Criteri metodologici per la stima dell esposizione in emergenze idropotabili associate a fioriture di cianobatteri

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1 Cianobatteri nelle acque destinate al consumo umano: analisi dei dati, gestione del rischio, principi, criteri e metodi di comunicazione del rischio Bari 6-7 dicembre 2011 Criteri metodologici per la stima dell esposizione in emergenze idropotabili associate a fioriture di cianobatteri Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Reparto Igiene delle Acque interne Sara Bogialli Università di Padova, Dipartimento di Scienze chimiche sara.bogialli@unipd.it 1

2 Analisi di cianobatteri e cianotossine: da dove partire? 2

3 Cianotossine più frequenti in Italia CIANOTOSSINE CIANOBATTERI EFFETTO DISTRIBUZIONE Microcistine (MCs) Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Nostoc, Anabaenopsis; Snowella, Woronichinia Acuto: Epatotossico Cronico: Promotori tumorali Ubiquitari Molto comuni in acque dolci Cilindrospermopsina (CYL) Cylindrospermopsis, Anabaena, Umezakia, Aphanizomenon, Raphidiopsis Acuto: Danni a tessuti e organi (fegato) Cronico: Possibili cancerogeni Notifiche in aumento specie nei climi caldi Anatossine (ANA) Anabaena, Planktothrix, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Raphidiopsis Acuto: Neurotossico Acque dolci: fenomeni molto limitati Anatossina-a(s) Anabaena Acuto: Neurotossico Acque dolci: registrata raramente Nodularine Nodularia Acuto: Epatotossico Cronico: Promotori tumorali Acque salmastre Sorgenti termali d acqua dolce Saxitossine Anabaena, Planktothrix, Aphanizomenon, Lyngbya, Cylindrospermopsis Acuto: Neurotossico In acque dolci riportato in America, Australia ed Europa BMAA Da letteratura risulta presente nel 95% delle specie testate Cronico: Neurotossico Ubiquitario Lipopolisaccaridi Tutti i cianobatteri Acuto: Infiammazioni Possono interferire con i meccanismi di detossificazione Ubiquitario 3

4 Le prime fasi critiche Una volta effettuato il campionamento Come conservare i campioni fino all analisi? 4

5 Criticità nelle analisi_conservazione Le MC, NOD e CYL degradano alla luce soprattutto in presenza di detriti cellulari Anatossina-a ed omoanatossina degradano rapidamente alla luce anche in assenza di pigmenti (1-2 ore) In generale la degradazione microbica delle cianotossine viene in genere rallentata da condizioni refrigerate 5

6 Criticità nelle analisi_i materiali La CYL viene fortemente assorbita dal polietilene, evitare quindi tali contenitori nel campionamento e/o stoccaggio È riportato che anche le MC vengono adsorbite da alcuni materiali plastici come il PVC Sempre per le MC preferire contenitori in vetro scuro alla plastica se si utilizza un rivelatore UV. La plastica può rilasciare additivi che assorbono a 238nm e che vengono facilmente coeluiti con le MC Ikawa et al., Toxicon 37 (1999)

7 Lo standard di processo (QC) La nostra assicurazione di qualità Prevedere di usarlo prima possibile Gli standard marcati sono ideali...a patto di saperli distinguere! (NOD per analisi MC) Dipende dalla tecnica analitica utilizzata Se scelto con criteri rigorosi, ci dice tutto (o quasi) sulla nostra analisi I composti target sono degradati Criticità nella procedura di preparazione del campione Criticità nella determinazione strumentale (tempi di ritenzione, sensibilità, riproducibilità) 7

8 Criticità nelle analisi_ il pretrattamento Gestione della risorsa Informazione Conservazione Adeguato volume di acqua EXTRACELLULARE (EC) TOTALE (EC+IC) Analisi di acque trattate: Attenzione ai residui di ossidanti (p.es. Standard di processo) 4 C -18 C 0,45 μm Filtri FASCIA NERA 8

