Mappatura fisica
Tipi di mappe: mappe fisiche e genetiche Mappe fisiche: localizza i geni (o marcatori) lungo i cromosomi usando misurazioni che sono il riflesso di distanza fisica. Si distingue a bassa ed alta risoluzione Mappe genetiche: si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori (analisi di linkage). Possono essere di varia natura: fenotipo dell individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA. Sono la connessione fra una realta biologica e il genoma corrispondente, senza di loro non si puo procedere
Mappatura fisica La mappatura fisica comprende una varieta di modi diversi, ciascuno dei quali usa diverse unita di misura e fornisce diversi livelli di risoluzione, che vanno dall intero cromosoma alla singola coppia di basi. Esistono diversi tipi: - mappatura mediante ibridi cellulari - mappatura mediante ibridazione in situ - sequenziamento Mappatura significa localizzare una sequenza di DNA sui cromosomi
Sistemi di isolamento del DNA cromosomico miscela di cromosomi trattati con fluorocromo Spesso puo essere importante isolare uno o piu cromosomi dal resto e per questo possono essere utilizzati due approcci: - Flow Sorting - Costruzione di ibridi somatici selezioni la lunghezza d onda di interesse (selezionante)
Come usare i cromosomi sortati per fare la mappatura? Avendo i cromosomi tutti isolati in provette e possibile usare tutti gli approcci gia noti per trovare la localizzazione di una regione specifica. - PCR con primer disegnati sulla sequenza da studiare - slot blot o dot blot con probe sul DNA genomico di ogni provetta fissato su filtro di nitrocellulosa 5
Un altro di stema di mappatura usa gli ibridi cellulari: cosa sono? come si fanno? Gli ibridi sono cellule che contengono patrimoni genetici diversi tra loro. Nel caso specifico HSA e topo. Le cellule vengono fuse e il sistema ritiene tutti i cromosomi di topo e qualche o un cromosoma umano. Si distinguono in: Ibridi cromosomici (Usati anche come WCP) se ritengono piu cromosomi umani o parti di essi a causa di fenomeni di rottura che si realizzano casualmente Ibridi monocromosici (Usati anche come WCP) se ritengono un solo cromosoma umano. Si possono ottenere: 1. da ibridi (a seguito di eliminazioni successive del vari cromosomi di uomo) 2. da preparati FACS messi in formazione di ibrido Ibridi cromosomici da radiazione (Usati anche come PCP) - se ritengono frammenti di uno o piu cromosomi. Si ottengono per irradiazione degli ibrdi precedenti e successiva ulteriore fusione 6
Sistema di selezione per ibridi cellulari Hypoxantyne Aminotperin Tymidine TK - HPRT - HPRT + PEG TK + HAT Nel sistema HAT solo le cellule TK+ e HPRT+ sopravvivono In humans: HPRT on chr. Xq26; TK on chr. 17q25 altri sistemi di selezione: - ouabaina; - alanosina-adenina Il terreno HAT (ipoxantina-amminopterina-timidina) è una selezione che si affida alla combinazione di amminopterina (un composto che agisce come potente inibitore del metabolismo del folato inibendo l'attività della diidrofolato reduttasi) con l'ipoxantina (un derivato della purina) e la timidina (un deossinucleoside), i quali sono intermediari nella sintesi del DNA. Il trucco è nel fatto che l'amminopterina blocca la sintesi de novo del DNA, assolutamente necessaria per la divisione cellulare, ma l'ipoxantina e la timidina forniscono alla cellula il materiale necessario per aggirare il blocco (la "via di recupero"), a patto che vi siano i giusti enzimi (TK e HPRT), cioè copie funzionali dei geni che codificano per essi.
