ZytoDot 2C CISH implementation Kit

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1 ZytoDot 2C CISH implementation Kit C C Per metodiche di ibridazione in situ cromogenica (CISH) utilizzando qualsiasi sonda per CISH Zytodot 2C della ZytoVision.... Dispositivo per uso diagnostico in vitro in base alle direttive EU 98/79/EC

2 Ultima versione: 1 febbraio, 2011 (5.0) Marchi di fabbrica ZytoVision e ZytoLight sono marchi di ZytoVision GmbH.

3 Contenuto 1. Finalità d'uso Principio del metodo Informazioni su sicurezza e smaltimento Il kit ZytoDot 2C CISH Implementation Kit Componenti Conservazione e validità Campioni Materiale supplementare necessario Informazioni importanti Protocollo ZytoDot 2C implementation Kit Preparazione Pretrattamento (sparaffinatura/proteolisi) (1 giorno) Denaturazione e ibridazione (1 giorno) Post-ibridazione e rilevazione (2 giorno) Interpretazione dei risultati Bibliografia Problemi e possibili cause... 11

4 1. Finalità d'uso Il kit ZytoDot 2C CISH Implementation Kit è stato studiato per rilevare sequenze di DNA umano di tessuti inclusi in paraffina o cellule, fissati in formalina attraverso ibridazione in situ cromogenica (CISH) utilizzando una sonda per CISH ZytoVision. L'interpretazione dei risultati deve essere effettuata da un patologo qualificato tenendo conto degli altri dati clinici e patologici del paziente nel contesto dell'anamnesi clinica. 2. Principio del metodo La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel campione in analisi e la sonda. Il kit ZytoDot 2C CISH Implementation Kit può essere usato con una qualsiasi sonda ZytoDot 2C CISH venduta separatamente. La formazione del duplex con la sonda marcata può essere visualizzata attraverso anticorpi primari (non marcati) che sono rivelati da anticorpi secondari marcati con enzimi polimerizzati. La reazione enzimatica del substrato porta alla formazione di un forte segnale permanente,rosso e verde, che può essere visualizzato con un microscopio a luce trasmessa dotato di obiettivi 40x. 3. Informazioni su sicurezza e smaltimento Leggere attentamente le istruzioni prima dell'uso! Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza! Evitare contaminazioni incrociate e microbatteriche dei reagenti! Alcuni componenti del sistema contengono (a basse concentrazioni e volumi ridotti) sostanze nocive per la salute. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Adottare adeguate misure di sicurezza (utilizzo di guanti monouso, occhiali protettivi e indumenti da laboratorio)! In caso di contatto con i reagenti, risciacquare immediatamente la pelle con acqua corrente! Non mettere in bocca le pipette per le soluzioni! Smaltire i reagenti in base alle disposizioni locali! 1

5 La scheda di sicurezza è disponibile su richiesta per l'utilizzatore professionale! 4. Il ZytoDot 2C CISH Implementation Kit 4.1 Componenti Il kit comprende i seguenti componenti: Codice Componenti PT2 Tampone citrato per pretrattamento termico Quantità ml 150 ml ES1 Pepsina 4 ml 1 ml WB1 Tampone di lavaggio SSC 500 ml 150 ml Contenitore Flacone con tappo a vite (grande) Flacone contagocce, tappo bianco Flacone con tappo a vite (grande) WB5 Tampone di lavaggio TBS 20X 2x 50 ml 50 ml Flacone con tappo a vite AB14 Anti-DIG/DNP-Mix 4 ml 1 ml Bottiglietta con gocciolatore, tappo giallo AB13 HRP/AP-Polymer-Mix 4 ml 1 ml Bottiglietta con gocciolatore, tappo blu SB6a AP-Red Solution A 0,4 ml 0,1 ml Bottiglietta con gocciolatore, tappo rosso (piccola) SB6b AP-Red Solution B 15 ml 4 ml Bottiglietta con gocciolatore, tappo rosso SB7a HRP-Green Solution A 0,8 ml 0,2 ml Bottiglietta con gocciolatore, tappo verde (piccola) SB7b HRP-Green Solution B 15 ml 4 ml Bottiglietta con gocciolatore, tappo verde CS2 Nuclear Blue Solution 20 ml 4 ml Bottiglietta con gocciolatore, tappo nero MT4 Mezzo di montaggio 4 ml 1 ml Bottiglietta in vetro Provetta per AP red 2 1 Provetta graduata, tappo rosso Provetta per HRP-Green 2 1 Provetta graduata, tappo verde Manuale d istruzioni 1 C (40 tests): I componenti (ES1), (AB14), (AB13), (SB6a-b), (SB7a-b)e (MT4) sono sufficienti per 40 reazioni. I componenti (PT2) e (WB1)sono sufficienti per allestire 7 vaschette di capacità di 70 ml. Il componente (WB5) è sufficiente per allestire 27 vaschette da 70 ml. 2

