Cellule staminali. Cellule primarie. Self-renewal: si rinnovano per divisione cellulare

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1 Cellule staminali Cellule primarie Self-renewal: si rinnovano per divisione cellulare Unlimeted potency: si differenziano in qualunque tipo cellulare specializzato Cellule staminali embrionali Blastocisti Cellule staminali adulte Cordone ombelicale, midollo osseo

2 Cellule staminali Totipotenti: morula Possono formare i tessuti Embrionali e extraembrionali Multipotenti: blastocisti Possono formare i tessuti embrionali Multipotenti:adulte Producono cellule di una famiglia Correlata. Ex: ematopoietiche Unipotenti: adulte producono un solo tipo cellulare

3 Le cellule staminali embrionali (ES) di topo presentano il vantaggio di poter essere mantenute in coltura e la totipotenza preservata grazie alla presenza, nel mezzo di coltura, del fattore LIF (Leukemia Inhibitor Factor). In queste condizioni le cellule ES possono essere manipolate geneticamente e, grazie alla ricombinazione omologa, un frammento di DNA esogeno può essere integrato in un preciso sito del genoma (Jasin et al., 1996).

4 Transgenesi intervento sperimentale volontario di inserimento di un gene esogeno nel genoma di una specie animale o vegetale. Knock in Il gene può appartenere alla stessa specie o può derivare da specie differenti. quando il gene esterno è: integrato nel suo genoma; Organismo transgenico espresso correttamente (in genere si usa un gene che codifica una data proteina) e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale; integrato nella linea germinale e per conseguenza trasmissibile dall animale fondatore alla progenie.

5 Jaenisch 1974: topi mutanti, frammenti di DNA di SV40 iniettati nella cavità celomatica di blastocisti murina mantenuti nel topo adulto. Gordon e Ruddle 1980: topi transgenici. Questi ricercatori sono stati i primi a mettere a punto la tecnica di microiniezione del DNA ricombinante all'interno dello zigote (ovulo fertilizzato ) e a dimostrare la trasmissione del transgene alla progenie da parte degli animali ottenuti con questa tecnica. Palmiter e Brinster nel 1982: ceppo di topi transgenici ottenuti microiniettando il gene dell ormone della crescita umano. Questo esperimento ha prodotto un ceppo di topi molto più grandi dei loro omologhi non transgenici, dimostrando che era possibile modificare non solo il genotipo ma anche il fenotipo degli animali mutati.

6 Metodi per ottenere un animale transgenico Microiniezione del DNA nell ovocita fertilizzato Microiniezione di cellule staminali nell ovocita fertilizzato Nuclear Transfer di cellule staminali trasformate in vitro Mediata da retrovirus Mediata da spermatozoi

7 Microiniezione del DNA nell ovocita fertilizzato Prelievo dopo 15-20h dalla fecondazione degli zigoti dalla femmina e microiniezione del DNA nel pro-nucleo maschile Impianto dopo 24h di coltura in una pseudo-madre Analisi sui nati a 3 settimane su DNA estratto dalla coda Efficienza del 10% Ricombinazione casuale, raramente omologa Pronucleo femminile Pronucleo maschile Ovulo fertilizzato Pipetta di fissaggio Transgene Pipetta di iniezione Femmina che ha subito l impianto Fondatore transgenico

8 Microiniezione di cellule staminali nell ovocita fecondato coltura Cellule ES Blastocisti donatrice Massa cellulare interna Cellule staminali da blastocisiti transfettate con il transgene associato a resistenza antibiotica Transfezione Dopo selezione trasferite in blastocisti riceventi Arricchimento in cellule transfettate Impianto in madri pseudogravide Microiniezione nella blastocisti Transgene Blastocisti ricevente Progenie mosaico (chimere) Selezione del fondatore transgenico Impianto Ricombinazione omologa Fondatore transgenico

9 Selezione delle cellule staminali transgeniche Ricombinazione omologa HB1 Neor TG HB1 TG HB2 HB2 TK transgene Neor :Resistenza al G418 TK :sensibilità al gancyclovir cromosoma ricombinazione omologa HB1 Neor TG HB2 cromosoma Le cellule sono selezionate in positivo con il G418 e non avendo il gene per la TK sono resistenti al Gancyclovir