9 Una linea guida utile per le analisi 9

10 Metodi di screening e di conferma 10

11 Metodi di conferma 11

12 Metodi di conferma 12

13 Cianotossine_ Screening di campioni ambientali Metodi biologici (Saggi in vivo: MBA, Daphnia) Metodi biochimici (Phosphatase Inhibition Assay ) Metodi immunoenzimatici (Enzyme Linked Immunosorbend Assay) Qualitativi e/o semiquantitativi Livelli di sensibilità variabili a seconda del metodo usato A risposta rapida Non necessitano di standard analitici Non discriminano tra le varie tossine 13

14 Metodi biologici: saggi in vivo Vertebrati: Mouse BioAssay P R O C O N T R O Screening iniziale (identifica la presenza di qualsiasi tossina) Relativamente veloce e poco costoso Di facile applicazione Fornisce indicazioni di tossicità Bassa sensibilità Utilizzo di un discreto numero di animali: problemi etici Metodo esclusivamente qualitativo (tossicità si/no) Preclude l identificazione di effetti ritardati (letalità/sub letalità) Somministrazione poco rappresentativa della reale esposizione umana Invertebrati: es. Daphnia magna P R O C O N T R O Facilmente reperibile in commercio Costi limitati Facile esecuzione 24-48h per la risposta (saggio acuto) No problemi etici Metodo qualitativo (tossicità si/no) Aspecifico Allevamento laborioso Misura di tossicità totale del campione In alcuni casi del tipo di tossina presente (in base ai sintomi o in seguito a necrosi) 14

15 Metodi biochimici e immunoenzimatici sensibili allo scopo (~ 0,1 µg/l per MC) molti campioni in poco tempo relativamente poco costosi in grado di determinare la presenza di classi di tossine, indipendentemente dalla disponibilità di standard 15

16 Metodi Biochimici: Phosphatase Inhibition Assay (Ppi) Principio: microcistine e nodularina sono forti inibitori di proteine (serina/treonina) fosfatasi, classificate in due gruppi: - Tipo 1: PP1 - Tipo 2: PP2 Livello di inibizione dipende dalla concentrazione di tossina La quantificazione della inibizione può essere fatta con tre tecniche ( p-nitrofenil fosfato; 4-metil-umbelliferilfosfato; 32P) P R O sensibilità variabile (32P: LOD 0,1 g/l MCs) non è richiesta concentrazione del campione relativamente poco costosi rileva quantità totale di epatotossina solo per epatotossine (no distinzione tra C varianti) O breve emivita del P radioattivo (circa 14giorni) N difficoltà di molti laboratori di lavorare con T radioattivo (possibilità di utilizzare gli altri R substrati) O 16

17 Metodi immunoenzimatici: Enzyme Linked Immunosorbend Assay (ELISA) Il metodo utilizza anticorpi policlonali o monoclonali, immobilizzati sulle pareti di un sistema test, che possono legare sia le cianotossine che un coniugato enzima cianotossine (reattive all Adda) In ogni pozzetto è contenuta una quantità nota di anticorpi immobilizzati La rivelazione dei complessi si ha per via colorimetrica, con una relazione inversa che lega intensità di colore e concentrazione di CTox legate Il dosaggio si basa sulla lettura dell assorbanza (450 nm) La quantificazione avviene per confronto/estrapolazione con una curva standard, costruita con la MC-LR (eq. di MC-LR) 17

18 I kit per MC e nodularina Diversi Kit disponibili in commercio (LOQ: 0.1-5µg/L) Non si richiede pre-concentrazione del campione Determinazione Totale di Microcistine/nodularina Tossine Cross reattività MC- LR 100% MC- YR 64% MC-RR 53% MC-LA 48% Nodularina 76% N-hemi-ADDA 38% ADDA 15% Buona sensibilità ma cross reattività (con congeneri e prodotti di degradazione: Adda): SOVRASTIMA 18

