Cromatografia ed Elettroforesi Prof.ssa Flavia Frabetti Esplorando le proteine Un passaggio indispensabile negli studi di biochimica che necessitano di conoscere la sequenza aa di una proteina per potere spiegare la sua struttura tridimensionale e dunque il suo funzionamento è la PURIFICAZIONE della proteina di interesse Tre metodi chiave: cromatografia elettroforesi ultracentrifugazione 1
CROMATOGRAFIA metodo fisico di separazione dei componenti di una miscela complessa può essere analitica o preparativa di solito per arrivare alla purificazione completa di una sostanza si deve usare una sequenza di più metodi cromatografici il fondamento di tutte le tecniche cromatografiche è il coefficiente di ripartizione (o coefficiente di distribuzione) Kd che descrive come il composto si distribuisce tra due fasi immiscibili. si realizza attraverso l utilizzo di un sistema cromatografico fase stazionaria impaccata in un letto cromatografico fase mobile sistema di distribuzione della fase mobile sistema di rilevazione I singoli componenti di una miscela vengono separati sulla base di differenti CARATTERISTICHE FISICHE: dimensione e forma carica volatilità solubilità affinità di legame per molecole specifiche la separazione dei singoli componenti di una miscela è resa possibile dalla diversa interazione degli stessi con la fase stazionaria interazione forte interazione scarsa ritardo maggiore ritardo minimo tempi di eluizione > tempi di eluizione < 2
Lessico scientifico Eluire = lavare via, staccare via, distaccare una sostanza dalla fase stazionare alla quale ha aderito per una specifica affinità Fase = componente del sistema caratterizzato da una uniforme composizione chimica e proprietà fisiche (densità, struttura cristallina, ecc.) miscela fase fase mobile stazionaria rilevatore Si inietta una miscela da analizzare su una colonna I componenti avanzano a diverse velocità attraverso il mezzo di conduzione ovvero la fase mobile, a seconda del grado di affinità per la fase stazionaria, il tempo di uscita verrà registrato dal rilevatore 3
Tipologie dei sistemi cromatografici La classificazione può avvenire in base a: forma del letto cromatografico metodo di separazione natura delle fasi mobile o stazionaria Tipologia-classificazione Forma del letto cromatografico es. su strato sottile (es.carta) o su colonna Cromatografia su CARTA colonna contenente la fase stazionaria caricamento campione aggiunta solvente Cromatografia su STRATO SOTTILE raccolta dei componenti 4
Tipologia-classificazione Metodo di separazione 1) cromatografia di partizione o ripartizione separazione sulla base della solubilità di molecole piccole ripartizione tra due fasi liquide: acqua che permea una matrice solida inerte + fase mobile organica non polare cromatografia a fase inversa (vedi HPLC) matrice inerte di supporto fase stazionaria liquida molecole non polari che si sciolgono nella fase stazionaria flusso della fase mobile molecole polari che passano velocemente attraverso la colonna Metodo di separazione 2) cromatografia per gel permeazione (o esclusione molecolare) separazione sulla base della dimensione fase stazionaria = granuli porosi di un polimero insolubile ma molto idratato molecole piccole che hanno accesso all intera matrice molecole medie che hanno accesso solo ai pori più larghi fase stazionaria gel microporoso molecole grandi che sono totalmente escluse dai pori e passano rapidamente attraverso la colonna flusso della fase mobile 5
Metodo di separazione 3) cromatografia a scambio ionico separazione sulla base della carica fase stazionaria = colonne con resine: cariche + (es.dietilamminoetil-cellulosa o DEAE-cellulosa) oppure cariche - (es.carbossimetil-cellulosa o CM-cellulosa) fase stazionaria resina a scambio cationico + + _ - - - + + + flusso della fase mobile - - cationi (+) del campione che vengono trattenuti dalla colonna Separazione di aa in una colonna a scambio cationico Colonna a scambio cationico Asp Ser Lys 6
Metodo di separazione 4) cromatografia per affinità separazione sulla base ad una affinità chimica di legame fase stazionaria = colonne dove viene immobilizzato un ligando specifico per una certa molecola che ha una struttura complementare che specificamente riconosce quel ligando fase stazionaria: matrice solida di supporto tratto spaziatore ligando molecola complementare legata da interazioni specifiche al ligando flusso della fase mobile tutti gli altri soluti vengono eluiti Tipologia-classificazione fase stazionaria: solido/gel o liquido Natura delle fasi mobile o stazionaria fase mobile: liquido o gas Tipo es. Gascromatografia Cromatografia liquida (LC) Cromatografia su strato sottile (TLC) Cromatografia a Scambio ionico (IEC) Fase stazionaria Solida o liquida solida solida solida Fase mobile gas liquida liquida liquida 7