6 C (10 tests): I componenti (ES1), (AB14), (AB13), (SB6a-b), (SB7a-b)e (MT4) sono sufficienti per 10 reazioni. I componenti (PT2) e (WB1)sono sufficienti per allestire 2 vaschette di capacità di 70 ml. Il componente (WB5) è sufficiente per allestire 14 vaschette da 70 ml. 4.2 Conservazione e validità I componenti del kit devono essere conservati ad una temperatura compresa tra 2-8 C. Osservando tali condizioni di conservazione, è possibile utilizzare il kit almeno fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. 4.3 Campioni Il kit ZytoDot 2C CISH Implementation Kit è stato ottimizzato per l'utilizzo su cellule e tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina. L'impiego di materiale fissato o incluso diversamente (es. strisci di sangue o cellule fissate con metanolo-acido acetico glaciale) può richiedere modifiche del protocollo da parte dell'utilizzatore. I nostri esperti sono a disposizione per eventuali suggerimenti. Si consiglia di preparare il tessuto nel modo seguente: Fissazione in formalina neutra tamponata al 10% per 24 h a temperatura ambiente. Per ottenere una fissazione ed un'inclusione in paraffina ottimali ed uniformi, la grandezza del campione non deve essere superiore a 0,5 cm 3. Procedimento standard e inclusione in paraffina Utilizzare paraffina di alta qualità. L'infiltrazione e l'inclusione devono avvenire ad una temperatura inferiore a 65 C. Preparare sezioni con spessore di 2-5 µm Utilizzare vetrini rivestiti di silano oppure altre sostanze, fissare per 2-16 h a C. 4.4 Materiale supplementare necessario I seguenti reagenti, materiali e strumenti non sono contenuti nel kit: Reagenti e materiali Sonda ZytoDot 2C CISH 3

7 Pistola per incollaggio con adesivo a caldo o mastice(fixogum) Etanolo 100% denaturato Acqua distillata o deionizzata Xilene Acqua Ossigenata (H2O2) 30% Strumentazione Bagno termostatato (80 C) Piastra calda Stufa per ibridazione Vaschette di colorazione, ml Camera umida Micropipetta (10 µl, 30 µl) Microscopio 4.5 Informazioni importanti Occorre tenere presente che: Le sezioni non devono disidratarsi durante l'ibridazione ed i lavaggi! Le temperature di denaturazione e lavaggio descritte nel protocollo devono essere utilizzate come guida. In base alla fissazione dei campioni, una variazione di tali temperature potrebbe produrre risultati migliori! Questo protocollo è stato sviluppato per la denaturazione simultanea di campione e sonda. Protocolli per denaturazioni separate sono disponibile all homepage 4

8 5. Protocollo ZytoDot 2C CISH Implementation Kit 5.1 Preparazione 1 giorno: Preparazione della scala di etanolo (70%, 90% e 100% etanolo): diluire 7, 9 e 10 parti di 100% etanolo con 3, 1 e 0 parti di acqua deionizzata o distillata. Le soluzioni possono essere conservate in appositi contenitori e riutilizzate. Tampone citrato per pretrattamento termico (PT2) Riscaldare il tampone in una vaschetta di colorazione coperta in acqua bollente ad almeno 95 C. Tampone di lavaggio SSC (WB1): Portare a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. Preparazione di 3% H2O2: Diluire 1 parte di 30% H2O2 con 9 parti di metanolo 100%. 2 giorno: Wash Buffer SSC (WB1): preparare due vaschette di colorazione con Wash Buffer SSC, una a temperatura ambiente, l'altra riscaldata a 75 C (in base al numero di campioni la temperatura può essere innalzata di un grado per vetrino, ma senza superare gli 80 C). Preparazione di 1x Wash Buffer TBS: diluire 1 parte di 20x Wash Buffer TBS (WB5) con 19 parti di acqua distillata o deionizzata. Il tampone 1x Wash Buffer TBS può essere conservato per una settimana, se staccato a 2-8 C. Blocking Solution (BS1), Anti-DIG/Anti-DNP-Mix (AB3), Nuclear Blue Solution (CS2), mezzo di montaggio (MT4): portare a temperatura ambiente. Preparazione della AP-Red Solution: immediatamente prima dell uso, aggiungere una goccia (30 μl) di AP-Red Solution A (SB6a) in una provetta graduata (ad esempio la provetta in dotazione con il tappo rosso), portare a 1 ml con AP-Red Solution B (SB6b) e agitare bene. Non esporre la soluzione ottenuta a forte luce diretta. Preparazione della HRP-Green Solution: immediatamente prima dell uso, aggiungere due goccie (2x 20 μl) di HRP-Green Solution A (SB7a) in una provetta graduata (ad esempio la provetta in dotazione 5