19 Criticità test di screening_ i congeneri MC Perchè volere di più? P. rubescens M. aeruginosa 19

20 I kit per Cyl Qualche Kit disponibile in commercio (LOQ: 0,05-2µg/L) Stesso KIT per campioni ambientali diversi: acqua, tessuto e plasma di pesci Non richiede pre-concentrazione del campione Ancora poche informazioni in letteratura 20

21 Metodi di conferma_ sorgenti di errori 6% 7% 8% 9% 6% 4% Sample processing Operator 30% Columns Calibration Instrument Chromatography Integration Sample introduction 19% 11% Contamination 21

22 Analisi di conferma_ schema generale Estrazione con solvente (bloom, tessuti) Estrazione in fase solida (Solid phase extraction, SPE) Estrazione: campioni acquosi Purificazione: tessuti, bloom ANALISI STRUMENTALE 22

23 Conferma per MC Bloom, tessuti Molti solventi utilizzati Prevalentemente MeOH Campioni acquosi C18, carbone grafitato (GCB), polimeriche, immunoaffini HPLC-UV, -DAD LC-MS, MS/MS 23

24 ISO 20179:2005 Water quality - Determination of microcystins - Method using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet (UV) detection ISO 20179:2005 specifies a method for the determination and quantification of microcystins in raw water (containing biomass) and treated water, such as tap water. The method described is validated for MCYST-RR, MCYST-YR and MCYST-LR. It is also applicable for the determination of several structure variants of these microcystins, but an unambiguous identification cannot be made due to the lack of commercially available standards and due to coelution. 24

25 UV detection_qualche criticità Con rivelatori UV le MC e la NOD assorbono a nm, per le varianti che contengono amminoacidi aromatici, come la MC-LW che contiene un triptofano, l assorbimento massimo si ha a lunghezze d onda inferiori, a 222nm. Molte sostanze coeluiscono con le MC e assorbono alla stessa lunghezza d onda. In tali casi rivelatori come il DAD consentono di identificare le MC ma non di distinguerne le varianti L identificazione inequivocabile delle MC si ottiene solo con rivelatori di massa, sia MS che MS/MS. Tali metodiche si sono rivelate fondamentali nell identificazione sia delle MC note che delle nuove varianti 25

26 LA TECNICA: LC-SPETTROMETRIA DI MASSA Campione (A+B+C) [C] + [ ] + energia [C 1 ] + [C 2 ] + [C 3 ]+ [C 2 ] + [C 3 ] + [C 1 ] + [C] + Numero (m/z) A B C Presentazione del segnale Elaboratore di segnale 26

27 Albano -5m Sett Identificazione certa in LC/MS/MS [C 2 ] + [C 3 ] + [C 1 ] + [C] CYL 416 > 336 m/z % Si sfruttano i due sistemi % CYL 416 > 194 accoppiati: La cromatografia % STANDARD TIC (tempo di ritenzione Tr) E le informazioni mass 0 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00 10,50 11,00 11,50 12,00 12,50 13,00 13,50 14,00 14,50 CONFRONTO CON UNA SOLUZIONE PURA (STANDARD) Time spettrometriche 27

28 Identificazione di una sostanza cromatografia/ms (Dec.2002/657) 1. t r relativo non può variare più del 2,5% (LC) o 0,5% (GC_capillari) rispetto alla soluzione standard 2. Per gli analiti i punti di identificazione devono essere almeno 3 3. Le intensità relative delle coppie ione precursore/ione prodotto devono rispettare le tolleranze massime consentite 28

29 Punti di identificazione _cromatografia/ms (Dec.2002/657) 29

30 Identificazione certa con MS_ Identification points (IPs) 30

31 Analisi di MC_ I soliti sospetti Modalità di acquisizione ESI+, MRM Presenza di un frammento caratteristico della classe + C H O H 3 3 H 3 C O + O C H 3 Adda C H 3 C H 3 N H + H + [M+2H] 2+ m/z

