INDAGINE SUL COMPORTAMENTO DI GERMI POTEN- ZIALMENTE PATOGENI NELLA TECNOLOGIA DEL FORMAGGIO PARMIGIANO-REGGIANO

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1 SCIENZA E TECNICA LATTIERO-CASEARIA, 52 (1), INDAGINE SUL COMPORTAMENTO DI GERMI POTEN- ZIALMENTE PATOGENI NELLA TECNOLOGIA DEL FORMAGGIO PARMIGIANO-REGGIANO G Panari 1*, S Perini 2, R Guidetti 1, M Pecorari 1, G Merialdi 2, A Albertini 3 INTRODUZIONE Le peculiarità del Parmigiano-Reggiano e le sue caratteristiche di pregio sono connesse al rispetto di usi locali e ad una tecnologia di produzione che si è sviluppata e consolidata nel corso dei secoli. Tra i fattori in gioco un ruolo determinante è rappresentato dall uso del latte crudo, conferito ai caseifici due volte al giorno immediatamente dopo la mungitura, come dimostrano le ricerche sulla microbiologia del Parmigiano-Reggiano nel corso della maturazione e, più in generale, l ampia bibliografia sul significato della flora nativa del latte in relazione alle caratteristiche qualitative del formaggio [1]. L uso del latte crudo, diffuso soprattutto nelle produzioni casearie tradizionali, continua a sollevare interrogativi in merito alla sicurezza igienica dei formaggi ottenuti. In realtà, il Parmigiano-Reggiano non è mai stato all origine di tossinfezioni alimentari e le analisi eseguite per verificare la presenza di germi patogeni nel corso della maturazione portano a concludere che questo formaggio presenta caratteristiche igienico-sanitarie eccellenti che lo rendono alimento del tutto innocuo [2]. Tuttavia non sono mai state eseguite ricerche specifiche volte a valutare il comportamento dei germi patogeni presenti nel latte crudo e la loro eventuale sopravvivenza nel corso della lavorazione. In letteratura sono riportate ricerche su altri formaggi [3] ma i dati sono a volte contraddittori e la possibilità di trasferire i risultati ottenuti alla realtà produttiva del Parmigiano-Reggiano non è corretta sul piano metodologico. Al fine di verificare nella tecnologia del Parmigiano-Reggiano l eventuale sopravvivenza di germi potenzialmente pericolosi per la salute sono state prodotte forme di formaggio con latte inoculato di colture di * Corrispondenza ed estratti: labo@parmigiano-reggiano.it 1 Consorzio del Formaggio Parmigiano-Reggiano. Via Kennedy 18, Reggio Emilia 2 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia - Sezione di Reggio Emilia 3 A.U.S.L. - Reggio Panari Emilia et al. (2001) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 52 (1),

2 microrganismi patogeni ed è stata studiata l evoluzione di queste contaminazioni artificiali nelle prime fasi del processo. Per la ricerca sono stati adottati questi criteri: a) si è fatto uso dei germi potenzialmente patogeni che più frequentemente sono implicati in casi di tossinfezioni alimentari legate al consumo di formaggio e che sono oggetto di specifiche prescrizioni di legge: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes; b) colture di questi microrganismi sono state aggiunte al latte prima della caseificazione, in modo da ottenere concentrazioni ben superiori a quelle che è possibile riscontrare nel latte crudo; c) le prove sono state effettuate in un caseificio della zona d origine, adottando condizioni di lavorazione identiche a quelle utilizzate nella produzione di Parmigiano-Reggiano [4], in modo da ottenere forme con le stesse caratteristiche e dimensioni di quelle tipiche, onde poter verificare anche il comportamento dei germi patogeni al centro e alla periferia della cagliata. E noto, infatti, che nel ciclo di lavorazione del Parmigiano-Reggiano, dopo l estrazione della cagliata dalla caldaia, si instaura un gradiente di temperatura tra la zona interna e quella esterna che comporta significative differenze nello sviluppo dei batteri lattici e nell andamento della glicolisi [5]. MATERIALI E METODI a) Preparazione delle colture per l inoculazione - Per l esecuzione delle prove sono stati utilizzati i seguenti microrganismi: Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella typhimurium ATCC 6994; Staphylococcus aureus 661 (Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia Romagna); Listeria monocytogenes sierotipo 4b ATCC I ceppi batterici liofilizzati sono stati riattivati attraverso tre passaggi seriali in Trypticase Soy Broth (Oxoid) e successivamente adattati al substrato latte tramite due consecutive subcolture in latte magro sterile. L incubazione dei ceppi è stata condotta in condizioni di aerobiosi ad una temperatura di 37 C mantenendo le colture in agitazione (circa 30 rpm). La coltura aveva una carica microbica tale da dare, una volta inoculata nel latte da caseificare, una concentrazione finale compresa fra 10 4 e 10 6 UFC/ml. b) Caseificazioni sperimentali - Sono state eseguite 4 caseificazioni, una per ciascuno dei germi patogeni presi in considerazione. Per ragioni di sicurezza le caseificazioni sono state effettuate in un caseificio che, al momento della sperimentazione, non era in attività ma era perfettamente funzionante. Il latte (550 kg), ottenuto dalla miscela del latte parzialmente scremato della mungitura della sera e del latte intero della mungitura del mattino, proveniva da un caseificio limitrofo, unitamente al siero innesto usato come starter. Dopo il travaso nella caldaia, il latte è stato scaldato a C e inoculato con una delle colture batteriche preparate. Si è proceduto quindi alla trasformazione del latte, adottando in tutte le fasi 14

