ANDAMENTO DELLA GLICOLISI NELLE PRIME FASI DI MATURA- ZIONE DEL PARMIGIANO-REGGIANO

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1 SCIENZA E TECNICA LATTIERO-CASEARIA, 54 (3), ANDAMENTO DELLA GLICOLISI NELLE PRIME FASI DI MATURA- ZIONE DEL PARMIGIANO-REGGIANO M Pecorari 1 *, G Gambini 1, P Reverberi 1, A Caroli 1, G Panari 1 INTRODUZIONE La grande variabilità organolettica dei formaggi dipende dalla microflora autoctona, dalla composizione del latte, dalle diverse tecnologie impiegate e dal tipo di batteri utilizzati come starter che sviluppano già durante la caseificazione e sono in grado di indirizzare il successivo processo maturativo. Lo sviluppo dei fermenti lattici che avviene nella massa caseosa immediatamente dopo la caseificazione e le conseguenti modificazioni chimico-fisiche della pasta concorrono in modo determinante alla formazione delle peculiarità qualitative di ogni formaggio [1-3]. Nella produzione del formaggio grana la glicolisi avviene ad opera dei batteri lattici termofili, prevalentemente omolattici, selezionati mediante una siero-coltura naturale ottenuta per fermentazione in appositi recipienti dal siero che residua dalla caseificazione del giorno precedente [4]. La trasformazione del lattosio in acido lattico ad opera di questa flora microbica, pertanto, rappresenta la più importante reazione biochimica che si realizza nella prima fase della maturazione [5, 6]. I tempi e le modalità di sviluppo della flora lattica starter nelle prime 24 ore risultano importanti, non solo per indirizzare il successivo processo maturativo, ma, anche per salvaguardare la qualità igienico-sanitaria del prodotto. Infatti, l elevata temperatura di cottura che si raggiunge durante il processo tecnologico e la lunga sosta della cagliata in queste condizioni determinano un ambiente favorevole al solo sviluppo dei batteri lattici termofili in grado di esercitare un forte antagonismo competitivo nei confronti dei microrganismi patogeni [7-9]. Per la riuscita qualitativa del formaggio Parmigiano-Reggiano è necessario che gli zuccheri siano metabolizzati molto rapidamente e ciò dipende dall attività e dal tipo di coltura starter, in quanto non tutti i batteri lattici riescono a produrre acido lattico dal galattosio [10-12], dalla temperatura di cottura, dalle caratteristiche chimico-fisiche della pasta e dalla dimensione e dalle modalità di formatura della massa caseosa [13]. Scopo della presente ricerca è quello di definire i tempi e le modalità del processo idrolitico degli zuccheri nelle diverse zone della forma. * Corrispondenza ed estratti: labo@parmigiano-reggiano.it 1 Consorzio Formaggio Parmigiano-Reggiano. Via Kennedy 18, Reggio Emilia.

