Reversione del fenotipo glicolitico mediante terapie a bersaglio molecolare

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1 XII CONGRESSO NAZIONALE AIMN 2015 Rimini aprile Reversione del fenotipo glicolitico mediante terapie a bersaglio molecolare S. Del Vecchio Dipartimento di Scienze Biomediche Avanzate Università degli Studi di Napoli Federico II

2 Metabolismo del glucosio Nature Reviews Cancer 2004, 4: 891

3 Glicolisi e respirazione cellulare sono vie alternative del consumo di glucosio nelle cellule normali La glicolisi viene inibita in presenza di ossigeno che permette ai mitocondri di ossidare il piruvato a CO2 e H2O Nei lieviti che sono organismi facoltativamente anaerobi il consumo di glucosio e ridotto in presenza di O2 (Effetto Pasteur) Ma non nelle cellule neoplastiche Le cellule maligne derivate da tumori umani se messe in coltura in presenza di ossigeno mantengono il loro fenotipo di esaltata glicolisi

4 Effetto Warburg o glicolisi aerobica Le cellule tumorali hanno un elevato consumo di glucosio attraverso la glicolisi con conseguente produzione di acido lattico anche in presenza di ossigeno Le cellule neoplastiche sono strettamente dipendenti dall apporto esterno di glucosio perché il metabolismo energetico attraverso la glicolisi è altamente inefficiente (solo 2 molecole di ATP contro le 36 del ciclo di Krebs) Il fenotipo glicolitico delle cellule tumorali non è adattativo ma costitutivo

5 Acquisizione del fenotipo glicolitico costitutivo L attivazione di alcuni oncogeni, la perdita di funzione di alcuni geni oncosoppressori o la stabilizzazione costitutiva di HIF possono causare: una iperespressione di GLUT o una traslocazione dei GLUT sulla membrana plasmatica una aumentata attività o espressione di enzimi glicolitici in particolare delle esochinasi oppure una riduzione della funzione mitocondriale e quindi della respirazione cellulare

6 Glucose metabolism in cancer Red : oncogenes Green :tumor suppressors Cantor JR Cancer Discovery 2012,2:881

7 Cellule con EGFR wild type PP Cellule con mutazione attivante EGFR P P P P P P

8 Metabolismo del glucosio e cancro La trasformazione neoplastica innescata da mutazioni attivanti del EGFR comporta, oltre che una proliferazione cellulare incontrollata, una riprogrammazione del metabolismo del glucosio Vander Heiden MG et al., Science 324: , 2009

9 Ipotesi di lavoro L inibizione di EGFR mutato determina la reversione del fenotipo glicolitico e la riattivazione della respirazione ossidativa nelle cellule trasformate

10 Glycolytic pathway Proteins of interest GLUT1 and GLUT3 HK1 and HK2 PKM1 and PKM2 OXPHOS: subunits of mitochondrial complexes (IV) Substrate Glucose 18FFluorodeoxyglucose Biochemical end points ATP ATP Lactate

11 Nonsmall cell lung cancer cell lines H1975 cells H1993 cells EGFR EGFR kinase domain L858R (exon 21) kinase domain TKIs T790M (exon20) TKIs T790Mmediated resistance MET METmediated resistance

12 Efficient and inefficient inhibition of EGFR signaling Cell line Inefficient treatment Efficient treatment H1975 Erlotinib WZ4002 H1993 Erlotinib METinhibitors: PHA 665,752 crizotinib

13 Sensitivity of NSCLC cells to WZ4002 and PHA665,752 H1993 H1975 Erlotinib 1 µm WZ µm WZ µm Erlotinib 1 µm 1 µm PHA665,752 pmet MET pegfr EGFR pakt AKT perk 1/2 ERK 1/2 Cyclin D1 actin WZ4002 caused a concomitant decrease of pegfr, pakt, perk and cyclin D1 levels In addition H1993 cells showed a pmet and pegfr decrease after treated with PHA665,772 and erlotinib, respectively