Prima di utilizzare gli ibridi per fare la mappatura e NECESSARIO e FONDAMENTALE procedere con la caratterizzazione degli ibridi: Capire cioe quali sono i cromosomi che casualmente sono stati trattenuti dal processo di formazione dell ibrido stesso. Caratterizzazione di ibridi
Caratterizzazione di ibridi: grossolana Il DNA dell ibrido viene estratto e sottoposto ad ALU-PCR. Questo passaggio e fondamentale per aumentare la rappresentativita del DNA umano vs il DNA murino (non ci sono sequenze ALU). La ALU-PCR utilizza primer disegnati sulle sequenze Alu ma con orientamento esterno alle sequenze stesse, per avere una amplificazione di sequenze interalu. Successivamente eseguo una FISH SU METAFASI UMANE dei prodotti di ALU-PCR
IBRIDI DA RADIAZIONE
Painting cromosomica parziale (2p)
Caratterizzazione dell ibrido HY #240 mediante FISH l indicazione e grossolona, motivo per cui si procede con una caratterizzazione fisica mediante STS (importante per la caratterizzazione degli ibridi da radiazione!!!).
Ogni STS e mappato e localizzato precisamente nel genoma umano. Scegliendo opportunamente vari STS (ausilio di programmi bioinformatici e database) e possibile testare per contenuto di STS le varie linee ibride ottenute Caratterizzazione mediante STS di un pannello del cromosoma 5 STS RH
Pannello ibridi da radiazione chr4
Uso degli ibridi in mappatura fisica lane 4:Human control lane 3:CHO control lane 2:Positive hybrid lane 1:Negative hybrid Southern di genomico di ibridi Ovviamente posso usare anche la PCR per avere la stessa risposta!!!
Mappatura del gene AQP8 Human CHO Positive hybrids Negative hybrids IBRIDI
Mappatura del gene AQP8 Il gene e localizzato su quel cromosoma che e sempre presente sugli ibridi risultati positivi e sempre assente sugli ibridi risultati negativi. Nell esempio iol gene e localizzato nel cromosoma 16
cromosoma sul vetrino FISH sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo denaturazione A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T doppia elica di DNA A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T denaturazione A ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T T A G G C A T A G G A T A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T osservazione del vetrino 18
FISH Per la FISH si possono utilizzare: 1. Sonde puntiformi (fosmidi, cosmidi, BAC, PAC o YAC) 2. Sonde ottenute da ibridi (librerie totali e parziali) che colorano interamente o parzialmente i cromosomi 1. 2.
FISH: mappatura fisica ad alta e bassa risoluzione la risoluzione (la distanza minore per cui due sonde ibridate contemporaneamente possono essere visualizzate comeentita separate) di tale tecnica dipende dal materiale target (sempre cromosomi) che si utilizzano: cromosomi metafasici (FISH classica) allungati con citocentrifuga (Stretched FISH) nuclei interfasici (FISH in interfase) fibre di cromatina (Fiber FISH) 800 kb - 1.5 Mb 1.5-2.0 Mb 50-500 kb <5-700 kb 20
Costruzione di Contigui di cloni: strategie per il sequenziamento del genoma umano
Costruzione di contigui: restriction vs STS mapping
Costruzione di contigui
Costruzione di contigui: BAC Ends mapping
Costruzione di un contiguo partendo da un locus genomico 1. Costruzione di un STS per il locus genomico Costruzione di una sonda specifica 2. Utilizzo sonda per screening su libreria di BAC Cloni positivi 3. BAC End sequencing BAC ENds mapping (se esiste un genoma di riferimento) 4. Costruzione STS dalle ends piu lontane dal punto di partenza Costruzione di una sonda specifica
Costruzione di un contiguo partendo da un locus genomico 1. Costruzione di un STS per il locus genomico Costruzione di una sonda specifica 2. Utilizzo sonda per screening su libreria di BAC Cloni positivi clone A clone B clone C 3. BAC End sequencing BAC ENds mapping (se esiste un genoma di riferimento)
Costruzione di un contiguo partendo da un locus genomico 4. Ricerca con BLAST/BLAT delle sequenza delle bacend nel genoma di riferimento: Clone A Clone B Clone C T7 CHRX - 45272558 45273369 SP6 CHRX + 45131843 45132619 SP6 CHRX - 45272700 45273519 T7 CHRX + 45121635 45122453 T7 CHRX - 45313585 45314333 SP6 CHRX + 45124059 45124890 ChrX 1 ChrX 154,913,754 ASP6 BT7 CSp6 AT7 BSp6 CT7 5. Costruzione STS dalle ends piu lontane dal punto di partenza Costruzione di una sonda specifica... e si riprende dal punto 1. In questo caso la DIREZIONE e nota avendo un genoma di riferimento da utilizzare per orientare il contiguo!!!