10 Selezione delle cellule staminali transgeniche Ricombinazione eterologa HB1 Neo r HB1 TG HB2 TK TG HB2 X transgene Neor :Resistenza al G418 TK :sensibilità al gancyclovir cromosoma ricombinazione eterologa HB1 Neor TG HB2 X TK cromosoma Le cellule sono selezionate in positivo con il G418, ma negativamente per la presenza della timidina chinasi

11 X, gene normale X*, transgene Topo marrone Colore marrone A/A ES ricombinanti Topo nero Colore nero a/a Impianto delle ES Progenie chimerica: Possibili gameti: A/X A/X* a/x Incrocio di un topo chimerico con un topo nero, a/a, X/X Si originano topi neri e topi marroni Analisi dei topi marroni per individuare gli eterozigoti Incrocio tra eterozigoti per ottenere omozigoti A/A, X/X* x A/A, X/X*

12 Nuclear transfer di cellule trasformate in vitro Clonazione Cellule staminale trasfettate e selezionte ICM Trasfezione Neo introne esone Nuclei delle cellule microiniettati in un ovocita Anucleato Ovulo enucleazione Embrione impiantato nella pseudo-madre Nati tutti transgenici Selezione cellule Nuclei purificati nucleo Efficienza bassa 1/centinaia Fusione attivazione Coltura embrione in vitro Impianto Topo transgenico

13 Transgenesi mediata da retrovirus Embrioni prelevati a 4-8 cellule Infezione con un retrovirus reso non patogeno con alcune parti sostituite con il gene di interesse Impianto nella pseudo-madre Alto numero di nati a mosaico Possibili danni associati al retrovirus

14 Transgenesi mediata da spermatozoi Interazione spontanea DNA/spermatozoo Fecondazione Selezione della prole sulla analisi del DNA prelevato da coda o orecchio

15 Knock out Studiare la funzione di un gene e della sua proteina Riprodurre in un modello animale uno stato di malattia Eliminazione di un gene o delezione di 1 o + esoni Eliminazione di una proteina o di un dominio funzionale Gene targenting Ricombinazione omologa Topo Knock out Produzione di una proteina mutata Espressione della proteina abolita

16 Targeting genico Topo Vettore contenente il transgene e i marker Cellule staminali Ricombinazione omologa: Il DNA da inserire contiene parecchie kbasi omologhe al genoma di topo In lievito la ricombinazione omologa avviene nel corretto locus con frequenza molto alta Nei mammiferi la ricombinazione omologa nel corretto locus avviene con frequenza molto bassa. Southern blot e PCR per lo screening dei cloni.

17 Knock-out convenzionale Ricombinazione omologa nelle cellule staminali embrionali. (topo marrone) Selezione con G418 e gancyclovir Iniezione delle cellule transgeniche in una blastocisiti e impianto in una madre pseudogravida. (topo nero) Progenie chimerica Incrocio di eterozigoti per ottenere omozigote

18 Knock-out e ricerca di base Knock-out con fenotipo normale: ipotesi che altre proteine compensino la perdita della proteina abolita Knock-out con fenotipo inducibile da stress:la funzione genica è associata alla comparsa di stress ambientali o a eventi patologici. Ex: knock-out per il recettore dell interferone I da fenotipo normale, ma mostra aumentata suscettibilità alle infezioni virali rispetto ai controlli. Knock-out con fenotipo letale: geni necessari per lo sviluppo embrionale che non consentono di ottenere topi adulti

19 Knock-out condizionale Transgenesi in cui il knock out di un gene può essere controllato temporalmente e spazialmente Transgenesi binaria: transgene effettore e transgene target. Il transgene effettore non influisce sull espressione dei geni endogeni in quanto agisce solo sul transgene target Fase 1 Costruzione di knock in per il transgene target (espresso corret tamente sino all excisione) Fase 2 Costruzione di knock in per il transgene effettore Fase 3 Incrocio tra i due knock in per ottenere il knock out condizionale

20 2 tipi di transgenesi binaria 1, effettore:fattore di trascrizione Il costrutto del transgene effettore è costituito da un promotore tessuto specifico (TSP) che regola la produzione di una proteina chimerica costituita dal repressore della Tetraciclina di E. coli (tetr) e dal dominio di transattivazione di VP16 (herpes simplex). Questa proteina tta ha due domini uno lega la tetraciclina, l altro una sequenza di 19bp nell operone per la tetraciclina nel transgene attivandolo.

