resented at CSF LA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI DA HCV: STATO DELL ARTE M. Crovatto Prevalenza dell infezione: 2% = 123 milioni di persone Shepard C W, Finelli L, Alter M Global epidemiology of hepatitis C virus infection September. Lancet Infect. Dis. 2005; 5:558-67
Test di screening Test supplementare Immunoblot HCV RNA qualitativo HCV RNA quantitativo Genotipizzazione Presented at CSF
TEST QUANTITATIVI PER HCV RNA Cobas Amplicor HCV Monitor UI/ml LCx HCV Assay UI/ml ABI 7000 UI/ml Versant HCV RNA 3.0 Assay UI/ml Cobas TaqMan HCV UI/ml 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 10 9 10 10 UI/ml
EVOLUZIONE TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE PCR Real Time Presented at CSF
Range dinamico e sensibilità tests eseguibili con Cobas TaqMan 48 e ABI 7000 (Real Time) Test Range dinamico Sensibilità HCV 43-69.000.000 UI/ML 15 UI/ML Ampliprep + Cobas TaqMan 48 ABI 7000 Test Range dinamico HCV 10-10.000.000 10.000.000 UI/ML Cobas TaqMan 48
HCV Preparazione automatizzata del campione (e QS) su COBAS Ampliprep (lisi, cattura del DNAcon particelle di vetro magnetizzate, eluizione) Retrotrascrizione, Amplificazione e contemporanea rilevazione su Cobas Taqman 48, mediante segmentazione di una sonda oligonucleotidica specifica a doppia etichetta per il bersaglio ed una specifica per il QS (coloranti fluorescenti del reporter diversi) Sequenza operativa Estratto Azione AmpErase Trascrizione inversa Denaturazione Annealing Estensione Cicli PCR Presented at CSF PCR Analisi dei dati & Calcoli Risultato
AmpliLink 3.0.1 - Suggerimenti Presented at CSF
STRUMENTAZIONI COBAS Ampliprep (CAP) COBAS TaqMan 48
TaqMan HCV LOG IU/ml 7,50 6,50 5,50 4,50 y = 0,9556x + 0,11 r = 0.92 p = 0,001 3,50 3,50 4,50 5,50 6,50 7,50 Presented at CSF AMPLICOR HCV MONITOR LOG IU/m l
Genotipo HCV-Q Monitor HCV-Q TaqMan Differenza Log 2a/2c 4.4 x 10 5 4.37 x 10 4 1 2a/2c 4.1 x 10 3 1.20 x 10 4 0,5 NT 7.7 x 10 5 2.04 x 10 5 0,6 3a 2.8 x 10 5 4.6 x 10 4 0,8 3a 4.9 x 10 6 2.6 x 10 6 0,3 2a/2c 1.2 x 10 5 9.2 x 10 4 0,5 3a 1.8 x 10 5 7.8 x 10 4 0,4 2 3 x 10 6 1.2 x 10 6 0,4 4c/4d 4.5 x 10 5 3.6 x 10 5 0,1 2a/2c 1.6 x 10 5 1.3 x 10 4 1,1 3a 4.4 x 10 5 4.9 x 10 4 1 4c/4d 5.1 x 10 4 2.4 x 10 4 0,3 2a/2c 2.24 x 10 4 3.36 x 10 4 0,2 2 1.86 x 10 3 4.23 x 10 3 0,4 Presented at CSF
Genotipo Amplicor TaqMan Diff. Log 2a 5.15 x 10 6 2.01 x 10 6 5150000 2010000 0,408611172 gen 4 3.86 x 10 6 1.09 x 10 6 3860000 1090000 0,549160807 2a 8.88 x 10 5 2.47 x 10 5 888000 247000 0,555716013 2a 8.74 x 10 4 8.6 x 10 4 87400 86000 0,007012981 4c 8.75 x 10 6 2.78 x 10 6 8750000 2780000 0,497963257 3a 2.02 x 10 7 2.28 x 10 7 20200000 22800000-0,05258348 4c 8.84 x 10 5 4.14 x 10 5 884000 414000 0,329451924 2b + 3a 2.1 x 10 5 9.41 x 10 4 210000 94100 0,348629671 gen 4 2.08 x 10 6 9.73 x 10 5 2080000 973000 0,329950495 2b 4.32 x 10 6 1.52 x 10 6 4320000 1520000 0,453640159 3a 3.1 x 10 4 2.02 x 10 4 31600 20200 0,194335713 gen 2 1.2 x 10 6 7.88 x 10 5 1200000 788000 0,182655029 4a 2.36 x 10 4 1.11 x 10 4 23600 11100 0,327589024 gen 4 + gen1 4.8 x 10 4 3.55 x 10 4 48000 35500 0,131012884 3a 3.24 x 10 7 6.44 x 10 6 11000000 6440000 0,232506818 gen 4 3.9 x 10 5 2.31 x 10 5 390000 231000 0,227452627 1a 2.62 x 10 6 1.09x10 6 2620000 1090000 0,380874793 Presented at CSF 2a 4.05 x 10 6 9.84 x 10 5 4050000 984000 0,614459925 2c 3.1 x 10 4 2.66 x 10 4 31700 26600 0,076177626