3 del ciclo produttivo le tradizionali tecniche di lavorazione. Le forme sono state conservate per 3 giorni e quindi distrutte. c) Prelievo dei campioni - Per verificare la sopravvivenza dei germi usati di volta in volta, è stato eseguito il prelievo dei seguenti campioni: - latte di caldaia dopo l inoculo; - cagliata al momento dell estrazione dalla caldaia; - cagliata durante la formatura, a 12, 24, 48 e 72 ore dalla caseificazione. Per il prelievo della cagliata durante la formatura è stata usata una sonda cilindrica del diametro di un pollice. La sonda attraversava la forma da piatto a piatto e forniva una porzione di pasta di forma cilindrica che veniva tagliata in modo da ottenere due aliquote: una rappresentativa della zona centrale della forma e una rappresentativa della periferia. Al momento dei prelievi eseguiti 12 ore e 24 ore dopo l estrazione sono stati effettuati anche i rilievi del ph e della temperatura alla periferia e al centro della massa, per verificare la corretta acidificazione della pasta. d) Analisi batteriologiche - La numerazione di E. coli e S. aureus è stata condotta sia attraverso piastratura diretta su terreni solidi selettivi, sia tramite tecnica MPN con prearricchimento aspecifico in Trypticase Soy Broth (Oxoid) seguito da un arricchimento selettivo. Per quanto riguarda S. typhimurium e L. monocytogenes sono state utilizzate sia la piastratura diretta, sia una ricerca qualitativa (presenza/assenza) tramite arricchimento selettivo a partire da un campione di 5 g, al fine di ottenere una maggiore sensibilità. La piastratura diretta per E. coli è stata condotta su Escherichia coli Direct Medium supplementato con MUG (Oxoid). La numerazione con tecnica MPN è avvenuta tramite arricchimento selettivo in Sulfate-Triptose- Broth. Quali test di conferma sono stati utilizzati la fluorescenza alla lampada UV e la produzione di indolo. La ricerca di S. aureus è stata eseguita tramite piastratura diretta su Baird Parker Agar (Difco) e metodica MPN, utilizzando Trypticase Soy Broth (Oxoid) addizionato di NaCl (Merck) a1 10%. Le colonie positive sono state confermate tramite colorazione di Gram e test della coagulasi. La determinazione quantitativa di S. typhimurium è stata condotta per piastratura diretta su Hektoen Enteric Agar (Oxoid), mentre la ricerca qualitativa (presenza/assenza in 5 g di campione) è avvenuta tramite prearricchimento in Acqua Triptonata Peptonata e arricchimento selettivo in Selenite Cystine Broth (Oxoid) e Rappaport Broth (Merck), seguito da piastratura su Hektoen Enteric Agar (Oxoid). Le colonie sospette sono state sottoposte a conferma tramite agglutinazione con siero polivalente (Biogenetics) e test biochimici miniaturizzati (API 20E). Per la piastratura diretta di L. monocytogenes è stato utilizzato Oxford Agar (Oxoid). La ricerca del microrganismo su 5 g di campione è avvenuta tramite due arricchimenti selettivi seriali in Listeria Enrichment Broth (Oxoid) seguiti da piastratura su Oxford Agar. I test di conferma utilizzati 15