21 Effettore inducibile Tet-off: Il transattivatore regolato dalla tetraciclina (tta) non può legare il DNA quando è presente l induttore hcmv1e1: TSP, attivo in numerosi tessuti Tet-on: nel sistema inverso (rtta) tta lega il DNA solo quando è presente l induttore. L induttore utilizzato è la doxiciclina (Dox), analogo della tetraciclina, attiva rtta e inattiva tta in maniera efficiente a dosi al di sotto dei livelli citotossici. Poiché la Dox può attraversare la placenta nel topo transgenico e regolare efficientemente l espressione genica durante l embriogenesi, questi sistemi vengono impiegati per evitare l espressione di un transgene letale nell embrione. EFFETTO REVERSIBILE

22 2, effettore: ricombinasi Ricombinasi Cre e Flp: enzimi che fanno parte della famiglia delle integrasi ricombinasi sito specifiche. La ricombinasi Cre è presente in natura nel batteriofago P1 ed ha un ruolo nel ciclo lisogenico, in quanto serve per l integrazione del genoma fagico in quello batterico. La ricombinasi Flp deriva dal lievito Saccharomyces cerevisiae. Le due ricombinasi sono in grado di riconoscere specifiche sequenze di DNA chiamate rispettivamente sito loxp e sito FRT. Filamenti di DNA fiancheggiati da una coppia di tale siti vengono definiti floxed o fliped. I siti loxp e FRT sono costituiti da due distinte sequenze palindromiche di 13 nucleotidi ciascuna interrotte da una sequenza asimmetrica di 8 nucleotidi detta spacer che conferisce direzionalità al sito.

23 In base alla direzione ed alla posizione dei siti loxp oppure FRT su un filamento di DNA la ricombinasi Cre oppure Flp è in grado di catalizzare reazioni irreversibili di tre diversi tipi: Inversione:i siti loxp/frt si trovano sullo stesso filamento di DNA ed hanno direzioni opposte. Traslocazione: i siti loxp/frt si trovano su due filamenti diversi di DNA. Excisione: i siti loxp/frt si trovano sullo stesso filamento ed hanno la stessa direzione. EFFETTO IRREVERSIBILE

24 Analisi di lineage cellulare La cre o la FLP sono regolate da un promotore tessuto specifico Il gene reporter è preceduto da uno STOP fiancheggiato da 2 siti lox o FRT se il TSP non è attivato non si ha espressione del reporter se il TSP è espresso si ha excisione dello STOP e espres sione del reporter l irreversibilità della ricombinasi fa sì che il transgene si esprima nelle cellule figlie dove il TSP non è più attivo

25 Target Reporter: GFP, LacZ TSP: promotore tessuto Specifico Target UP: promotore ubiquitario Target

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27 Verifiche per la corretta espressione dei transgeni Effetti di posizione nella linea che esprime la ricombinasi Cre/FLP Inserzione di più copie del transgene floxato/flippato nel genoma: possibili instabilità cromosomiche, aneuploidia. Importante: disponibilità di elementi regolatori della trascrizione che siano in grado di attivare l espressione della ricombinasi cre in tutta una gamma di tessuti e a stadi diversi dello sviluppo. Attivazione temporale e spaziale dell espressione della ricombinasi Cre Utilizzo di vettori, cromosomi artificiali: Derivazione da lievito: YAC si propagano in lievito contengono alcune Mbasi Derivazione da fago P1: PAC si propagano in E. coli contengono sino a 300Kbasi Derivazione da batteri: BAC si propagano in E. coli contengono sino a 300kbasi