2 MATERIALI E METODI La ricerca è stata condotta su sei forme ottenute in altrettanti caseifici produttori di Parmigiano-Reggiano. Su ciascuna forma si è proceduto, al momento dell estrazione e dopo 6, 11, 23 e 32 ore, alla misurazione della temperatura e del ph a 3 e a 12 cm di profondità dal piatto e al prelievo di una porzione di formaggio mediante una sonda cilindrica in acciaio inox avente un diametro di 28 mm ed una lunghezza di 40 cm. Dal tassello, ricavato introducendo la sonda perpendicolarmente al centro del piatto, sono state prelevate due porzioni di pasta rappresentative della zona periferica e della zona centrale, rispettivamente a 2-4 cm e a cm dalla superficie piana. I fori, per evitare di alterare la pasta circostante, sono stati riempiti con cilindri di teflon di diametro uguale a quello della sonda. A 48 ore le forme sono state tagliate e dalla sezione mediana sono state prelevate due porzioni rappresentative della zona periferica e della zona centrale. Sul formaggio, finemente grattugiato, sono state eseguite le seguenti analisi: - lattosio, glucosio e galattosio: mediante test enzimatico della Boehringer-Mannheim [14]; - acido D- lattico e L-lattico: mediante test enzimatico della Boehringer- Mannheim [15]; - acidi grassi volatili: in HPLC [16]; - batteri lattici termofili: MRS a 45 C per 4 giorni in anaerobiosi [17]. RISULTATI E DISCUSSIONE Nella tabella 1 sono riportati i valori medi delle 6 prove delle analisi chimico-fisiche effettuate a diversi intervalli nelle prime 48 ore nella zona periferica e al centro della forma. I risultati evidenziano, già al momento dell immissione negli stampi e, soprattutto, durante le prime ore di formatura, un gradiente termico tra la periferia e il centro che si mantiene, anche se con diversa intensità, fino all introduzione della forma in salamoia. La figura 1 mostra come la pasta nel cuore della forma si raffreddi più lentamente rispetto a quella dell anello periferico: alla 6 a e all 11 a ora la differenza di temperatura tra interno ed esterno risulta pari a 12 C circa, mentre, dopo 23 e 32 ore il range si riduce, rispettivamente a 8 e a 4 C circa. A 48 ore la differenza è ancora di 2 C circa. L ampio intervallo tra i valori minimi e massimi di temperatura, rilevati nelle prime 24 ore nelle sei prove di caseificazione, soprattutto al centro della forma (le temperature minime e massime nel cuore della forma alla 6 a ora ed alla 23 a ora risultano, rispettivamente: 53,2-55,3 C e 35,0-40,5 C), dimostra come il raffreddamento della massa caseosa presenti 150 Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

3 Tabella 1 - Indici chimico-fisici medi relativi a diversi intervalli all esterno e all interno della forma di Parmigiano- Reggiano nelle prime 48 ore (medie di 6 prove). Table 1 - Physical and chemical parameters of external and internal Parmigiano-Reggiano cheese zones at different steps during the first 48 hours (mean of 6 trials). Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

4 Figura 1 - Andamento della temperatura all esterno e all interno della forma di Parmigiano-Reggiano durante le prime 48 ore (media di 6 prove). Figure 1 - Temperature in external and internal Parmigiano-Reggiano cheese zones during the first 48 hours (mean of 6 trials). notevoli differenze tra i caseifici in conseguenza della diversa impostazione tecnologica adottata. Il gradiente termico che si determina nelle due zone della forma, infatti, risulta influenzato da diversi fattori, quali la temperatura di cottura della cagliata, la dimensione della forma e la temperatura dell ambiente in cui sono effettuate le operazioni di formatura [13, 18]. Le variazioni di temperatura riscontrate tra le due zone nelle prime ore dopo la fabbricazione trovano conferma con quanto rilevato in analoghe ricerche [2, 13, 19, 20]. Intorno alla 6 a ora si raggiunge il gradiente termico più elevato (12 C circa), come riscontrato da Mora et al. nel Parmigiano-Reggiano [19] e da Mucchetti et al. nel Grana Padano [13], anche se i valori assoluti risultano diversi, in conseguenza delle differenze che probabilmente caratterizzano il processo di caseificazione con cui sono state prodotte le forme oggetto delle diverse ricerche. Il diverso andamento della temperatura tra interno ed esterno della forma condiziona lo sviluppo della flora lattica termofila e, conseguentemente, la produzione di acido lattico ed il valore di acidità della pasta. Il ph discende velocemente all esterno della forma per raggiungere, intorno alla 6 a ora, il valore minimo (4,98), mentre nel cuore della forma tale abbassamento risulta lento nelle prime 11 ore (da 5,95 a 5,59), per poi accelerare repentinamente tra l 11 a e la 23 a ora. Successivamente si registra una modesta risalita che, alla 48 a ora, porta il ph a 5,19, valore che tende ad eguagliare quello della zona esterna (Fig. 2). 152 Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

