DNA sequence alignment

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1 DNA sequence alignment - Introduzione: un possibile modello per rappresentare il DNA. Il DNA (Acido desossiribonucleico) è una sostanza presente nei nuclei cellulari, sia vegetali che animali; a questo composto spetta una parte essenziale nella trasmissione dei caratteri ereditari. Secondo lo schema proposto da Crik e Watson, la molecola di DNA è formata da una doppia elica; le due catene, avvolte attorno ad un asse comune, sono tenute unite da legami trasversali formati da Basi Azotate (vedi Fig[1]). Le basi azotate che formano la sequenza di DNA sono quattro: 1 Adenina. 2 Citosina 3 Guanina 4 Timina La sequenza con cui le quattro basi sono distribuite lungo il filamento è fondamentale nella trasmissione dei caratteri ereditari, in quanto rappresenta il codice genetico di ogni essere vivente. Al fine di rappresentare il DNA nel suo compito di portatore di informazioni genetiche si può usare un semplice modello: Associando ad ogni base un carattere (per maggior leggibilità del modello è conveniente scegliere l iniziale del nome) il codice genetico può essere rappresentato come una stringa di caratteri appartenenti all alfabeto {A, C, G, T}. - Il problema del DNA-sequence alignment: applicazioni pratiche e formulazione matematica. Negli ultimi anni l ingegneria genetica ha fatto moltissimi passi avanti, è stato scoperto come isolare geni responsabili di malattie ereditarie, oppure come modificare il codice genetico di alcune piante da coltivazione per renderle più produttive; Senza parlare dei problemi di etica, la situazione tipica che si trova ad affrontare chi si occupa di questa materia è caratterizzata dall elevato numero di dati del problema stesso, infatti, la sequenza del DNA può contenere anche milioni di basi azotate. Un caso fra tutti è quello del DNA-sequence alignment. In molte applicazioni i biologi sono interessati a confrontare fra loro due, o più, sequenze di DNA per avere una misura di quanto sono simili tra loro, un semplice metodo per misurare la somiglianza fra due sequenze B e D di DNA è quello di ottenere la sequenza D con una serie di trasformazioni a partire da B e determinare quella meno onerosa. Le trasformazioni necessarie per ottenere D partendo da B sono tre: 1 Inserimento di un elemento nella sequenza B. 2 Cancellazione di un elemento nella sequenza B. 3 Mutare un elemento bi in dj dove con i e j indico la posizione all interno della sequenza. Associando ad ogni trasformazione un costo è evidente, che una volta trovata la serie di trasformazioni meno onerosa, il suo costo da una misura della similitudine fra le due sequenze. Questo problema è detto DNA-sequence alignment (allineamento delle sequenze di DNA). 1

2 E possibile affrontare questo problema con un approccio di tipo ricorsivo, indichiamo con f(i,j) il costo minimo per eseguire la seguente trasformazione: [ b b] [ d... ] i d j Lo scopo del problema è quello di trovare f(i,j) che rappresenta il costo minimo per eseguire la trasformazione da B lunga i a D lunga j. Per determinare f(p,q) è possibile usare la seguente definizione ricorsiva del problema: [1] f (i,0) = β i [2] f (0, j) = α j [3] f (i, j) = min { f ( i 1, j 1) + g( i, j), f ( i, j 1) + α, f ( i 1, j) + β} Giustifichiamo adesso queste relazioni: Il costo di una trasformazione da una sequenza [b1 bi] in [0 0i] è quello di i cancellazioni, quindi se β rappresenta il costo di una cancellazione si ha la [1]. Analogamente per la situazione inversa (j inserimenti) si ottiene la [2]. Per chiarire il significato della [3] indichiamo con B la penultima sequenza intermedia (quella da cui con un unica trasformazione si ottiene la sequenza finale). Una volta raggiunta la sequenza B per ottenere la sequenza D si possono verificare tre casi: - Caso 1: la sequenza B [b1 bi] differisce dalla sequenza [d1 dj] per una sola base, in particolare bi dj quindi l ultima trasformazione da eseguire è quella di cambiare bi in dj con costo g(i,j), allora il costo minimo diventa f(i-1,j-1) + g(i,j). - Caso 2: le sequenze [b1 bi] e [d1 dj] sono allineate, ma la sequenza finale contiene una base in più, quindi è necessario un inserimento con costo α: il costo minimo è f(i,j-1)+ α. - Caso 3: le sequenze [b1 bi] e [d1 dj] sono allineate, ma la sequenza finale contiene una base in più, quindi è necessaria una cancellazione con costo β: il costo minimo è f(i-1,j)+ β. Considerato il fatto che siamo interessati al costo minimo riunendo i tre casi si ottiene la [3].Dalla definizione ricorsiva si può ottenere un grafo che rappresenta il problema come in fig. 2: Giustifichiamo l equivalenza tra la formulazione ricorsiva e quella su grafo. Gli archi orizzontali rappresentano le cancellazioni, mentre gli archi verticali rappresentano gli inserimenti, quindi semplicemente scorrendo i nodi del grafo da destra verso sinistra e dall alto verso il basso si ricavano le relazioni [1] e [2]. Si può dimostrare che il costo del cammino di costo minimo dal nodo Si al nodo Sf è equivalente alla [3], infatti il cammino deve obbligatoriamente passare da uno dei seguenti archi (C1,Sf), (C2,Sf), (C3,Sf) che rappresentano proprio i tre casi precedentemente visti. In conclusione si è dimostrato come il problema del DNA Sequence alilgnment possa essere ricondotto ad un problema di cammino di costo minimo. 2