28 Molti geni sono essenziali per la vita, lo sviluppo, la fertilità del topo. Il knock-out tradizionale di tali geni non consente la creazione di un topo knock-out Knock-out condizionale Tecnologia Cre/lox

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31 Pharming Utilizzo di animali per la produzione di farmaci e sostanze utili all uomo Nonostamte sia difficile e costoso i benefici possono essere potenzialmente elevati Biotech company: soldi e aumento vendite Persone ordinarie: riduzione del costo dei farmaci Sostituisce produzione di farmaci in E. coli, lievito, cellule animali: Monitoraggio e campionamento continuo Espansione e strumentazione nuova Modificazione di proteine permesse solo da cellule di mammifero Animali come bioreattori

32 Transgenesi utilizzata nella produzione di animali bioreattori Espressione sperimentale di geni umani in mammiferi: OVINI CAPRINI BOVINI SUINI CONIGLI LATTE (caratteristiche migliori per estrazione) SANGUE TESSUTI Previsto uso di somatotropina bovina per aumentare la produzione nei Paesi estra UE. In Europa i trattamenti ormonali sugli animali sono proibiti. Ex: anti-emorragico antitrombinaiii nella capra (latte) ( farmaco transgenico in commercio) alfa-1 antitripsina per terapia respiratoria nella pecora (latte) proteina C-reattiva nei suini Prove cliniche in corso

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34 Microiniezione nel pronucleo EX: espressione di un fattore di coagulazione nel latte vaccino Il gene per il fattore è fuso a un promotore per una proteina del latte Assicura che li transgene sia espresso solo nel latte Molte copie di DNA sono microiniettate nel pronucleo maschile di un uovo fecon dato Impianto in una pseudo madre La microiniezione nel pronucleo ha effi cenza molto bassa (1 5 transgenici su 100 nati)

35 Nuclear transfer clonazione Trasfezione di cellule adulte con il transgene e un gene per selezione antibiotica Selezione delle cellule resistenti Il nucleo di tali cellule è trasferito in uovo in cui è stato rimosso il proprio nucleo Impianto Poiché tutti gli ovuli contengono il DNA transgenico, il 100% degli animali è transgenico Ri-differenziamento delle cellule adulte

36 Aspetti negativi della clonazione Integrazione del transgene nel genoma è: rara casuale:può inserirsi in regioni che possono essere deleterie per il gene stesso o per il gene in cui si inserisce molti animali nascono con difetti: sotto- sovra-peso, organi interni sottosviluppati o deformati nessuna garanzia che i nati transgenici siano sani, esprimano il transgene in grande quantità e nel tessuto giusto

37 Percentuali di successi di clonazioni in diversi animali Utilizzate cellule adulte Specie s Number of oocytes used Number of live offspring Notes Mouse (1.3%) - Bovine (1.4%) 2 died Sheep (3.4%) 11 died within 6 months Pig (0.5%) - Goat (1.1%) - Yanagimachi, R "Cloning: experience from the mouse and other animals." Molecular and Cellular Endocrinology. 21 March, 187.

38 Mammal Cloning Timeline 1984 A live lamb was cloned from sheep embryo cells Megan and Morag 1986 Early embryo cells were used to clone a cow 1993 Calves were produced by transfer of nuclei from cultured embryonic cells 1995 Two sheep, named Megan & Morag, were cloned using embryo cells Dolly 1996 Birth of Dolly, the first organism to be cloned from a fully differentiated adult cell 1997 Transgenic sheep named Polly was cloned containing a human gene WORLD/europe/08/06/clo ne.critics/index.html From: student presentation Aman Arya, Nancy Chen, Dan Perz, Dave Reichert, Ronnie Wong

39 Tetra mice were cloned in three generations from a single mouse calves were cloned from a single adult cow, but only 4 survived to their first birthday 1999 A female rhesus monkey named Tetra was cloned by splitting early embryo cells Pigs and goats reported cloned from adult cells 2002 Rabbits and a kitten reported cloned from adult cells spva/academic/science/ Thinkquest/gail/text/bene fits.html

40 Dolly with her surrogate mother Dolly Born in July 1996 at the Roslin Institute in Scotland First mammal to be cloned from an adult mammal using the nuclear transfer technique Dolly with her first newborn, Bonnie 277 attempts were made before the experiment was successful Dolly died in February 14, 2003 of progressive lung disease at the age of 6; whereas normal sheep can live up to 12 years of age.