Amplicor TaqMan Diff. Log 2.15 x 10 3 2.27 x 10 3 2150 2270-0,0235874 4.49 x 10 3 2.91 x 10 3 4490 2910 0,188353352 4.92 x 10 6 2.04 x 10 6 4920000 2040000 0,382334935 8.78 x 10 4 1.61 x 10 5 87800 161000-0,26333136 1.99 x 10 7 6.18 x 10 6 19900000 6180000 0,507864601 5.14 x 10 6 2.11 x 10 6 5140000 2110000 0,386680664 7.20 x 10 6 2.18 x 10 6 7200000 2180000 0,518876003 2.12 x 10 5 1.11 x 10 5 212000 111000 0,281012882 TL <15 TL TL TND TND TL <15 TL TL TND TND Presented at CSF TL <15
Simmonds P et al. Consensus Proposals for Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes.HEPATOLOGY 2005; 42(4) : 962-973 Presented at CSF
Simmonds P et al. Consensus Proposals for Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes.HEPATOLOGY 2005; 42(4) : 962-973 Differenza tra genotipi: 31-33% Differenza tra sottotipi: 20-25% Ricombinazione In Russia è stata evidenziato un ricombinante contenente geni strutturali del genotipo 2k e geni non strutturali del genotipo 1b che si sta diffondendo rapidamente tra i tossicodipendenti Ricombinanti 1a/1b descritti anche in Peru Rilevamento della sequenza genomica completa del ricombinante da 3 o piu soggetti Ogni nuovo ricombinante deve avere i breakpoints nella stessa posizione in ciascuna sequenza Deve essere numerato sequenzialmente in ordine di scoperta con le lettere identificanti i sottotipi in ordine alfabetico: RF 01_1b2k
Definizione di un nuovo genotipo: Definizione provvisoria : richiede la sequenza della regione codificante completa, la dimostrazione della diversità rispetto agli altri genotipi mediante analisi filogenetica e l assenza di ricombinazione Conferma definizione: richiede la sequenza della regione codificante di 2 o piu varianti da infezioni che non sono direttamente correlate epidemiologicamente
Definizione di un nuovo sottotipo: Definizione provvisoria : sequenza delle regioni core/e1 ed NS5B da 3 o piu ceppi provenienti da soggetti diversi Conferma definizione: sequenza completa di uno o più genomi
Nomenclatura genotipi di HCV: proposta modifica Nom. Attuale Nom. Proposta Ceppo Regione sequenziata Genotipo 2 2j 2k RU169 NS5B,3 UTR 2l 2j BA047 NS5B,3 UTR 2e 2n NL50 C/E1,NS5B 4f/2f 2o FR4 C/E1,NS5B f 2p NL33 C/E1,NS5B 2k 2q BA045 NS5b,3 UTR Genotipo 3 10a 3k HPCJK049E1 Genoma completo Genotipo 4 4a 4r Z4 C/E1 4 alfa 4n 1359 C/E1 4 beta 4o 2153 C/E1,NS5B Genotipo 6 7d 6c Th846 C/E1,NS5B 7b 6d VN235 Genoma completo 7a 6e VN540 C/E1,NS5B 7e 6f BB7 NS5B 7c 6f Th271 C/E1,NS5B 11a 6g HPCJK046E Genoma completo 9a 6h VN004 Genoma completo 9b 6i Th555 C/E1,NS5B 9c 6j Th553 C/E1,NS5B 8b 6k VN405 Genoma completo 8a 6l VN507 C/E1 Differenza tra i genotipi a livello nucleotidico: 31% - 33% Differenza tra i sottotipi: 20% - 25% Simmonds P. et al. Hepatology, October 2005:962-973 Presented at CSF
Nuova classificazione proposta Presented at CSF Genotipo 1 Sottotipi: 1a,1b,1c,1d,1e,1f,1g,1h, 1i,1j,1k,1l Genotipo 2 Sottotipi: 2a,2b,2c,2d,2e,2f,2g,2h,2i, 2j,2k,2l,2m,2n,2o,2p,2q Genotipo 6 Sottotipi: 6a,6b,6c,6d,6e,6f,6g,6h,6i, 6j,6k,6l,6m,6n,6o,6p,6q Genotipo 3 Sottotipi: 3a,3b,3c,3d,3e,3f,3g,3h,3i, 3k Genotipo 5 Sottotipi: 5a Genotipo 4 Sottotipi: 4a,4b,4c,4d,4e,4f,4g,4h,4i, 4j,4k,4l,4m,4n,4o,4p,4q,4r, 4t Simmonds P. et al. Hepatology, October 2005:962-973
ORF (9379-9431 nt) Regione strutturale Regione non strutturale 5 NC (IRES) traduzione 3 NC Precursore della poliproteina Presented at CSF Modificazioni co- e posttraduzionali Signalasi cellulari dell ospite Proteinasi NS2- NS3 Zndipendente dell HCV Proteinasi serinica dell HCV NS3 C E1 E2 p7 NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B Core Glicoproteine dell envelope Viroporina Proteinasi Zn-dipendente Proteinasi serinadipendente Elicasi NTPasi Cofattore di NS3 Ancoraggio alla membrana Proteina regolatrice dell RNA polimerasi RNA polimerasi RNAdipendente
