Studio della composizione e biodiversità delle comunità microbiche che contribuiscono al mantenimento della fertilità del suolo

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1 Cambiamenti Climatici e Sistemi Produttivi Agricoli e Forestali: Impatto sulle Riserve di Carbonio e sulla Diversità Microbica del Suolo Unità Operativa 04: Batteri coltivabili (Annamaria Bevivino) Studio della composizione e biodiversità delle comunità microbiche che contribuiscono al mantenimento della fertilità del suolo Silvia Cesarini Roma 5 Maggio 2008

2 Fotografia aerea del sito di campionamento a Berchidda (SS) VL VI SU ER PA Nella foto sono indicati i punti di campionamento e la posizione dei profili nei vari siti di campionamento.

3 Campionamento suolo Berchidda (SS) CAMPIONI SUGHERETA (SU) ERBAIO AUTUNNO VERNINO (ER) PASCOLO (PA) VIGNETO INERBITO (Vi) VIGNETO LAVORATO (VL) 5 repliche per ogni campione SU 1, 2, 3, 4, 5 ER 1, 2, 3, 4, 5 PA 1, 2, 3, 4, 5 Vi 1, 2, 3, 4, 5 VL 1, 2, 3, 4, 5

4 PROCEDIMENTO SUOLO 10 g glass beads 2mm 1h 180rpm 28 C 1 g in 10 ml di PBS 30 omogeneizzazione Stock suolo tq e in glicerolo Stock pellet e glicerolo (coltivabili) 5 giorno: sospensione in S.F. da piastre con ca colonie 30 vortex Conta colonie 24 h, classe I 48 h, classe II 6 gg, classe III Morfologia 0.1 TSA + cycloheximide 100 mg/ml R-strateghi K-strateghi Modificato da Smalla, AEM 67, 2001 Diluizioni 1:10 in S.F. Isolamento colonie 6 giorno: isolamento da piastre con ca colonie, mediante griglia da 50 posizioni purificazione attraverso passaggi su 0.1 TSA inoculo in NB crescita o/n stock in glicerolo

5 Morfologia delle colonie Crescita a 28 C su 0.1 TSA, 48 h A. bianca sfrangiata molto grande, si estende sulla piastra B. bianca mucosa, diametro ca. 2-3 mm C. giallina mucosa, diametro ca. 2-3 mm isolate circa 500 colonie (100 da ogni campione: 20 / replica) D. bianca translucida, diametro < 1 mm, puntiforme E. bianca, diametro ca. 7 mm F. bianca mucosa, diametro ca. 5 mm, presente alle diluizioni alte (10-3, 10-4 ) G. giallina puntiforme H. bianca trasparente diametro ca. 2-3 mm I. gialla, diametro ca. 3 mm L. gialla brillante fosforescente mucosa, diametro ca. 2-3 mm M. bianca, diametro < 1 mm, puntiforme N. gialla sciamante, a 6 gg ricopre tutta la piastra O. bianca mucosa, diffonde su tutta la piastra P. arancione, diametro ca. 2-3 mm Q. bianca mucosa contorno irregolare, diametro ca. 5-6 mm R. rosa mucosa, diametro ca. 4 mm

6 Distribuzione diverse morfologie nei 5 campioni di suolo CAMPIONI VI VL SU ER PA Morfologia A x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x B x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x C x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x D x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x E x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x F x x x x x x x x x x x x x x x x x x x G x x x x x x x x x x x x x x x x x H x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x I x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x L x x x x x x x x x x x x x x x x x M x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x N x x x x x x O x x x x x x x x x x x x P x x x x x x x x x x Q x x x x x R x x x La maggiore diversità di morfologie in SU (sughereta) Morfologie presenti solo in Vi (tipo G) o VL (tipi N e O)