41 Mammal Cloning allows propagation of endangered species fworks.com/cloning.htm/printable January 8, 2001 Noah, a baby bull gaur, became the first clone of an endangered animal.

42 Xenotrapianti Utilizzo di animali transgenici come donatori di organi per trapianti umani Tentativi con scarso successo con cuore, fegato e reni dei primati Possibile utilizzo degli organi dei suini: dimensioni organi simili a quelli dell uomo creazione di transgeni che aboliscano il rigetto iperacuto e tardivo (knock out dei geni per molecole di superficie cellulari riconosciute come estranee) creazione di transgeni che eliminino il rigetto T mediato Rischio: Nel maiale sono presenti i retrovirus (PERV, porcine endogenous retrovirus) e i retrotrasposoni. Elementi genetici mobili, che costituiscono quasi il 50% del genoma dei mammiferi Possono staccarsi da un distretto e introdursi in altre zone del genoma con azione mutagena. Tali elemanti si sono introdotti durante l evoluzione e sono in equilibrio che evita Danni genetici. In caso di xenotrapianto si potrebbe perdere questo equilibrio Dimostrato il passaggio di retrovirus endogeni di maiale in cellule umane coltivate

43 Terapia genica La terapia genica è quell'intervento tendente a modificare localmente la condizione del fenotipo, alterato da una mutazione, attraverso la sostituzione funzionale del gene alterato col corrispondente gene sano. Interessa solo la linea somatica

44 Terapia genica SCID: severe combined immunodeficiency, causata da mutazioni nella proteina γ dei recettori per alcune IL necessarie per lo sviluppo dei linfociti B e T. Gli affetti da SCID sono privi di un sistema immunitario funzionante. Il gene γil è sul cromosoma X, quindi in maschi con la mutazione sono affetti, le femmine eterozigoti per la mutazione sono sane ma portatrici Affetto da SCID Vissuto in bolla di plastica in condizioni sterili. Nel 1980 gli viene trapiantato il midollo osseo, donatrice la sorella. Dopo mesi insorgono complicanze, febbre, vomito e diarrea. È costretto a uscire dalla bolla. Nel 1984 muore in seguito a molteplici tumori insorti a causa della presenza di Epstein Bar virus non segnalato nel midollo della sorella Il ragazzo della bolla di plastica. David Phillip Vetter September 21, 1971 February 22, 1984

45 1990: primo caso di cura di SCID con terpaia genica su di una bambina di 4 anni. Le cellule del sangue messe in coltura e transfettate con il gene corretto e reinfuse nella paziente Da allora pochi i tentativi con successo dal punto di vista clinico. Le numerose ricerche sono ancora volte alla messa a punto di sistemi efficienti e sicuri di terapia

46 In vivo: Viene attuata in tutti quei casi in cui le cellule non possono essere messe in cultura o prelevate o reinfuse come quelle del cervello o del cuore e della maggior parte degli organi interni. In questo caso il gene d interesse viene inserito, tramite un opportuno vettore, nell organismo direttamente per via locale o sistemica. Ex vivo: In generale, il protocollo adottato nella terapia genica consiste nel prelevare le cellule di interesse dal paziente, a metterle in coltura e a transfettarle o infettarle con un virus ingegnerizzato con il costrutto contenente il gene normale; Tale procedura è sicuramente la più lunga e la più costosa delle due ma permette di selezionare ed amplificare le cellule d interesse ed inoltre gode d una maggior efficienza. E attualmente la modalità più utilizzata ma è riservata solamente a quei casi in cui sia possibile prelevare, mettere le cellule in cultura e reinserirle nell'organismo

47 Metodologie del trasferimento del DNA Non virali: Microiniezione in singole cellule del DNA nudo Liposomi, vescicole sferiche cationiche legano il DNA che a ph neutro è negativo. 0,1% del DNA introdotto è espresso Polimeri cationici, azione simile a quella dei liposomi Gene gun, inviano nella cellula particelle microscopiche d oro o di tungsteno ricoperte da DNA (al momento non esistono studi sull uomo, ma solo su animali) Virali: Retrovirus, lentivirus, Adenovirus, herpesvirus attenuati