Genotipizzazione mediante Ibridizzazione Inversa
INNOLIPA HCV
FREQUENZA GENOTIPI 2000-2004 NUMERO 600 500 400 300 200 100 GEN 1 22 GEN 2 16 GEN 4 19 1a 57 1b 522 2a/2c 332 2b 4 3a 176 4c/4d 21 5a 2 0 COINF 13 NON TIP 6 NON TIP COINF 5a 4c/4d 3a 2b 2a/2c 1b 1a GEN 4 GEN 2 GEN 1 GENOTIPI
Richieste ripetute di genotipizzazione (2000-2004): 2x 131 3x 19 4x 7 Media: 17 mesi Range 1-59 5x 1 6x 7 8x 1 Tot. 166=236 test Il genotipo è risultato sempre lo stesso
Genotipizzazione mediante sequenziamento Presented at CSF
TRUGENE TM HCV 5 NC KIT Viral RNA (9400 nucleotides) Cy5.5 5 NC C E1 HCV-RNA Virale (9400 nucleotidi) E2 NS2 NS3 NS4 NS5A NS5B 3 NC Cy5 Core Envelope Glicoproteine Metallo proteasi Proteasi Elicasi RNA Polimerasi La regione sequenziata dell HCV-RNA è la 5 NC ( 186 basi )
A C T G MicroCel Cassette T G Filters Laser Excitation of Cyanine Dyes B. Chanzy, CH Annecy, 2000 Presented at CSF Photomultiplier Tubes
OpenGene System Optical Array Object Lenses Filters Image Lenses Cy5.5 Image Lenses Photo detector Cy5 Photo detector Cy5.5 Gel Laser
OpenGene System Optical Array Object Lenses Filters Image Lenses Cy5 Image Lenses Photo detector Cy5 Photo detector Cy5.5 Gel Laser
Correlazione con un cromatogramma N N
Allineamento e Chiamata delle Basi A C G T
Campioni CQ NeQas 7531 HCV 05-01 NeQas HCV 05-02 NeQas HCV 05-03 NeQas HCV 05-04 NeQas HCV 05-05 NeQas HCV 05-07 NeQas HCV 05-08 NeQas Reattività InnoLipa Genotipo Sequenziamento 3,4,6 1b 1b 3,4,6,13,14,15 1b + 3a 1b 13,14,15 3a 3a 13,14,15 3a 3a 3,4,6 1b 1b 6,19,20 5a 5a 6,13,14,15 3a+5a 3a+5a 3,4,5 1a 1a
CONFRONTO InnoLipa-Sequenziamento su 90 campioni Per 82 (91,1%) i genotipi sono risultati concordanti 5 (5,6%) campioni non tipizzabili con il test InnoLipa sono stati tipizzati mediante sequenziamento In 3 (3,3%) casi il test InnoLipa ha evidenziato la presenza di coinfezione mentre il sequenziamento ha rilevato un genotipo unico
SEQUENZIAMENTO 1 1a 1b 2 2a 2b 2c 3a 4 4a 4c InnoLipa 1 1 3 3 1a 4 1b 4 19 2 4 1 2a/2c 1 16 1 2b 1 3a 15 4 3 1 1 4c/4d 1 3
Risultati ottenuti mediante sequenziamento di una porzione della regione 5 UTR di ceppi provenienti da soggetti con doppia infezione con il test InnoLipa Sequenziamento InnoLipa 2b + 3a 1b + gen4 2a/2c + 4c 3a gen1 2a
Risultati ottenuti mediante sequenziamento di una porzione della regione 5 UTR di ceppi con reattività non interpretabili secondo il test InnoLipa Pattern di reattività con il test di ibridizzazione inversa Sequenziamento 6 1b 3,6,9 1b 6,9,10,11 2a 6,9,10,11 2a 5,6,16,17,18 Gen 4
Evoluzione.. Test di screening e conferma : Preparazione e valutazione di un chip per rilevare simultaneamente anticorpi anti- HCV diversi (anti-core, NS3,NS4 ed NS5): evidenziate sensibilità e specificità elevate maggiori del test ELISA ed elevata concordanza con il RIBA Zhang W. et al Mol. Diagn. 2005;9(2):81-7 Presented at CSF
Genotipizzazione: Sequenziamento contemporaneo di altre regioni Evoluzione.. TaqMan Real-Time Laperche S. et al J Clin Microbiol 2005;43(2): 733-739 Rolfe K.J. et al J Clin Virol 2005;34:115-121 Pyrosequencing Elahi E. et al J Virol Meth 2003;109: 171-176 Spettrometria di massa Kim YJ et al Clin Chem 2005;51:1123-1131 Cook L. et al Clin Chem 2005;51.1091-1092 Presented at CSF