Tipologia-classificazione fase stazionaria: solido/gel o liquido Natura delle fasi mobile o stazionaria esempi: fase mobile: liquido o gas cromatografia liquida-liquida: HPLC cromatografia ad alta performance o cromatografia liquida ad alta pressione pompa rilevatore colonna Fase stazionaria solida cromatografia gas -liquida: gas-cromatografia carrier gas Esempio di un cromatogramma Deve avere una buona risoluzione 8
t R2 t M t R1 Δt inizio picco di un soluto non trattenuto W b1 W b2 t R = tempo di ritenzione t M = tempo di ritardo della fase mobile t R1 = t R -t M Δt = distanza tra i 2 picchi RISOLUZIONE R= Δt W b1 +W b2 2 se R = 1.5 separazione completa ELETTORFORESI metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica di molecole cariche, sottoposte ad un campo elettrico si realizza attraverso l utilizzo di un sistema elettroforetico matrice di gel cella elettroforetica alimentatore (in cui applicare voltaggio o intensità di corrente costante) tamponi salini si possono studiare sia gli acidi nucleici (DNA e RNA) sia le proteine 9
Matrice di gel serve da setaccio molecolare e consente la separazione Come si forma il gel? può essere fatto di polimeri agarosio o poliacrilamide Gel di agarosio: pesare l agarosio misurare il buffer (TBE/TAE) bollire l agarosio in buffer versare il gel nella vaschetta allestita Gel di acrilamide: miscelando acrilamide e bis-acrilamide che formano un polimero complesso a maglia* Gel di acrilamide utili soprattutto per la separazione e caratterizzazione di proteine di solito in sistemi verticali la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel dipende principalmente da 4 parametri taglia molecolare del peptide concentrazione di acrilamide conformazione della molecola (denaturata o meno) voltaggio 10
Spesso si procede in condizioni denaturanti - SDS PAGE PAGE = Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi delle proteine è di norma realizzata facendo polimerizzare la poliacrilamide tra due vetri piatti e la corsa viene eseguita in un sistema verticale SDS = detergente (sodio-dodecil-solfato) carico - catodo anodo supporto di plastica campione pozzetti con i campioni tampone tampone DENATURAZIONE DELLE PROTEINE bollitura proteina tetramerica proteina monomerica SDS = Sodio Dodecil-Solfato (detergente anionico) BME = β- mercaptoetanolo (riducente) bollitura peptidi connessi da ponti disolfuro peptidi separati 11
Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi (in kilodalton) 8 200-25 10 100-15 12.5 70-10 15 60-6 20 40-4 ph basico II fase: separazione dimensionale I fase: sep. x carica ph acido ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE SU GEL o ISOELECTROFOCUSING punto isoelettrico (pi): il ph al quale la carica netta di una proteina è nulla per un bilancio tra + e -, qui La proteina non sarà più soggetta a migrazione elettroforetica Dal Chieffi riquadro 2.2 pag:44-48 12
Rivelazione della separazione elettroforetica: tramite colorazione aspecifica di tutte le proteine della miscela (es. con comassie blue o silver-stain) trasferimento, anche qui elettroforetico, su opportune matrici attraverso la tecnica del Western Blotting per analisi più fini, specifiche 1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi 2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici 1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi consente di evidenziare proteine neo-sintetizzate ed analizzare il turn-over proteico. L isotopo radioattivo più usato è lo zolfo 35 S 2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici consente di riconoscere una specifica proteina di interesse consta di diverse fasi schematizzabili in: a) elettrotrasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa b) rivelazione con l anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) 13
a) elettrotrasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa trasferimento delle proteine carta imbevuta di tampone carta imbevuta di tampone proteina di interesse b) rivelazione con l anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) - fasi procedurali la membrana viene saturata da proteine inerti anticorpi I legano l antigene anticorpi II legano gli anticorpi I sviluppo della colorazione enzimatica 14
Stima della dimensione di una molecola in rapporto alla mobilità elettroforetica di std di dimensione nota (questo vale anche per le proteine) Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi (in kilodalton) Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine 8 200-25 10 100-15 12.5 70-10 15 60-6 20 40-4 15