IV Congresso Nazionale Le Micotossine nella Filiera Agro-Alimentare Alimentare Aptameri a DNA: materiali innovativi per l'analisi di micotossine Annalisa De Girolamo, Roberto Schena, Angelo Visconti Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA) Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) Roma, 11-13 Giugno 2012
Anticorpi Vantaggi Elevata selettività e specificità di riconoscimento Vasto campo di applicazione Svantaggi Produzione in-vivo Suscettibilità alla denaturazione Variabilità tai tra lotti di pod produzione Costi elevati
Materiali innovativi per l analisi di micotossine Polimeri sintetici (Molecularly Imprinted Polymers, MIP) Frammenti di anticorpi Tratto da: Maragos, 2009. Anal Bioanal Chem 395:1205 Peptidi sintetici Ciclodestrine Aptameri Tratto da: Giraudi et al., 2007. J Chromatog A 2:174 Tratto da: Maragos et al., 2008. Food Addit Contam Part A, 25:164
Cosa sono gli aptameri? Brevi catene oligonucleotidiche a singolo filamento (ssdna or RNA) Sintetizzati mediante un processo di selezione e amplificazione in vitro chiamato SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) Sono in grado di legare con elevata specificità ed affinità la molecola bersaglio (proteine, vitamine, cellule intere, antibiotici, micotossine). Le interazioni tra aptamero e molecola bersaglio sono di tipo non-covalente (legami idrogeno, interazioni elettrostatiche, forze di van der Waals).
Aptameri vs anticorpi Produzione in-vitro Lunga shelf-life Elevata riproducibilità tra i lotti di produzione Elevata stabilità (presenza di solventi, bassi ph) Denaturazione reversibile senza perdita di specificità Costi di produzione contenuti Facilmente modificabili con traccianti o fluorofori senza perdita di selettività e specificità
Processo di selezione SELEX Sequenza fissa (18-20 nt) 5 - Regione random (20-80 nt) Sequenza fissa (18-20 nt) -3 1. Libreria i random di aptameri (10 13-10 15 aptameri) Prodotto amplificato Molecola bersaglio 2. Legame 5. Amplificazione PCR Aptameri specifici 3. Lavaggio 4. Eluizione Aptameri non specifici
Processo di selezione SELEX 6. Clonaggio 7. Sequenziamento 8. Studi di affinità Prodotto amplificato Molecola bersaglio 2. Legame 5. Amplificazione PCR Cicli SELEX (da 6 a 20) Aptameri specifici 3. Lavaggio 4. Eluizione Selezione negativa Aptameri non specifici Molecole simili
Aptameri specifici per micotossine Ocratossina A (OTA) - Cruz-Aguado JA and Penner G., 2008. J Agric Food Chem, 56:10456 - Barthelmebs L, Jonca J, Hayat A, Prieto-Simon B, Marty JL 2011. Food Control 22:737 743 Fumonisina B 1 (FB 1 ) McKeague M, Bradley CR, De Girolamo A, Visconti A, Miller DJ, DeRosa MC, 2010. Int. J. Mol. Sci. 11:4864 Aflatossina B 1 (AFB 1 ) e Zearalenone (ZEA) Lee LC, Cruz-Aguado JA, Penner GA (2010) PCT Patent Application, WO 2011/020198.
Aptameri specifici per micotossine Ocratossina A (OTA) 13 cicli SELEX 36 basi Affinità di legame verso OTA (kd): 200 nm Cross-reattività verso OTB: 1% + + Cations + ssdna Buffer di lavoro 10 mm TRIS (ph 8.5) 120 mm NaCl + 5 mm KCl OTA 20 mm CaCl 2
Colonne ad affinità (aptameriche): procedura proposta Incubazione + DADPA Coniugazione Cross-linker (EDC) Aptamero OTA Resina di agarosio (diammino dipropilammina) Fase stazionaria (0,08 nmol DNA/µL resina) 100 µl fase stazionaria (colonne da 1-mL) 200 µl fase stazionaria (colonne da 1-mL) 200 µl fase stazionaria (colonne da 3-mL) Preparazione colonne 300 µl fase stazionaria (colonne da 3-mL) De Girolamo A, McKeague M, Miller DJ, DeRosa MC, and Visconti A, 2011. Food Chem., 127:1378
OTA nel frumento duro: colonne aptameriche/hplc-fld Estrazione (metanolo:acqua) Agitazione, 5 min Filtrazione (Whatman Nº 4) Diluizione (1:5) con buffer a Filtrazione (Whatman GF/A) Campione naturalmente contaminato con 1.5 µg/kg OTA Campione bianco Purificazione su colonne aptameriche Lavaggio Eluizione con metanolo Determinazione HPLC/FLD (λ ec = 333 nm, λ em = 460 nm) a Buffer di lavoro = 10 mm TRIS (ph 8.5), 120 mm NaCl, 5 mm KCl, 20 mm CaCl 2. De Girolamo A, McKeague M, Miller DJ, DeRosa MC, and Visconti A, 2011. Food Chem., 127:1378
Prestazioni analitiche del metodo sviluppato LOQ: 0,08 µg/kg g Accuratezza: 84% Precisione: 8% 4 Applicabilità: 0,08-50 µg/kg Validazione: 33 campioni di frumento ) PTA/HPLC) ean-up (ng/g ptamer [µg/kg], SPE (AP cle OTA OTA by ap [ (IMA/HPLC vs APTA/HPLC) 12 10 8 6 2 y = 0.891 x 0.09 r = 0.990 Limite di legge 0 0 2 4 6 8 10 12 OTA by [µg/kg], IMA clean-up (IMA/HPLC) (ng/g) Riutilizzo: fino a 5 volte (recuperi 92-105%, RSD 2-7%) De Girolamo A, McKeague M, Miller DJ, DeRosa MC, and Visconti A, 2011. Food Chem., 127:1378
OTA nel frumento duro: Sistema innovativo di rivelazione a fluorescenza OTA-Sense system + Colonne aptameriche Soluzione fluorescente di terbio Soluzione di (OTA-Sense Affinity column) (OTA-Sense buffer solution) aptamero per OTA Fluorescenza Risolta nel Tempo/ Trasferimento di Energia per Risonanza De Girolamo A, Lee L, Penner G, Schena R, Visconti A, 2012. Anal Bioanal Chem, in stampa.