9 con tappo verde), e portare a 1 ml con HRP-Green Solution B (SB7b) e agitare bene. 5.2 Pretrattamento (sparaffinatura/proteolisi) (1 giorno) 1. Incubare i vetrini per 10 min a 70 C (es. su una piastra riscaldante.) 2. Incubare 2x 5 min in xilene 3. Incubare 3x 3 min in alcool 100% 4. Incubare le sezioni in H2O2 3% per 5 minuti. 5. Lavare 2x 1 min in acqua deionizzata o distillata. 6. Incubare i vetrini per 15 min in Heat Pretreatment Solution EDTA (PT2) precedemente riscaldato. Si raccomanda di non utilizzare più di sei vetrini per vaschetta. 7 Trasferire direttamente i vetrini in acqua distillata e deionizzata, lavare 2x 2min e asciugare il vetrino. 8. Applicare tramite gocciolamento la Pepsina (ES1)sul preparato e incubare per 5 min a temperatura ambiente in camera umida. Il tempo di incubazione dipende dal tipo di campione, dallo spessore della sezione e dal relativo tempo di fissazione. Come valore indicativo, si può considerare un'incubazione di 3-10 min per campioni di tessuto e cellule. In generale, si consiglia di determinare il tempo di proteolisi ottimale eseguendo un test preventivo. 9. Lavare in acqua distillata e asciugare il vetrino. 10. Disidratare in etanolo 70%, 90% e 100%, ciascuno per 1 min. Asciugare all'aria. 5.3 Denaturazione e ibridazione (1 giorno) 1. Vortexare la sonda ZytoDot 2C CISH e pipettare 10 µl per ogni campione. Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare in un unico punto. Alternativamente, aggiungere la sonda al centro di un coprioggetto e applicare il coprioggetto sull'area in esame. Un leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. 2. Evitare la formazione di bolle, coprire con un coprioggetto (22 mm x 22 mm; 24 mm x 32 mm). Sigillare il coprioggetto con adesivo o mastice. 3. Denaturare i campioni a C per 5 min, es. su una piastra riscaldante. 6

10 4. Trasferire i vetrini in una cameretta umida e ibridare overnight a 37 C (es. in un fornetto.) E' indispensabile mantenere umido il campione durante l'ibridazione. 5.4 Post-ibridazione e rilevazione (2 giorno) 1. Rimuovere con cura il mastice o la colla 2. Rimuovere il coprioggetto immergendo il vetrino in Tampone di lavaggio SSC (WT1) a temperatura ambiente per 5 min. 3. Lavare per 5 min in tampone di lavaggio SSC (WT1) a C. 7 Il Tampone di lavaggio A deve essere pre-riscaldato, incrementare la temperatura di una grado se si trattano più di due vetrini ma non superare gli 80 C. Verificare con un termometro se necessario. 4. Lavare 3x 2 min in acqua deionizzata o distillata. 5. Immergere i vetrini nel tampone di lavaggio TBS 1x (preparato usando WB5) e sgocciolare. 6. Applicare 3-4 goccie di Anti-DIG/DNP-Mix (AB14) per vetrino e incubare per 15 min at 37 C in camera umida. 7. Lavare i vetrini 3 x 1min nel tampone di lavaggio TBS 1x (preparato usando WB5) e sgocciolare. 8. Applicare 3-4 goccie di HRP/AP-Polymer-Mix (AB13) per vetrino e incubare per 15 min at 37 C in camera umida. 9. Durante l incubazione preparare AP-Red Solution aggiungendo in una provetta graduata una goccia (30 μl) di AP-Red Solution A (SB6a) e portare a 1 ml con AP-Red Solution B (SB6b) e agitare bene. Non esporre la soluzione a forte luce diretta 10. Lavare i vetrini 3 x 1min nel tampone di lavaggio TBS 1x (preparato usando WB5). 11. Applicare la AP-Red Solution gocciolando 3-4 goccie di soluzione per vetrino e incubare per 10 min at temperatura ambiente (non esporre i vetrini a forte luce diretta). Se necessario, il tempo di incubazione può essere allungato o accorciato (7-15 min). 12. Durante l incubazione preparare la HRP-Green Solution aggiungendo in una provetta graduata due gocce (2 x 20 μl) di HRP-Green Solution A (SB7a) e portare a 1 ml con HRP- Green Solution B (SB7b) e agitare bene. 13. Applicare la HRP-Green Solution gocciolando 3-4 goccie di soluzione per vetrino e incubare per 10 min at temperatura