32 Esempio di informazioni in MS Collision cell Q 1 Q 3 + Ar + O C H 3 O C H 3 Ar + O C H 3 Ar IDENTIFICAZIONE MCs IN FULL-SCAN 32

33 Conferma di CYL e ANA Bloom, tessuti H 2 O, H 2 O acidificata, MeOH acidificato miscele MeOH/H 2 O Campioni acquosi C18 (campione basico), debole scambio cationico, carbone grafitato HPLC-UV, -DAD, -FLD (previa derivatizzazione) LC/MS, MS/MS (iniezione diretta) 33

34 Cilindrospermopsina e anatossina-a nelle acque campione filtrazione Aliquota iniettata direttamente LC-MS tandem 34

35 Cilindrospermopsina e anatossina-a nelle acque CYL CYL LOQ CYL = 300 ng/l 35

36 Cilindrospermopsina e anatossina-a nelle acque LOQ Ana-a 13 ng/l Acqua di lago contaminata con 50 ng/l di ANA-a 36

37 PROTOCOLLI DI VALIDAZIONE 37

38 L accuratezza dei dati analitici Dati con precisione ed esattezza ignote sono privi di significato D'altro canto, anche risultati che non sono particolarmente accurati possono essere di considerevole valore se sono noti i limiti di incertezza Spesso e piu importante la riproducibilita Una delle domande a cui rispondere prima di cominciare un'analisi è: "qual è il massimo errore tollerabile nel risultato? La risposta a questo quesito determina il tempo richiesto per il lavoro: un aumento consistente dell'accuratezza può richiedere ore, giorni, e persino settimane di lavoro aggiuntivo Nessuno può permettersi di produrre dati che siano più accurati di quanto occorra 38

39 L accuratezza dei dati analitici Tutti cercano il recupero completo! Spesso e piu importante la riproducibilita 39

40 Il rivelatore aiuta? Ci può essere necessità di concentrare o derivatizzare (es. per GC, UV, fluorimetria) il composto target 40

41 ANA-a dove gli strumenti non possono... Analisi LC/MS con triplo quadrupolo come detector 41

42 ANA-a_ falso positivo Composto Massa esatta, (m/z) Transizioni, (m/z) e abbondanze relative Phe % 34.4% 50% 13.4% Ana-a % 10.5% 27% 52.8% O NH 2 OH O CH 3 NH Fenilalanina (amminoacido) Anatoxin-a (neurotossina algale) Hanno tuttavia λ max differenti 42

43 Cianotossine_ prodotti di degradazione Le cianotossine, in seguito a trattamenti di potabilizzazione, possono generare prodotti di trasformazione potenzialmente tossici. Ad oggi, informazioni strutturali su trattamento di ossidazione con cloro: Microcystins 7 prodotti di degradazione Bassa tossicità acuta e limitata attività su saggi biologici ed enzimatici Cylindrospermopsin 2 prodotti di degradazione Bassa tossicità acuta e limitata attività su saggi biologici ed enzimatici Anatoxin-a Scarsa reattività alla clorazione 43

44 «Early-warning»_ fluoroprobe Specie algale (p.es P. rubescens) concentrazione di Chl a Risposta colorimetrica Necessita di taratura per ciascuna specie, ma risulta sempre utile per le variazioni di concentrazione

45 L approccio alle analisi_riepilogo Sospetto di esposizione a cianotossine (visivo o da monitoraggio on-line) Identificazione del cianobatterio Test di screening veloce Metodo di conferma selettivo 45

46 Il compromesso nella pianificazione delle analisi Rapidità e affidabilità della risposta Standard certificati Strumenti disponibili ANALISI QUALITATIVE e QUANTITATIVE 46

47 Analisi di cianotossine in acqua_ la scelta Riconoscimento algale utile Conta algale non adatta per valutare cianotossine Metodi di screening Adatti alla scopo Da usare con prudenza Metodi di conferma Risposte certe e definitive 47