3 - Realizzazione del modello. Per la realizzazione del modello abbiamo utilizzato l ambiente AMPL che ci permette di separare il modello dai dati. Il modello come abbiamo dimostrato si può ricondurre ad un problema di cammino di costo minimo; il file DNA.MOD contiene proprio la definizione di tale problema secondo la sintassi AMPL. Il file modello è cosi organizzato: Le prime linee contengono le dichiarazioni necessarie per accedere ai dati, come l insieme dei nodi e delle basi. Dopo queste prime linee segue la dichiarazione degli archi come prodotto cartesiano fra i nodi. Di questo prodotto non sono stati considerati gli archi che hanno come destinazione la sorgente e come origine il terminale visto che non esistono nel nostro grafo archi cosi fatti. Inoltre sempre nel file DNA.MOD abbiamo imposto dei vincoli sui costi in modo da renderli non negativi. Il vettore Bilancio contiene il bilancio del flusso per ogni nodo, questo vettore serve per definire il vincolo sulla legge di conservazione del flusso, quindi viene inizializzato ponendo il valore del bilancio pari a zero per ogni nodo diverso dalla sorgente e dal terminale. Per il nodo sorgente, che genera flusso, il valore del bilancio e posto a 1, mentre per il terminale che si comporta come un pozzo di flusso il valore del flusso è 1. La matrice flusso invece rappresenta il flusso su ogni nodo, nel modello si impone anche che il flusso sia sempre positivo in modo da percorrere gli archi solo in una direzione. Poi sempre nel file DNA.MOD ci sono le dichiarazioni delle funzioni obiettivo: - minimizzare il costo; - massimizzare il costo; Il modello per come lo abbiamo descritto presenta una sola funzione obiettivo: minimizzare il costo, ma in sede di analisi dei risultati è molto comodo avere anche il costo massimo in modo da avere un range entro il quale può variare il costo. Ovviamente non si tratta di un problema multi obiettivo in quanto il risolutore risolve il problema considerando una funzione obiettivo alla volta. Il modello una volta definito resta uguale per ogni coppia di sequenze che vogliamo confrontare, questo non vale per quanto riguarda il file dati essendo quest ultimo strettamente dipendente dalla coppia considerata. Quindi per ogni confronto è necessario generare un file che contiene i dati, ma come precedentemente accennato il problema principale in questi casi è che i dati sono tantissimi, quindi scrivere il file dei dati a mano è impossibile anche per una sola coppia di sequenze. La soluzione da noi scelta e quella di realizzare un programma esterno che genera il file dati (denominato DNA.DAT). Il programma DNA.Java si occupa proprio di questo. E stato scelto di scrivere il programma in linguaggio Java (secondo le specifiche del JDK 1.2.1) in modo da renderlo indipendente dalla piattaforma. Il programma DNA.java funziona in un ambiente a finestre, appena lanciato appare una finestra come in fig.[3] che richiede l immissione di alcuni dati necessari per preparare il file DNA.DAT. Il primi due campi di immissione, quelli denominati Prima sequenza e Seconda sequenza richiedono l immissione del percorso e del nome dei due file che contengono le sequenze vere e proprie. Per la memorizzazione delle sequenze il formato scelto è quello di un file testo dove la prima linea contiene la lunghezza della sequenza e le linee successive contengono la sequenza di basi azotate (1 per ogni linea). 3