11 ambiente (non esporre i vetrini a forte luce diretta). Se necessario, il tempo di incubazione può essere allungato o accorciato (5-15 min). 14. Lavare i vetrini in acqua distillata o deionizzata per 2 min. 15. Contrastare il tessuto con la Nuclear Blue Solution (CS2)per 2 min a temperatura ambiente (non esporre i vetrini a forte luce diretta). Il tempo di controcolorazione dipende dalla natura del tessuto o delle cellule e deve essere ottimizzata dall operatore. Evitare colorazioni intense che potrebbero oscurare i segnali positivi. 16. Trasferire i vetrini in una vaschetta di colorazione e lavarli in acqua corrente per 2 minuti. 17. Disidratare in etanolo 100%, 3x 30 sec (utilizzare etanolo puro). 18. Incubare 2x 30 sec in xilene (utilizzare xilene puro). Evitare di superare il tempo di immersione perché potrebbe indebolire i segnali. 19. Evitando la formazione di bolle, applicare qualche goccia di mezzo di montaggio (MT4), coprire il campione con un coprioggetto e asciugare all aria per 30 min. 20. Osservare i campioni al microscopio ottico. 8

12 6. Interpretazione dei risultati Le sonde marcate con digossigenina (DIG) sono colorate con un segnale permanente verde utilizzando la HRP-Green solution. Le sonde marcate con dinitrofenile (DNP) sono colorate un segnale permanente rosso utilizzando la AP-Red solution. Utilizzando le sonde appropriate, due distinti segnali verdi e rossi saranno visibili nel nucleo di normali cellule diploidi. A causa di processi di mitosi, occasionali segnali addizionali potrebbero essere visualizzati in una piccola percentuale di cellule non neoplastiche. L osservazione del campione deve essere effettuata con obiettivi 40x. Per una corretta osservazione del preparato non utilizzare filtri di correzione cromatica, aprire completamente il diaframma e fuochettare avanti e indietro per visualizzare eventuali segnali rossi e verdi sovrapposti. Il tempo di controcolorazione dipende dalla natura del tessuto o delle cellule e deve essere ottimizzata dall operatore. Evitare colorazioniintense che potrebbero oscurare i segnali positivi. Un risultato negativo aspecifico può essere causato da diversi fattori, fare riferimento al capitolo 8. 9

13 7. Bibliografia Isola J, Tanner M (2004) Methods Mol Med 97: Kounelis S, et al. (2005) Anticancer Res 25: Speel EJ, et al. (1994) J Histochem Cytochem 42: Tsukamoto T, et al. (1991) Int J Dev Biol 35: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN

14 8. Problemi e possibili cause La mancata osservanza delle indicazioni contenute nelle istruzioni per l'uso può produrre risultati deboli o mancanza di segnale. Problema Possibile causa Azione Crepe nel tessuto in seguito al trattamento con pepsina Segnale scarso o nullo Colorazione irregolare e molto debole in alcune zone Segnali di crossibridazione, intensa colorazione di fondo Distacco delle sezioni dal vetrino Formazione di precipitato Nessuna sequenza target nel materiale analizzato Fissazione non ottimale delle cellule o dei tessuti Tessuto iper- o ipo- digerito Temperatura di denaturazione non appropriata Temperatura di ibridazione non corretta Microscopio a fluorescenza non correttamente configurato Sonda e vetrini esposti a luce intensa Le sezioni non sono correttamente sparaffinate Eccessivo volume di sonda per area Eccessivo trattamento proteolitico Disidratazione delle sezioni durante i passaggi di incubazione Temperatura dei lavaggi postibridazione troppo bassa Eccessivo pre-trattamento proteolitico Rivestimento dei vetrini inappropriato Lavare immediatamente i vetrini in acqua deionizzata o distillata Utilizzare controlli Ottimizzare i tempi di fissazione Ottimizzare I tempi di trattamento proteolitico Verificare la temperatura; aggiustare la temperatura, se necessario. Verificare la temperatura; aggiustare la temperatura, se necessario. Regolare lo strumento Evitare l esposizione alla luce ove possibile Utilizzare etanolo e xylene freschi; utilizzare solo xylene puro. Verificare i tempi di sparaffinatura. Ridurre il volume della sonda per area, distribuire in modo uniforme la sonda per evitare che si concentri localmente Ottimizzare i tempi di incubazione Impedire disidratazione Verificare la temperatura Diminuire i tempi di incubazione Utilizzare vetrini appropriati 11

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