48 Analisi di cianotossine in acqua_ la scelta Sistema di rivelazione Limiti di rivelazione, μg/l Preparazione del campione Costo Capitale Consumabili Personale Mouse biossay - - B B/M M Artemia salina bioassay Daphnia bioassay - - B B/M M Microcistine e Nodularine ELISA, policlonale 0,6-2,5 - M A B/M ELISA, monoclonale 0,1 - M A B/M Inibizione della protein fosfatasi, radioattivo Inibizione della protein fosfatasi, spettrofotometrico 0,1 - M M B/M 0,1-2,5 - B/M M B/M LC-DAD 0,25 SPE M B/M M LC-MS/MS 0,002-0,017 SPE A B/M A Commenti -Responso per classe tossica, non selettivo. -Necessità di autorizzazioni, risvolti etici -Poco sensibile, non selettivo. -Disponibili kit commerciali -Sensibile. -Rapido -Risposta per tutte le MC espressa in equivalenti di MC-LR. -Reattività dei congeneri può variare. -Molto sensibile. -Rapido -Risposta per tutte le MC espressa in equivalenti di MC-LR. -Reattività dei congeneri può variare. -Sensibile. -Non selettivo. -Richiede attrezzatura speciale -Sensibile, non selettivo. -Necessità di enzimi purificati -selettività in funzione della separazione cromatografica -Necessità di standard esterni per quantitativa -Alta sensibilità e selettività per le diverse varianti. -Necessità di standard 48 esterni per quantitativa

49 Analisi di CYL e ANA in acqua_ la scelta Sistema di rivelazione Limiti di rivelazione, μg/l Preparazione del campione Costo Capitale Consumabili Personale Commenti Anatossina-a e analoghi strutturali LC-DAD 0,05 SPE M B/M M -Necessità di standard esterni per quantitativa LC-FLD 0,01 SPE M B/M M -Alta selettività nei confronti di interferenti* -Necessità di derivatizzazione -Necessità di standard esterni per quantitativa LC-MS/MS 0,008-0,2 -/SPE A B M/A -Alta sensibilità. -Alta selettività nei confronti di interferenti* -Necessità di standard esterni per quantitativa -Analisi diretta, rapido Cilindrospermopsina e analoghi strutturali ELISA, policlonale M A B/M -Sensibile. -Possibile risposta per analoghi strutturali o coniugati. LC-MS/MS 0,3 - A B A -Alta sensibilità e selettività. -Analisi diretta, rapido -Necessità di standard esterni per quantitativa 49

50 Conclusioni Utilizzare procedure di campionamento e conservazione adeguate allo scopo, adatte alla determinazione del contenuto extracellulare o totale (intracellulare+extracellulare) di tossine. L informazione desumibile dai risultati analitici, soprattutto per controlli sull invaso, è determinata dalla rappresentatività del campione (posizione e profondità rispetto all opera di presa, rispetto ai punti di conformità DL 31/01) oltre che da una valutazione complessiva del sistema idrico secondo WSF. L adozione di metodi analitici di screening e conferma per la determinazione delle cianotossine è determinata dalle risorse disponibili e dagli scopi della ricerca i metodi di screening sono utili in fase di emergenza e per controlli di routine, i metodi di conferma devono supportare i processi decisionali e la valutazione del rischio associata all invaso ed al sistema idrico, secondo i modelli WSP, ad esempio in possibile presenza di molteplici congeneri di tossine. Adottare procedure di controllo qualità (QC), quali ad esempio uso di uno standard interno adeguato. 50

51 Ringraziamenti e contatti Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Reparto Igiene delle Acque interne Dott.ssa Simona Scardala (ISS) Dott.ssa Mara Stefanelli (ISS) Dipartimento di Scienze Chimiche Via Marzolo, Padova sara.bogialli@unipd.it sara.bogialli@gmail.com 51