Metabolismo del DNA. Replicazione del DNA

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1 Metabolismo del DNA Replicazione del DNA

2 Replicazione del DNA Le polimerasi non sono capaci di svolgere il duplex di DNA per separare i due filamenti, ognuno dei quali deve servire da stampo Il DNA e un elica con filamenti antiparalleli, i filamenti hanno polarita opposta Tutte le polimerasi polimerizzano in direzione 5 -> 3 Tutte le polimerasi non possono iniziare le catene, ma allungare degli inneschi di RNA o DNA

3 La sintesi di DNA e preceduta dalla sintesi di un piccolo RNA innesco

4 REQUISITI PER LA REPLICAZIONE DEL DNA Stampo fornisce le informazioni sulla sequenza Iniziatore fornisce un estremità 3 -OH a cui aggiungere il nuovo nucleotide Precursori 5 -dntp Mg++ Enzimi ATP DNA polimerasi, elicasi, nucleasi, ligasi, topoisomerasi Proteine non enzimatiche es. pinze scorrevoli, proteine leganti il filamento singolo

5 MECCANISMO D AZIONE DELLA DNA POLIMERASI Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

6 MECCANISMO D AZIONE DELLA DNA POLIMERASI Allungamento della catena di DNA Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

7 Processivita della DNA Polimerasi N. di nucleotidi polimerizzati sequenzialmente (fino a , PolIII). La prima fase di legame al DNA è lenta (1 sec), quelle successiva molto veloci. La processività è dovuta alla capacità di rimanere legata al templato. È aumentata dalla interazione con la sliding clamp. Controlla frameshifts e replication slippage

8 FEDELTÀ DI REPLICAZIONE: -legami idrogeno che determinano un corretto appaiamento -geometria delle coppie di basi Le coppie standard hanno una geometria simile che si adatta al sito catalitico della polimerasi Le coppie sbagliate hanno una geometria che le esclude dal sito attivo Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

9 ATTIVITÀ 3 5 ESONUCLEASICA CORREZIONE DEGLI ERRORI IN FASE DI REPLICAZIONE Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 5 ed.

10 IL processo di replicazione e molto accurato Fedeltà: 1 errore ogni nucleotidi durante la replicazione Correzione delle bozze: 1 errore ogni nucleotidi. Riparazione post-replicativa: 1 errore ogni nucleotidi.

11 LE ATTIVITA DELLE DNA POLIMERASI Attivita di polimerasi, che catalizza l allungamento della catena nucleotidica in direzione 5 3 Attivita di esonucleasi 3 5, che rimuove le basi non appaiate correttamente (correzione di bozze) Attivita di esonucleasi 5 3, che rimuove gli inneschi di RNA durante la sintesi del filamento ritardato, oppure un segmento di DNA durante i processi di riparazione.

12 LE ATTIVITA DELLE DNA POLIMERASI Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

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14 DNA POLIMERASI III SUBUNITA β PINZA Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed. STRUTTURA - 2 nuclei : attività polimerasica,attività 3 5 esonucleasica - : (dimero) pinza si lega al primer e al DNA stampo, fa da morsa legandosi al nucleo scorrendo lungo il filamento incrementando la processività della polimerasi -caricatore della pinza utilizza ATP

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16 FASI DELLA REPLICAZIONE DEL DNA inizio allungamento termine

17 LA REPLICAZIONE E BIDIREZIONALE Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

18 ORIGINE DI REPLICAZIONE IN E.COLI: oric sito unico di inizio 13bp = sequenze per il disavvolgimento del DNA DUE 9 pb Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed

19 INIZIO DELLA REPLICAZIONE A LIVELLO DELLA oric DnaA DnaB elicasi DnaC Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 5ed.

20 COMPLESSO DI PREINIZIO Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed

21 Fase di inizio L inizio e l unica fase della replicazione ad essere regolata. La regolazione avviene una sola volta per ciclo cellulare. L idrolisi dell ATP da parte della proteina DnaA conduce al dissolvimento del complesso di inizio: DnaA-ATP (attiva),dna-adp (inattiva) Metilazione del DNA (GATC) e nuovo ciclo di replicazione.

22 LE CATENE DI DNA A LIVELLO DELLA FORCELLA DI REPLICAZIONE

23 Each replication fork has a leading and a lagging strand leading strand (synthesized continuously) replication fork replication fork lagging strand (synthesized discontinuously) The leading and lagging strand arrows show the direction of DNA chain elongation in a 5 to 3 direction The small DNA pieces on the lagging strand are called Okazaki fragments ( bases in length)

25 SINTESI DEI FRAMMENTI DI OKAZAKI DnaB elicasi+primasi=primosoma Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

26 COORDINAMENTO DELLA SINTESI DELLA CATENA VELOCE E DELLA CATENA LENTA Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed

27 Sintesi del DNA sulla catena veloce e su quella lenta Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

28 IL CARICATORE DELLA PINZA DELLA DNA POLIMERASI Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger. 6 ed. Zanichelli

29 La DNA topoisomerasi impedisce l aggrovigliamento durante la replicazione Elicasi e topoisomerasi cambiano la conformazione del DNA per facilitare l attività della DNA polimerasi

30 GLI INNESCHI DI RNA SONO RIMOSSI DALL ATTIVITA 5 -> 3 NUCLEASICA DELLA DNA POLIMERASI I Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