7 Conta batteri Cfu/g suolo: conta ogni 24 h 1, 2 e 6 gg (classi CI, CII, CIII) Il numero di batteri d ogni classe viene espresso come % della conta totale Indice ecofisiologico: EP-index = - ( p i Log 10 p i ) 5 campioni x 5 repliche 7 diluizioni (da 10-1 a 10-7 ) / replica, in doppio n. tot piastre: 350 p i = colonie della classe i / colonie totali 0 < EP-index > 1 Esprime la distribuzione dei batteri nelle varie classi microbiche e il grado di diversità all interno della comunità microbica in base alla capacità di crescita su terreno di coltura e fornisce informazioni, in termini eco- fisiologici, sulla composizione della comunità batterica Trasformazione Logit Ln p/1-p Analisi statistica dei dati: analisi della varianza (ANOVA), t-test test 10

8 Conta batteri: risultati Maggio 2007 Cfu / g suolo CI % CII % CIII % TOT EPI VL 1.44x10 6 aacde x10 6 ba x10 6 cbc x * Vi 2.97x10 6 ab x10 6 ba x10 5 ca x PA 5.28x10 6 abbef x10 7 aa x10 6 bac x acd 6 ba 6 abbc 7 ER 1.50x10 6 acd x10 6 ba x10 6 abbc x * SU 1.01x10 6 acf x10 6 aa x10 6 abc x In tutti i campioni prevalgono i batteri a crescita rapida, r-strateghi di classe II, ad eccezione del campioni Vi in cui prevale la CI Gli indici ecofisiologici indicano una distribuzione non omogenea dei batteri tra le varie classi, in particolar modo nell erbaio (*)L analisi statistica (ANOVA) ha evidenziato una differenza significativa della distribuzione dei batteri tra le classi (EPI), soltanto tra i campioni VL ed ER L analisi statistica è stata condotta anche all interno di ogni campione (lettera minuscola) e all interno di ogni classe (lettere maiuscole).

9 Campionamento suolo Berchidda (SS) CAMPIONI SUGHERETA (SU) ERBAIO AUTUNNO VERNINO (ER) PASCOLO (PA) VIGNETO INERBITO (Vi) VIGNETO LAVORATO (VL) 5 repliche per ogni campione SU 1, 2, 3, 4, 5 ER 1, 2, 3, 4, 5 PA 1, 2, 3, 4, 5 Vi 1, 2, 3, 4, 5 VL 1, 2, 3, 4, 5

10 PROCEDIMENTO SUOLO 10 g glass beads 2mm 1h 180rpm 28 C 1 g in 10 ml di PBS 30 omogeneizzazione Stock suolo tq e in glicerolo Stock pellet e glicerolo (coltivabili) 5 giorno: sospensione in S.F. da piastre con ca colonie Estrazione DNA DGGE 30 vortex Conta colonie 24 h, classe I 48 h, classe II 6 gg, classe III Morfologia 0.1 TSA + cycloheximide 100 mg/ml R-strateghi K-strateghi Modificato da Smalla, AEM 67, 2001 Diluizioni 1:10 in S.F. Isolamento colonie 6 giorno: isolamento da piastre con ca colonie, mediante griglia da 50 posizioni purificazione attraverso passaggi su 0.1 TSA inoculo in NB crescita o/n stock in glicerolo

11 Conta batteri: risultati Novembre Cfu / g suolo CI % CII % CIII % TOT EPI * VL 1.44x10 5 aab x10 5 bac x10 5 aa x Vi 2.14x10 5 abc x10 5 bac x10 5 aa x PA 1.09x10 6 ac x10 6 aa x10 5 ba x ER 2.24x10 4 aa x10 5 bbc x10 4 ca x SU 1.23x10 6 abc x10 6 aa x10 5 ba x In tutti i campioni prevalgono i batteri a crescita rapida, r-strateghi di classe II, ad eccezione del campioni PA in cui prevale la CI I valori degli indici ecofisiologici indicano una distribuzione non omogenea dei batteri tra le varie classi, specialmente nei campioni ER e VL (*)L analisi statistica (ANOVA) ha evidenziato una differenza significativa della distribuzione dei batteri tra le classi (EPI), tra il campione ER e tutti gli altri tranne VL, e tra i campioni VL e SU L analisi statistica è stata condotta anche all interno di ogni campione (lettera minuscola) e all interno di ogni classe (lettere maiuscole).