4 Un possibile esempio di file.dna è il seguente : File SEQ.DNA: 5 A C T G T La scelta di questo tipo di formato è stata fatta principalmente per permettere ad un utente di generare la sequenza utilizzando semplicemente un editor testi, inoltre se le sequenze di DNA fossero memorizzate in formati diversi diventa semplice scrivere un programma di conversione. Gli altri campi di immissione presenti nella finestra di input sono : - Costo della cancellazione. - Costo dell inserimento. - Costi delle trasformazioni fra basi azotate. I costi delle trasformazioni sono organizzati secondo una matrice, ad esempio il costo per trasformare la base A in C si trova all incrocio fra la riga A e la colonna C. Da notare che abbiamo lasciato la possibilità di modificare i costi delle trasformazioni tra basi uguali, questo per utilizzare il programma di generazione anche per modelli diversi da quello del DNA Seq.Align.. Nel caso specifico non è logico dare un costo diverso da zero alle trasformazioni tra basi uguali altrimenti si ha un costo anche sul confronto fra sequenze uguali. Una volta inseriti tutti i dati si procede alla creazione del file DNA.DAT con il pulsante CREA. Il file DNA.DAT contiene la definizione del grafo tramite la matrice di adiacenza con la notazione AMPL, segue una descrizione del file: Descrizione file DNA.dat set NODI := Numero nodi ; set file := "sequenza 1" "sequenza2"; set BASI := A C G T ; param SeqInizio := 1 ; param SeqFine := Numero nodi; param n1 := Lunghezza 1 seq. ; param n2 := Lunghezza 2 seq. ; param Trasf := [*,*] : A C G T := A a b c d C e f g h G i l m n T o p q r; param : ARCHI : Costo := Inizio Fine Peso inserimento Inzio Fine Peso cancellazione Inizio Fine Peso Trasformazione ; Nota : Le parti in rosso dipendono dallo specifico problema Infine per velocizzare il confronto abbiamo scritto anche uno script AMPL (il file DNA.RUN) che si occupa di lanciare i risolutori e formattare l output. 4

5 - Analisi dei risultati. Non avendo a disposizione dati reali e pensando di applicare il modello a problemi pratici abbiamo creato un programma in Java che genera sequenze casuali di file.dna (quelli che contengono le sequenze da confrontare). Il programma funziona a riga di comando, un esempio di come utilizzarlo è il seguente : [prompt] Java RndDna <nome_file> <lunghezza sequenza> Una volta lanciato questo programma genera una sequenza casuale di basi azotate e la memorizza nel file nomefile.dna con la lunghezza specificati nella riga di comando. Esempio : [prompt] Java RndDna Prova 10 Questo comando genera il file Prova.DNA contenente una sequenza di lunghezza 10. Dalle prove effettuate e risultato che il modello non soffre particolarmente per l estensione dell insieme dei dati; abbiamo provato con sequenze di lunghezza superiori a 100 e il risultato e stato ottenuto dopo pochi minuti. Questo e particolarmente importante per l applicazione pratica del modello. Le dimensioni del modello crescono con la lunghezza delle sequenze, in particolare il grafo presenta sempre un numero di nodi pari a (n1+1)*(n2+1). L ordine computazionale del problema risulta quindi o(n1*n2). I risultati vengono memorizzati in un file DNA.out in cui sono memorizzate le seguenti informazioni: Path della sequenza di partenza. Path della sequenza di destinazione. Lunghezze delle due sequenze. Costi associati alle trasformazioni tra basi. Costo minimo. Percorso del cammino di costo minimo. Numero di cancellazioni, inserimenti e trasformazioni relative al cammino di costo minimo. Costo massimo. Percorso del cammino di costo massimo. Numero di cancellazioni, inserimenti e trasformazioni relative al cammino di costo massimo. Abbiamo deciso di inserire le informazioni relative ai path e alla lunghezza delle sequenze, nonché i costi associati alle trasformazioni, in modo da poter immediatamente capire a quale confronto sono riferiti i dati di output. Analizziamo alcuni casi che si possono presentare: Il caso di due sequenze uguali da come risultato un costo minimo pari a zero solo nella condizione in cui i costi relativi alle trasformazioni tra basi uguali siano stati posti uguali a zero. Infatti in questo caso il grafo ha una forma quadrata ( riferendoci alla fig 2 i=j ). Nelle condizioni esposte i costi lungo la diagonale principale del grafo sono tutti nulli, e la sequenza finale e ottenuta da quella iniziale per trasformazioni tra basi azotate uguali ( come ad esempio una trasformazione da A a A ). Nel caso la matrice dei pesi associata alle trasformazioni delle basi sia simmetrica e il costo delle cancellazioni sia uguale a quello degli inserimenti, si ottengono due cammini equivalenti di costo minimo ( massimo ). Inoltre nel caso in cui le due sequenze abbiano la stessa lunghezza, cioè si ottiene un grafo di forma quadrata, l ipotesi di uguaglianza tra il costo di cancellazione e inserimento diventa ridondante e i due cammini oltre ad essere equivalenti sono anche simmetrici rispetto alla diagonale principale del grafo. - Conclusioni Abbiamo testato il modello su una Sun Workstation Ultra 1 con il risolutore Cplex versione 4.0 confrontando 2 sequenze lunghe cento, con poco meno di iterazioni abbiamo ottenuto il costo minimo, altrettante iterazioni sono state necessarie per ottenere il costo massimo. Per quanto riguarda il tempo impiegato per questo confronto e stato necessario meno di un minuto, questo ci fa pensare che il modello possa avere grosse capacita risolutive anche su casi reali. 5