4 sono stati la verifica dell attività β-emolitica, il test della catalasi, la colorazione di Gram e l attività fermentativa nei confronti di ramnosio e xilosio. Tabella 1 - Parametri di lavorazione relativi alle caseificazioni sperimentali. Table 1 - Data about experimental cheesemaking. RISULTATI E DISCUSSIONE I dati riportati nella tabella 1 mostrano che i parametri di lavorazione utilizzati nelle prove di caseificazione sono uguali a quelli che vengono adottati nei caseifici del comprensorio del Parmigiano-Reggiano. Le differenze rientrano nel campo di variabilità che si riscontra normalmente nell ambito anche di uno stesso caseificio. Il Parmigiano-Reggiano, infatti, viene prodotto con metodi artigianali e le singole lavorazioni non sono mai perfettamente uguali, dal momento che il casaro segue direttamente, con esami visivi e tattili, la coagulazione del latte e la cottura della cagliata in ogni caldaia. Le differenze nella tecnologia di caseificazione si riflettono anche sui valori di ph e della temperatura rilevati sulla cagliata (Tab. 2). I dati, anche in questo caso, rientrano nel campo di variabilità che si osserva normalmente nelle misure eseguite sulle cagliate durante la formatura nelle fascere. Se si esaminano i risultati delle analisi microbiologiche (Tabb. 3 e 4) si osserva un diverso comportamento dei patogeni durante la fase di caseificazione e nel corso delle prime 12 ore di formatura, mentre nei campioni di cagliata prelevati 24 ore dopo l estrazione e successivamente essi risultano sempre assenti. E. coli sembra essere il germe più resistente tra quelli utilizzati. I dati mettono in evidenza un significativo sviluppo, presumibilmente durante le fasi iniziali di riscaldamento del latte e di coagulazione, quando la temperatura è più favorevole per la crescita di questo microrganismo. Nella massa caseosa all estrazione, infatti, E. coli risulta presente a concentrazioni relativamente elevate e viene riscontrato anche nel prelievo successivo, 16

5 Tabella 2 - Valori di temperatura e ph della cagliata durante la formatura di ciascuna prova. Table 2 - Temperature and ph values of the curd during moulding of each trial. benché i valori siano da ritenere trascurabili. Successivamente, a partire da 24 ore, esso risulta sempre assente. S. aureus è ancora presente in misura significativa nella cagliata al termine della giacenza, benché in numero inferiore a quello rilevato nel latte, ma scompare nelle ore successive e non è stato rilevato nel campione di cagliata prelevato a 12 ore e in quelli successivi. Il declino di S. typhimurium e L. monocytogenes durante la lavorazione del latte è risultato più rapido: nella cagliata all estrazione si riscontra un modesto numero di S. typhimurium mentre L. monocytogenes é già assente. Da questi dati emerge che nella tecnologia di produzione del Parmigiano- Reggiano la giacenza della cagliata sotto siero rappresenta già una fase critica per alcune delle specie microbiche esaminate, che scompaiono o si riducono sensibilmente. Questa fase rappresenta un momento essenziale nella tecnologia del Parmigiano-Reggiano, perché al termine della cottura, a differenza di quanto avviene per altri formaggi a pasta dura, in cui la cagliata viene sottoposta alla pressatura, i granuli vengono lasciati 17