12 Confronto Maggio vs Novembre % CLASSE / TOTALI CI CII CIII CFU tot / g EP index maggio nov maggio nov maggio nov maggio nov maggio nov VL VL Vi Vi 51* 27* * 22* PA PA ER ER SU SU x x10 22* 5.68x x x x x x x x x * 0.37* 7.40 x x x x * Differenze statisticamente significative

13 ESTRAZIONE DNA Pellet sospeso in 1 ml di SF e suddiviso in 5 aliquote 2 estrazione DNA genomico Formazione nuovi pellet e sospensione in TE Agitazione 20 con vortex orizzontale con 250 mg glass beads ( µm) Incubazione SDS 10%, proteinasi K Incubazione NaCl e ctab Lavaggi fenolo-cloroformio Incubazione RNAsi Precipitazione DNA in isopropanolo Lavaggio in etanolo 70% Sospensione DNA in acqua bidistillata sterile 3 centrifuga e stock -80 C dei pellet RESE ESTRAZIONE DNA Vi 1 Vi 2 Vi 3 Vi 4 Vi 5 ng/ µl VL1 VL 2 VL 3 VL 4 VL 5 ng/µl ER 1 ER 2 ER 3 ER 4 ER 5 ng/µl PA 1 PA 2 PA 3 PA 4 PA 5 ng/µl SU 1 SU 2 SU 3 SU 4 SU 5 ng/µl Soluzioni 15 ng/ µl Modifica di Current Protocols in Molecular Biology, 1995 vol 1. Edited by Ausbel F.M et al.

14 DGGE PCR P0 - P6 : regione V3 dei 16SrDNA per gli eubatteri Nested PCR P63fGC - P518r : frammento lungo = 495bp (El Fantroussi et al. 1999) Gel DGGE con doppio gradiente LOW solution: 30%denaturante; 6% acrilammide HIGH solution: 60%denaturante; 12% acrilammide 16 h - 75 V - 60 C Colorazione: 220 ml H 2 O + 22 µl Etidio Bromuro; agitazione 30 a 20rpm Decolorazione: 220 ml H 2 O; agitazione 25 a 20rpm

15 DGGE Vi e VL Foto acquisite con apparecchiatura UVIpro platinum, UVITEC Vi 5 Vi 4 Vi 3 Vi 2 Vi 1 VL 5 VL 4 VL 3 VL 2 VL 1

16 DGGE SU PA ER SU V SU IV SU III SU II SU I PA V PA IV PA III PA II PA I ER V ER IV ER III ER II ER I

17 CLUSTER ANALYSIS VL e Vi Dendrogramma ottenuto utilizzando come coefficiente di similarità l indice di Dice e come metodo di analisi l UPGMA Analisi effettuata con software UVIbandmap, UVitec VL Vi

18 CLUSTER ANALYSIS SU- PA- ER Dendrogramma ottenuto utilizzando come coefficiente di similarità l indice di Dice e come metodo di analisi l UPGMA Analisi effettuata con software UVIbandmap, UVitec SU PA ER

19 BANDE TAGLIATE Vi - VL Vi 5 Vi 4 Vi 3 Vi 2 Vi 1 VL 5 VL 4 VL 3 VL 2 VL 1

20 Prossime attività CAMPIONE NOVEMBRE 2007 Sequenziamento delle bande significative tagliate al fine di individuare gruppi tassonomici di interesse CAMPIONE MAGGIO 2007 Estrazione del DNA dai coltivabili totali DGGE sul 16 S rdna per eubatteri Analisi della diversità Isolamento delle bande significative al fine di individuare gruppi tassonomici di interesse CONFRONTO TRA I DUE CAMPIONAMENTI CONFRONTO DGGE COLTIVABILI vs DGGE DNA TOTALE

21 Working group Annamaria Bevivino, Claudia Dalmastri, Silvia Cesarini, Luisa Pirone, Luigi Chiarini, Silvia Tabacchioni, Patrizia Paganin

22 NUMERO BANDE VI VL ER PA SU media