Costruzione di un contiguo partendo da un locus genomico 1. Costruzione di un STS per il locus genomico Costruzione di una sonda specifica 2. Utilizzo sonda per screening su libreria di BAC Cloni positivi clone A clone B clone C 3. BAC End sequencing BAC ENds mapping (se NON esiste un genoma di riferimento)
Costruzione di un contiguo partendo da un locus genomico 4. Dalle sequenze Sp6 e T7 si costruiscono STS specifici e si procede facendo tante reazioni di PCR per definire quali sequenze sono contenute all interno degli inserti utilizzati... BAC name BES Primer forward Primer reverse PRODUCT SIZE SP6 CCATACTGGGGCATGTGAAT ACGTGCTTGGGAGCAGATAA 250 Clone A T7 AACTTCAGATGACAGCAGTAGCC TGTGGCTTTCAATTCATTTCTG 310 SP6 AGTTGAGTGCTCTGCCAGTTG CATGCAAATCATATTCCAATGC 246 Clone B T7 GGACCACAGCATCCAACATT TTCCACTGGTTTCCTCAAGC 215 SP6 TGCTCTGCAACATGGATGAA TTTGGGTTTGCGTAGATATTTCA 318 Clone C T7 CTCGGTTGCCAGATTCAACT GGTAATCGCATCCCAACTGA 322 ASp6 BSp6 CSp6 AT7 BT7 CT7 SCHEMA CARICAMENTO: CLONE A CLONE B CLONE C CONTROLLO + CONTROLLO - PCR ASP6 ASp6 BSp6 CSp6
ASp6 BSp6 CSp6 Costruzione di un contiguo partendo da un locus genomico PCR AT7 ASp6 BSp6 CSp6 AT7 BT7 CT7 ASp6 BSp6 CSp6 AT7 BT7 CT7 PCR BSp6 ASp6 BT7 CSp6 AT7 BSp6 CT7 SCHEMA CARICAMENTO: CLONE A CLONE B CLONE C CONTROLLO + CONTROLLO -
ASp6 BT7 CSp6 Costruzione di un contiguo partendo da un locus genomico AT7 BSp6 CT7 PCR BT7 ASP6 BT7 CSp6 AT7 BSp6 CT7 ASP6 BT7 CSp6 AT7 BSp6 CT7 PCR CSp6 ASP6 BT7 CT7 AT7 BSp6 CSp6 SCHEMA CARICAMENTO: CLONE A CLONE B CLONE C CONTROLLO + CONTROLLO -
Costruzione di un contiguo partendo da un locus genomico ASp6 BT7 CT7 AT7 BSp6 CSp6 PCR CT7 ASp6 BT7 CT7 AT7 BSp6 CSp6 Questo processo permete di costruire contiguo di cloni senza avere un genoma di riferimento ma da solo NON permette di orientare il contiguo! Per orientarlo e necessario SOLO QUANDO IL CONTIGUO E GRANDE A SUFFICIENZA eseguire una FISH in coibridazione con i cloni estremi e definirne l orientamento rispetto a centromero e telomero... ASp6 BT7 CT7 AT7 BSp6 CSp6
Costruzione di un contiguo partendo da un locus genomico Questo processo permete di costruire contiguo di cloni senza avere un genoma di riferimento ma da solo NON permette di orientare il contiguo! Per orientarlo e necessario SOLO QUANDO IL CONTIGUO E GRANDE A SUFFICIENZA eseguire una FISH in coibridazione con i cloni estremi e definirne l orientamento rispetto a centromero e telomero... ASP6 BT7 CT7 AT7 BSp6 CSp6 Telomero Centromero
BAC Ends mapping per la ricerca dei riarrangiamenti strutturali
Sequenziamento del genoma umano: Analisi della struttura dei genomi e progetti genomici