48 Virali: Retrovirus: hanno la capacità di integrare il loro DNA all interno dei cromosomi delle cellule bersaglio determinando l inserimento stabile del gene nei cromosomi della cellule infettata e il suo trasferimento a tutte le cellule figlie; i retrovirus infettano solo cellule che stanno proliferando; Lentivirus, come l'hiv: che permettono di trasferire materiale genetico anche in cellule che non proliferano, come le cellule "mature" (es. neuroni, cellule del fegato ) o in cellule particolarmente refrattarie ai retrovirus (es. cellule staminali prelevate del midollo osseo); Virus adenoassociati che integrano il loro DNA nei cromosomi della cellula ospite come i retrovirus, ma hanno rispetto a questi il vantaggio di essere per natura innocui; difficilmente trasportano geni di grandi dimensioni. Adenovirus:che non si integrano nei cromosomi della cellula ospite, ma possono trasportare geni di grosse dimensioni; tuttavia la loro espressione non dura nel tempo. Virus dell herpes simplex infettano soltanto alcuni tipi di cellule, in particolare i neuroni e sono quindi indicati per la terapia di patologie neurologiche.

49 I limiti della terapia genica La sicurezza della procedura Questo è un problema particolarmente evidente per i vettori virali. Alcuni di questi derivano infatti da virus pericolosi, come l HIV. E quindi necessario che prima dell utilizzo questi vettori siano privati della virulenza originaria del virus e mantengano invece inalterata la capacità di infettare le cellule bersaglio. Efficienza di trasferimento Negli studi sulla terapia genica, la maggior parte degli sforzi si concentra oggi sulla ricerca di vettori in grado di trasferire il DNA in modo efficiente e di inserirlo stabilmente nelle cellule. Selettività del bersaglio In questi ultimi anni sono stati messi a punto una varietà di vettori, alcuni dei quali in grado di fare esprimere il gene estraneo in uno specifico tipo cellulare (come i globuli bianchi, le cellule del muscolo, delle vie respiratorie ecc ).

50 Durata dell espressione del gene trasferito La terapia genica risulta praticamente inutile se l espressione del gene "estraneo" non viene mantenuta per un tempo sufficiente. Le ricerche mirano a sviluppare sistemi che permettono un espressione duratura, in modo da sottoporre il paziente ad un unico trattamento, o al limite a trattamenti ripetuti a distanza di qualche anno. La reazione immunitaria Come ogni altra sostanza estranea, il prodotto del gene nuovo, il gene stesso e soprattutto il vettore possono scatenare una risposta immunitaria da parte dell organismo ospite. Questa può portare all eliminazione delle cellule modificate geneticamente, o all inattivazione della proteina prodotta dal nuovo gene, annullando quindi tutti gli effetti della terapia. Nello sviluppo delle nuove strategie di terapia genica si cerca di evitare per quanto possibile che il vettore o il gene estraneo producano una reazione immunitaria.

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53 Nel 1989 è stata approvata la prima sperimentazione sull uomo di un protocollo di terapia genica. Da allora, di più di mille protocolli sono stati approvati in tutto il mondo; di questi alcuni si sono conclusi, altri sono in corso. Più del 90% delle sperimentazioni sono in fasi molto precoci del protocollo (fase I o II) (vedi figura1). Queste fasi iniziali permettono di valutare l eventuale tossicità del trattamento, l efficacia del trasferimento genico e l espressione a breve/medio termine del materiale genetico introdotto. E nelle fasi successive (dalla III) che si valuta invece in modo più approfondito la reale efficacia del trattamento in funzione della cura. Ad oggi, la FDA americana (Food and Drug Administration), l ente governativo cui spetta l approvazione di nuovi trattamenti terapeutici affinché possano essere introdotti nella pratica medica corrente, non ha autorizzato la commercializzazione di nessun prodotto di terapia genica. Dal 1998 al 2005

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