31 Nucleases hydrolyze phosphodiester bonds Exonucleases cleave at terminal nucleotides. e.g., proofreading exonucleases 5 3 Endonucleases cleave internally and can cut on either side of a phosphate leaving 5 phosphate or 3 phosphate ends depending on the particular endonuclease. e.g., restriction endonucleases 3 5

32 Tappe finale nella sintesi della catena lenta DNA Ligasi

33 DNA LIGASI (1) Enzima + ATP Enzima-AMP + PPi Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

34 DNA LIGASI (2) Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed. 2) Enzima-AMP + 5 P-DNA Enzima + 5 ADP-DNA 3) 5 ADP-DNA + 3 OH-DNA DNA-P-DNA +AMP

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36 TERMINAZIONE DELLA REPLICAZIONE IN E.COLI Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

37 REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI Nell uomo la velocità di polimerizzazione è circa 50 nt/sec Le origini di replicazione sono attivata a gruppi di 20-80, unità di replicazione Le unità sono attivate a tempi diversi Le origini sono a distanza di 30, ,000 nt Si formano bolle di replicazione Meccanismi capaci di assicurare che ciascuna sequenza venga replicata una sola volta

38 Replicazione del DNA : PROCARIOTI- EUCARIOTI DIMENSIONI DEL GENOMA

39 IL Replicatore Il replicatore ha due siti: - legame alla proteina/e iniziatrice - Zona ricca di AT che si apre facilmente

40 REPLICAZIONE DNA EUCARIOTI FORMAZIONE DEL COMPLESSO PRE- REPLICATIVO (PRE-RC) Associazione del complesso di riconoscimento del replicatore/origine (ORC, analogo alla DnA) Reclutamento di altre proteine Reclutamento dell elicasi (complesso Mcm2-7).

41 PROPERTIES OF DNA POLYMERASES DNA polymerases of humans a g d e Location nucl nucl mit nucl nucl Replication yes no yes yes yes Repair no yes no yes yes 3 Functions 5 to 3 polymerase yes yes yes yes yes 3 to 5 exonuclease no no yes yes yes 5 to 3 exonuclease 1 no no no no no Primase yes no no no no Associates with PCNA 2 no no no yes yes Processivity low high Strand synthesis lagging both both both 1 activity present in associated proteins 2 Proliferating Cell Nuclear Antigen sliding clamp 3 involved in transcription-linked DNA repair

42 SOSTITUZIONE DELLA DNA POLIMERASI DURANTE LA REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI La Pol α inizia la replicazione, dopo aver sintetizzato bp viene sostituita dalla Pol δ o ε, che hanno maggiore processività. Queste sono specializzate per il filamento leading e lagging

43 REPLICAZIONE DEL DNA NEGLI EUCARIOTI

44 INIBIZIONE DELLA DNA POLIMERASI DNA POLIMERASI DI VIRUS BERSAGLI DI FARMACI ANTIVIRALI Esempio: Aciclovir inibitore dell Herpes simplex

45 Aciclovir Meccanismo d azione ATTIVAZIONE DEI NUCLEOSIDI ACICLICI TIMIDINA CHINASI VIRALE CHINASI CELLULARE CHINASI CELLULARE

46 MECCANISMO D AZIONE DELL ACICLOVIR MECCANISMO D AZIONE DEI NUCLEOSIDI ACICLICI Esempio ACICLOVIR

47 TELOMERI I telomeri sono delle strutture formate da DNA e proteine presenti alle estremità dei cromosomi lineari costituiti da ripetizioni in tandem della sequenza TTAGGG

48 CROMOSOMI UMANI LINEARI Sono caratterizzati da un filamento 3 protrudente che si ripiega all indietro ed invade la regione a doppia elica dei telomeri formando quello che viene chiamato T-loop.

49 La stabilità del T-LOOP è determinata Dalla LUNGHEZZA DELLE SEQUENZE TELOMERICHE Dalle PROTEINE TELOMERICHE (T-loop) protegge le estremita cromosomiche da nucleasi.

50 CROMOSOMI UMANI LINEARI: ad ogni replicazione sequenze all estremita vengono perdute

51 Telomerasi

52 TELOMERASI

53 CROMOSOMI UMANI LINEARI Sono caratterizzati da un filamento 3 protrudente che si ripiega all indietro ed invade la regione a doppia elica dei telomeri formando quello che viene chiamato T-loop.

54 Cellule germinali Cellule embrionali Linfociti Cellule staminali NELL UOMO LA TELOMERASI E ATTIVA La maggior parte delle cellule somatiche differenziate non esprime attività telomersica e vanno incontro a senescenza duplicativa che è associata con una diminuzione della lunghezza dei telomeri.

55 Telomeri ed invecchiamento Esistono diversi tessuti in cui la senescenza delle cellule che si replicano ha un ruolo chiave nella patologia di malattie correlate all'età, tra cui: -i fibroblasti del derma nell'invecchiamento della pelle (diminuzione della capacità di cicatrizzazione e predisposizione a ulcere); -le cellule endoteliali nell'invecchiamento vascolare (malattie cardiovascolari); -le cellule epiteliali pigmentate della retina (degenerazione maculare correlata all'età); -gli osteoblasti nell'osso (osteoporosi); -i linfociti nel sangue periferico (predisposizione alle infezioni). Individui affetti da invecchiamento precoce (progeria) presentano telomeri corti

56 Telomerasi e cancro Le cellule tumorali presentano livelli elevati di attività telomerasica, crescono in modo incontrollato e diventano immortali.