14 Levels of proteins involved in glycolysis in response to treatment Erlotinib 1 µm WZ µm WZ µm PHA665,752 1 µm H1975 NT erlotinib WZ µm WZ µm PHA665,772 1 µm H1993 GLUT 1 GLUT 3 HK 1 HK 2 % 18FFDG uptake over ctrl 48h 18FFDG uptake and residual glucose in media in untreated and treated cell lines * * H1975 H1993 PKM1 ppkm2 Decrease after treatment with efficient inhibitors of expression of HK2 and phosphopkm2 (Tyr 105) 300 *** *** H1975 µg Glucose/106 cells actin µg Glucose/106 cells PKM2 350 *** ** H1993

15 Expression of mitochondrial complexes and ATP/lactate ratio Erlotinib 1 µm WZ µm WZ µm PHA665,752 1 µm H1975 H1993 (ATP5A) V (UQCRC2) III (SDHB) II (COXII) IV (NDUFB8) I actin strong upregulation of several subunits of mitochondrial complexes involved in oxidative phosphorylation after ATP/lactate ratio per 106 cells 48 h NT erlotinib WZ µm WZ µm PHA665,772 1 µm ** ** ** ** H1975 H1993 inverse relationship between intracellular ATP and lactate levels in both cell lines

16 Suppression of HK2 and PKM2 expression by targeted sirna transfection

17 Inibizione differenziale dei pathways a valle del recettore EGFR mutato delezione esone 19 T790M PP RAS PI3K BRAF AKT MEK mtor U0126 ERK Wortmannin

18 Inibizione differenziale dei pathways a valle del recettore AKT inhibition ERK1/2 inhibition

19 Inibizione differenziale dei pathways a valle del recettore EGFR mutato delezione esone 19 T790M PP RAS PI3K BRAF AKT MEK mtor U0126 ERK Wortmannin

20 Cosa succede quando inibiamo EGFR Cellule tumorali con EGFR attivo Cellule tumorali con EGFR inibito Glucosio Glucosio HKII HKII Glicolisi ADP ATP Biosintesi di macromolecole PEP Biosintesi di macromolecole PEP PKM2 fosforilazione in Tyr105 (bassa attività) Piruvato Lattato Glicolisi ADP ATP PKM2 (alta attività) Piruvato OXPHOS OXPHOS

21 Animal tumor model s.c. injection of female BALB/c (nu/nu) mice 7.4 MBq of 18FFDG through the tail vein and were subjected to micropet/ct 1 h postinjection basal: 18FFDG PET/CT H1975 & H1993 cells 3 days: 18FFDG PET/CT Ex vivo tumor analysis tumor growth (~0.8 cm) 50 mg/kg/d p.o. for 3 days Erlotinib, WZ4002, Crizotinib

22 18FFDG PET/CT studies performed in nude mice bearing H1975 xenografts before and after 3 days of treatment Untreated Erlotinib 50 mg /kg EGFR inefficient inhibition Untreated WZ mg /kg EGFR efficient inhibition

23 Glycolytic pathway and mitochondrial complexes expression in surgically removed H1975 and H1993 xenografts 3 days H1993 H1975 Erlotinib 50 mg/kg WZ mg/kg Crizotinib 50 mg/kg HK2 ppkm2 PKM2 (ATP5A) V (UQCRC2) III (SDHB) II (COXII) IV (NDUFB8) I actin In agreement with in vitro findings, a dramatic reduction of HK2 and ppkm2 levels was found along with a strong upregulation of mitochondrial complexes IIV in samples from animals treated with WZ4002 and crizotinib

24 FDGPET/CT before and 1 week after erlotinib treatment in NSCLC Baseline SUVmax week University of Naples, Italy SUVmax 4.2

25 FDGPET/CT before and after erlotinib treatment in a nonresponding metastatic lung cancer patient Baseline University of Naples, Italy 1 week

26 Conclusioni L inibizione di EGFR mutato nel NSCLC determina una reversione del fenotipo glicolitico e una riattivazione della respirazione ossidativa La riattivazione della respirazione ossidativa implica una migliore risposta a chemio e radioterapia

27 18FFDG 18FFDG can correctly detect T790Mmediated resistance and its reversal by third generation TKIs early in the course of treatment 18FFDG cannot accurately detect METmediated resistance and its reversal by MET inhibitors early in the course of treatment Unchanged or increasing FDG uptake after therapy is a reliable and suitable index of nonresponse

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