INTERPRETAZIONE RISULTATI SUGGERIMENTI DPYD WT per tutte e tre le varianti: Non sono state riscontrate controindicazioni genetiche all'utilizzo di un dosaggio standard di fluoro pirimidine. Eterozigote per una sola variante: Sulla base della variazione genetica riscontrata èconsigliabile una riduzione del dosaggio iniziale di fluoroprimidine al 50% della dose standard per limitare l incidenza di tossicitàsevera al trattamento, in base alle linee guida SIF-AIOM. Un aggiustamento successivo della dose può essere effettuato in accordo con le norme della normale pratica clinica. Eterozigote per più di una variante Sulla base delle variazioni genetiche riscontrate èconsigliabile valutare l utilizzo di una terapia alternativa alle fluoroprimidine per l alto rischio di sviluppare tossicità severa al trattamento. Omozigote mutato per una delle varianti: èconsigliabile valutare l utilizzo di una terapia alternativa alle fluoroprimidine per l alto rischio di sviluppare tossicità severa al trattamento. UGT1A1*28 *1/*1(WT): Non sono state riscontrate controindicazioni genetiche all'utilizzo di un dosaggio standard di irinotecano. *1/*28 (ETEROZIGOTE): Non sono state riscontrate controindicazioni genetiche all'utilizzo di un dosaggio standard di irinotecano. *28/*28(MUTATO): Sulla base della variazione genetica riscontrata èconsigliabile una riduzione del dosaggio iniziale di irinotecano al 70% della dose standard per limitare l incidenza di tossicitàsevera al trattamento, in base alle linee guida SIF-AIOM. Un aggiustamento successivo della dose può essere effettuato in accordo con le norme della normale pratica clinica.
SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica GRAZIE PER L ATTENZIONE