6 Tabella 3 - Analisi microbiologiche: campioni prelevati durante le prove di caseificazione. Table 3 - Microbial analysis: samples taken during cheesemakings. sedimentare in fondo alla caldaia, dove si saldano spontaneamente per formare una massa compatta. Questa fase dura da 50 a 60 minuti e, in questo lasso di tempo, la temperatura si mantiene a valori prossimi a quelli di cottura (55 C). Dopo l estrazione della cagliata le condizioni per la sopravvivenza dei germi patogeni diventano ancora più difficili, perché la glicolisi ad opera dei batteri lattici porta ad un forte abbassamento del ph, che arriva in poche ore a valori inferiori a 5,0. L acidificazione è molto rapida in periferia; procede meno velocemente al centro, dove, d altro canto, la temperatura resta a lungo su valori piuttosto elevati, come si osserva anche in tabella 2. Per l effetto congiunto della temperatura e dell abbassamento del ph, 12 ore dopo l estrazione è stata rilevata la presenza di poche colonie soltanto nella prova con E. coli, mentre nelle altre prove i microrganismi inoculati nel latte erano già scomparsi. Le differenti condizioni che si instaurano tra il centro e la periferia della cagliata durante la formatura non influenzano il comportamento dei germi patogeni, per cui si può ritenere che essi scompaiano in modo uniforme in tutta la massa. La differenza riguardante il numero di colonie di E. coli riscontrate al centro e alla periferia della Tabella 4 - Analisi microbiologiche: campioni prelevati dalle cagliate a diversi intervalli di tempo durante la formatura. Table 4 - Microbial analysis: samples taken at different time during moulding from internal (int.) and external (ext.) part of the curd. 18

7 Figura 1 -Rappresentazione grafica dell evoluzione del numero di batteri patogeni nel corso delle caseificazioni. Figure 1 - Evolution of the number of pathogenic bacteria during cheesemakings. cagliata a 12 ore non sembra significativa, in relazione al numero di questi batteri rilevato al momento dell estrazione. I risultati ottenuti, sintetizzati nella figura 1, concordano con quelli di altre ricerche sulla sopravvivenza dei germi patogeni nella tecnologia dei formaggi a pasta cotta. Bachmann et al. [6], studiando il comportamento di diverse specie microbiche potenzialmente patogene, tra cui quelle usate nella presente ricerca, hanno trovato che, nei formaggi duri svizzeri, ad eccezione di un basso numero di S. aureus, nessuno dei germi esaminati era stato rilevato a un giorno dalla fabbricazione. La rapida diminuzione del numero di E. coli, S. aureus e L. monocytogenes è stata verificata anche in ricerche compiute per valutare l evoluzione di contaminazioni artificiali nel corso della produzione di Emmental [7], pur con qualche differenza per 19

8 quanto riguarda la loro persistenza nella cagliata. La scomparsa più rapida di questi patogeni nella tecnologia del Parmigiano-Reggiano trova una spiegazione nella temperatura di cottura più alta e nell utilizzo, con il siero innesto, di una maggiore quantità di batteri lattici termofili, che si traduce in un più repentino abbassamento dei valori di ph nella massa caseosa. CONCLUSIONI Sulla base di dati ottenuti, la presente ricerca conferma che nel ciclo di produzione del Parmigiano-Reggiano non si verificano le condizioni per la sopravvivenza dei germi patogeni, che scompaiono completamente nell arco delle prime 24 ore dopo la lavorazione. Pertanto, l uso del latte crudo non rappresenta un pericolo dal punto di vista igienico-sanitario. Si può, anzi, affermare che la tecnologia di produzione del Parmigiano-Reggiano ha un effetto sanitizzante comparabile a quello ottenuto con la pastorizzazione, senza i pericoli legati alla contaminazione post-pastorizzazione, a cui si devono spesso i casi segnalati di tossinfezioni di origine alimentare provocate dai prodotti lattiero-caseari. I fattori chiave che impediscono la sopravvivenza dei batteri potenzialmente patogeni nel Parmigiano-Reggiano sono la temperatura raggiunta nella fase di cottura (55 C e anche oltre), la permanenza della cagliata sotto siero a questa temperatura per circa 60 minuti e il rapido sviluppo dei batteri lattici termofili, che determinano un repentino abbassamento del ph nelle prime ore dopo la caseificazione ed esercitano un forte antagonismo competitivo nei confronti delle altre specie microbiche. La tecnologia di trasformazione, dove questi fattori si combinano e agiscono in sinergia, unitamente alla buona qualità microbiologica del latte, prodotto con l applicazione di rigorosi disciplinari, garantisce l assoluta sicurezza igienica del Parmigiano-Reggiano. RIASSUNTO - Al fine di verificare l eventuale sopravvivenza di batteri potenzialmente patogeni, durante la produzione di Parmigiano-Reggiano, sono state eseguite prove di caseificazione utilizzando latti inoculati con colture di Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes ed è stata valutata l evoluzione delle singole contaminazioni in campioni di cagliata prelevati al momento dell estrazione e, successivamente, a 12, 24, 48 e 72 ore dalla caseificazione. I risultati mettono in evidenza una rapida scomparsa dei batteri presi in considerazione. Già la fase di giacenza porta alla scomparsa di L. monocytogenes e riduce sensibilmente il numero di S. typhimurium. Nella cagliata a 12 ore è stata rilevata la presenza di poche colonie nella prova eseguita con aggiunta di E. coli, mentre nelle altre prove i germi inoculati 20

