Replicazione e ricombinazione del DNA

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Gennara Innocenti
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1 DNA Replication

2 DNA Replication II

3 Replicazione e ricombinazione del DNA La replicazione semiconservativa Tre modelli proposti per la replicazione del DNA La replicazione è semiconservativa: ogni frammento di DNA serve da stampo per la sintesi di una nuova molecola di DNA

4 Esperimento di Meselson e Stahl - centrifugazione in gradiente di densità all equilibrio per distinguere DNA contenente 14N pesante e DNA 15N più leggero

8 DEFINIZIONI e TERMINOLOGIA: Replicone= unità di replicazione con propria origine di replicazione. Origine di replicazione=zona specifica del cromosoma dove le doppia elica si denatura in singoli filamenti, esponendo le basi per la sintesi di nuove eliche. Bolla di replicazione:regione del cromosoma dove il DNA è a singole elica e dal quale la replicazione procede in modo bidirezionale.

9 Le modalità di replicazione 1. La replicazione teta Comune in E.Coli e in altri organismi con DNA circolare

10 2. La replicazione a circolo rotante Comune in alcuni virus e nel fattore F di E.coli

11 3. La replicazione lineare negli eucarioti Requisiti per la replicazione: -stampo di DNA a singolo filamento -substrati da assemblare nel filamento di neoformazione -enzimi e altre proteine che leggono lo stampo e assemblano i substrati

14 La direzione della replicazione

15 La sintesi del DNA è continua su un filamento di DNA stampo e discontinua sull altro

17 Modello teta Modello circolo rotante Replicazione lineare

18 La replicazione del DNA batterico - L INIZIO In E.coli la replicazione ha inizio quando le proteine iniziatrici si legano a oric, l origine di replicazione, provocando lo svolgimento di un breve tratto di DNA.

19 - LO SVOLGIMENTO La DNA elicasi svolge il DNA legandosi al filamento ritardato che funge da stampo a livello di ogni forcella di replicazione e muovendosi in direzione 5 3 lungo il filamento.

20 - GLI INNESCHI e L ALLUNGAMENTO La primasi sintetizza brevi tratti nucleotidici di RNA, fornendo un gruppo 3 -OH a cui la DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi di DNA.

23 DNA Polymerase III The "real" polymerase in E. coli At least 10 different subunits "Core" enzyme has three subunits - α, ε, and θ Alpha subunit is polymerase Epsilon subunit is 3'-exonuclease Theta function is unknown The beta subunit dimer forms a ring around DNA Enormous processivity - 5 million bases!

24 DNA Polymerase I Replication occurs 5' to 3' Nucleotides are added at the 3'-end of the strand Pol I catalyzes about 20 cycles of polymerization before the new strand dissociates from template 20 cycles constitutes moderate "processivity" Pol I from E. coli is 928 aa (109 kd) monomer In addition to 5'-3' polymerase, it also has 3'-5' exonuclease and 5'-3' exonuclease activities

25 - La DNA LIGASI La DNA ligasi chiude l interruzione lasciata dalla DNA polimerasi I nello scheletro di zucchero-fosfato dopo che quest ultima ha aggiunto il nucleotide finale.

26 - LA FORCELLA DI REPLICAZIONE Modello di replicazione del DNA in E.coli: le due unità della DNA pol III sono connesse e il filamento ritardato che funge da stampo forma un anello tale che la replicazione possa avere luogo sui due filamenti di DNA antiparalleli.

27 - LA FEDELTA DELLA REPLICAZIONE DEL DNA -selezione dei nucleotidi -correzione di bozze -riparazione dei malappaiamenti

28 Other Proteins That Assist DNA Replication Helicase, topoisomerase, single-strand binding protein Table 16.1

30 La replicazione del DNA negli eucarioti Microfotografia elettronica di DNA eucariotico durante il processo della replicazione: il DNA neosintetizzato è già coperto da nucleosomi

31 Polimerasi nei Procarioti I Procarioti possiedono cinque tipi di DNA Polimerasi: DNA Polimerasi I: implicata nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammenti di Okazaki. Possiede attività esonucleasica sia in direzione 5'->3', sia in direzione 3'->5' DNA Polimerasi II: indotta da danni al DNA per riparazione incline all'errore (error-prone). Ha attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5' DNA Polimerasi III: l'enzima principale per la replicazione, con attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica (nella correzione di bozze, o proofreading) 3'->5'. Attiva sia nella sintesi del filamento leading, sia in quella dei frammenti di Okazaki. DNA Polimerasi IV-V: anch'esse coinvolte nella riparazione incline all'errore

32 Polimerasi negli Eucarioti Le Polimerasi degli Eucarioti sono costituite invece da: DNA Polimerasi α: è una primasi (enzima che sintetizza i primer di RNA) e procede inoltre all'allungamento dei primer con alcune centinaia di deossiribonucleotidi. DNA Polimerasi δ: l'enzima principale della replicazione eucariotica. Sintetizza sia il filamento leading, sia il filamento lagging. Riempie inoltre le interruzioni tra i frammenti di Okazaki. DNA Polimerasi β: coinvolta nella riparazione del DNA DNA Polimerasi γ: replica il DNA mitocondriale DNA Polimerasi ε: stessa funzione della Polimerasi δ.

35 Prokaryotes Eukaryotes 5 polymerases (I, II, III, IV,V) 5 polymerases--α,β,γ,δ,ε I--excision repair, removal of RNA primers II-repair III-main enzyme IV,V-repair, special conditions polymerases also exonucleases α--polymerization β--repair γ--mitochondrial δ-main enzyme ε--unknown not all exonucleases 1 Origin of replication many origins Okazaki fragments nuc. no proteins on DNA Okazaki fragments nuc. histones

38 Tipo di organismo Nome scientifico Ripetizione telomerica (direzione 5' -> 3') Vertebrati Homo sapiens, Mus musculus, Xenopus laevis TTAGGG Funghi Neurospora crassa, Physarum, Didymium TTAGGG Protisti Dictyostelium discoideum AG(1-8) Kinetoplastea (protozoi) Trypanosoma, Crithidia TTAGGG protozoi ciliati Tetrahymena, Glaucoma Paramecium Oxytricha, Stylonychia, Euplotes TTGGGG TTGGG(T/G) TTTTGGGG Apicomplexa Plasmodium TTAGGG(T/C) Piante superiori Arabidopsis thaliana TTTAGGG Alghe verdi Chlamydomonas TTTTAGGG Insetti Bombyx mori TTAGG Anellidi Ascaris lumbricoides TTAGGC Lieviti a scissione binaria Schizosaccharomyces pombe TTAC(A)(C)G(1-8) Lieviti gemmanti Saccharomyces cerevisiae Candida glabrata Candida albicans Candida tropicalis Candida maltosa Candida guillermondii Candida pseudotropicalis Kluyveromyces lactis TGTGGGTGTGGTG (da stampo RNA) o G(2-3)(TG)(1-6)T (sequenza consenso) GGGGTCTGGGTGCTG GGTGTACGGATGTCTAACTTCTT GGTGTA[C/ A]GGATGTCACGATCATT GGTGTACGGATGCAGACTCGCTT GGTGTAC GGTGTACGGATTTGATTAGTTATG T GGTGTACGGATTTGATTAGGTATG T

42 Modello di Holliday:rottura singolo filamento

43 Rottura doppio filamento

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