Fluorescenza Risolta nel Tempo e Trasferimento di Energia per Risonanza h OTA Fluorescenza Risolta nel Tempo (TRF) Alcuni lantanidi Trasferimento di Energia per Risonanza (FRET) Terbio (Tb) Lantanio (La) Samario (Sm) Europio (Eu).
TRF del complesso di coordinazione Terbio-OTA Selezione della λ em * 800 700 600 λ em = 540 nm Soluzione standard OTA (100 nm) Soluzione Terbio (3 mm) Complesso Terbio-OTA ) cenza (RFU Fluores 500 400 300 200 100 0 450 475 500 525 550 575 600 625 650 Lunghezza d'onda di emissione (nm) *λ ec = 370 nm
TRF del complesso di coordinazione Aptamero-Terbio Terbio-OTA Ottimizzazione concentrazione terbio Fluore escenza re elativa (RFU U) 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 Aptamero-Terbio-OTA (soluzione standard)* Aptamero-Terbio-OTA (in matrice)** 0 5 10 15 20 25 [Terbio] mm Dati normalizzati rispetto al segnale di background del complesso Aptamero-Terbio. * [OTA] = 2,5 ng/ml ** [OTA] = 2,2 µg/kg
TRF del complesso di coordinazione Aptamero-Terbio Terbio-OTA Valutazione effetto matrice* Valutazione stabilità complesso* 80000 70000 (RFU) Fluorescenza 60000 50000 40000 30000 soluzione std OTA 3.5 mg matrice 20000 7 mg matrice 10000 14 mg matrice 0 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 [OTA] ng/ml *Test del parallelismo e della posizione delle rette: t calcolato < t Student
OTA nel frumento duro: OTA-Sense system Estrazione (acetonitrile:acqua) Agitazione, 5 min Filtrazione (Whatman Nº 4) Diluizione (1:20) con buffer a Filtrazione (Whatman GF/A) Purificazione su colonne aptameriche (OTA-Sense ) Lavaggio system (colonne aptameriche/trf) Eluizione con metanolo Diluizione (1:2) con soluzione fluorescente di terbio (OTA-Sense buffer solution) Aggiunta dell aptamero Determinazione TRF/FRET (λ ec = 370 nm, λ em = 540 nm)
OTA-Sense system: prestazioni analitiche del metodo LOQ: 0,5 µg/kg y = 0,918x - 0,100 Accuratezza: 77% Precisione: 6% Linearità: 2,5-100 µg/kg [OTA] µg/k kg (OTA-Se ense /TRF) 16 14 12 10 8 r = 0,985 6 Limite di legge 4 2 Tempo di analisi: <30min 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 [OTA] µg/kg (IAC/HPLC-FLD) Validazione: 29 campioni di frumento naturalmente contaminato (IMA/HPLC vs OTA-Sense System) De Girolamo A, Lee L, Penner G, Schena R, Visconti A, 2012. Anal Bioanal Chem, DOI 10.1007/s00216-012- 6076-6
Conclusioni I Sono note in letteratura le sequenze di aptameri a DNA specifici i per ocratossina A, fumonisina i B 1, aflatossina B 1 e zearalenone. E stata messa a punto una metodica ad hoc per la preparazione di colonnine ad affinità basate sull impiego dell aptamero per ocratossina A. E possibile utilizzare le colonne aptameriche in combinazione con HPLC/FLD per la determinazione di ocratossina A nel frumento. Le prestazioni analitiche delle colonne aptameriche sono comparabili a quelle delle colonne ad immunoaffinità.
Conclusioni II E stato utilizzato un sistema di rivelazione TRF/FRET basato sull interazione ocratossina A terbio - aptamero per aumentare la sensibilità del metodo di rivelazione dell ocratossina A in campioni di frumento. Il metodo ha mostrato buone prestazioni analitiche ed una buona affidabilità. Il metodo è inoltre idoneo all analisi parallela di numerosi campioni di frumento. Gli aptameri rappresentano una valida alternativa all utilizzo l degli anticorpi per l analisi delle micotossine in prodotti alimentari.
Basilica di S. Nicola, Bari Castel del Monte, BAT NeoVentures Biotechnology Inc. Linda Lee Gregory Penner Maria C. DeRosa David J. Miller Maureen McKeague