9 sono risultati assenti. A partire dai prelievi fatti a 24 ore, i microrganismi aggiunti al latte non sono più stati rivelati nella cagliata. Questi risultati confermano che il Parmigiano-Reggiano fatto con latte crudo é assolutamente sicuro dal punto di vista igienico. Ciò deriva dal fatto che la tecnologia prevede una elevata temperatura di cottura (55 C e oltre), una lunga permanenza della cagliata sotto siero a questa temperatura ed un rapido sviluppo dei batteri lattici termofili usati come starter (siero innesto) che determinano un repentino abbassamento del ph e svolgono un forte antagonismo competitivo nel confronto degli altri batteri. Parole chiave: batteri patogeni, Parmigiano-Reggiano, sopravvivenza ABSTRACT - Study of the behaviour of potentially pathogenic bacteria during the manufacture of Parmigiano-Reggiano cheese. - To study the fate of potentially pathogenic bacteria during the manufacture of Parmigiano- Reggiano, a cheese made from raw milk, four wheeles were produced with milk inoculated with, respectively, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. The survival of the added microrganisms was evaluated in samples of curd taken when extracted from the vat and, successively, at 12, 24, 48 and 72 hours after cheesemaking. At extraction, L. monocytogenes was not detected and the number of S. typhimurium was very low. 12 hours after manufacture only E. coli was detected, at low levels. None of the inoculated pathogens were detected 24 hours after fabrication. The rapid disappearance of pathogens depends on a technology providing: i) a high cooking temperature (55 C and more); ii) a long permanence (about 60 minutes) of the curd under whey at this temperature; iii) the fast growth of thermophilic lactic acid bacteria, that lowers ph to 5.0 within a few hours and prevents the development of the other bacteria. The results confirm that Parmigiano-Reggiano cheese made from raw milk is hygienically safe and we can affirm that the technology of manufacture has the same effect as the pasteurisation of the milk. Keywords: pathogenic bacteria, Parmigiano-Reggiano cheese, survival Ringraziamenti: Gli Autori ringraziano il Sig. Alberici Renato, Presidente del Caseificio Sociale La Grande (Castelnovo Sotto RE), il Sig. Landi Antonio e il personale del caseificio stesso per la preziosa collaborazione. 21

10 BIBLIOGRAFIA 1) Atti del 4 Plenary Meeting Mastering the influence of microrganism on the final properties of raw milk cheeses. AIR concerted action no. 3 - CT , maggio 1997, Pòvoa de Varzim, Portugal. 2) Cavalla A, Poglio A (1994). Andamento della flora microbica patogena e dei batteri lattici nel formaggio Parmigiano-Reggiano in corso di stagionatura. Tesi di laurea, Università degli Studi di Torino. 3) Spahr U, Url B (1994). Behaviour of Pathogenic Bacteria in Cheese A Synopsis of Experimental Data. Bollettino FIL/IDF 298, ) Mora R (1998). I principali aspetti della produzione. In Il Parmigiano- Reggiano - Un simbolo di cultura e civiltà, Casa editrice Leonardo Arte, Milano. 5) Mora R, Nanni M, Panari G (1984). Variazioni chimiche, fisiche e microbiologiche nel formaggio Parmigiano-Reggiano durante le prime 48 ore. Sci. Tecn. Latt.-Cas. 35, ) Bachmann HP, Spahr U (1995). The fate of potentially pathogenic bacteria in swiss hard and semihard cheeses made from raw milk. J. Dairy Sci. 78, ) Institut Technique du Gruyère (1996). Guide d aide a la mise en place de la méthode HACCP en pâte pressée cuite. Délégation Régionale Nord. 22 Lavoro Panari ricevuto et al. (2001) il Sci. Tecn. ed Latt.-Cas., accettato 52 il (1),