5 Figura 2 - Andamento del ph all esterno e all interno della forma di Parmigiano- Reggiano durante le prime 48 ore (media di 6 prove). Figure 2 - ph in external and internal Parmigiano-Reggiano cheese zones during the first 48 hours (mean of 6 trials). Tali andamenti si discostano da quelli evidenziati nei lavori di Pellegrino et al. [21], Mucchetti et al. [13] e Addeo et al. [2], nei quali la diminuzione del ph nel cuore della forma risulta, anche nelle prime ore, molto rapida, tale da raggiungere valori di ph intorno a 5,10-5,30. Le differenze potrebbero trovare una spiegazione nei diversi sistemi produttivi che caratterizzano il Grana Padano e il Parmigiano-Reggiano e, nell ambito dello stesso formaggio, nella differente operatività che si realizza nei singoli caseifici. Nella zona periferica l acido lattico si accumula velocemente fino alla 6 a ora per poi stabilizzarsi intorno a valori di 1,3 g per 100 grammi di formaggio (Fig. 3). Nel cuore della forma, al contrario, la produzione di acido lattico risulta modesta fino all 11 a ora (0,52 g/100g); solo nelle successive 12 ore si raggiunge lo stesso valore riscontrato nell anello periferico. Le forme D e L di tale acido, inizialmente presenti in quantità simili nella cagliata, concorrono in misura diversa nel corso delle 48 ore alla produzione di acido lattico totale. L acido L-lattico risulta dopo la 23 a ora, soprattutto all interno della forma, superiore all acido D lattico (Fig. 4); tale andamento risulta in linea con i lavori di Bottazzi [22] e di Pellegrino et al. [15], limitatamente all utilizzo di siero innesto naturale. L attività lattica termofila inizia già intorno ai C [23, 24] e trova, intorno ai 45 C, la temperatura ideale di sviluppo che si realizza alla 3 a - 4 a ora, nell anello periferico, e alla 14 a -15 a ora nel cuore della forma. Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

6 Figura 3 - Andamento dell acido lattico all esterno e all interno della forma di Parmigiano-Reggiano durante le prime 48 ore (media di 6 prove). Figure 3 - Lactic acid in external and internal Parmigiano-Reggiano cheese zones during the first 48 hours (mean of 6 trials). La lunga selezione realizzata nella produzione del formaggio grana ha consentito di aumentare la tolleranza alle elevate temperature della microflora lattica del siero-innesto [1, 23]. L abbassamento del ph e la produzione di acido lattico già nelle prime 6 ore al centro della forma, dove la temperatura risulta prossima a quella di cottura della cagliata, ne sono Figura 4 - Andamento degli isomeri D ed L dell acido lattico all esterno e all interno della forma di Parmigiano-Reggiano durante le prime 48 ore (media di 6 prove). Figure 4 - D and L lactic acid isomerics in external and internal Parmigiano- Reggiano cheese zones during the first 48 hours (mean of 6 trials). 154 Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

7 una ulteriore conferma [13, 15]. Lo sviluppo della microflora lattica termofila rallenta significativamente alla 6 a ora e si arresta quasi completamente intorno all 11 a ora all esterno e alla 23 a nel cuore della forma. Infatti, nella periferia della forma alla 6 a ora, in corrispondenza del più basso valore di ph, il contenuto di zuccheri della cagliata risulta significativamente ridotto. Oltre il 98% del lattosio, inizialmente presente all estrazione della forma, risulta metabolizzato a conferma di una massiva attività lattica nelle prime 6 ore (Fig. 5). Figura 5 - Andamento del glucosio e del galattosio all esterno e all interno della forma di Parmigiano-Reggiano durante le prime 48 ore (media di 6 prove). Figure 5 - Glucose and galactose in external and internal Parmigiano-Reggiano cheese zones during the first 48 hours (mean of 6 trials). All 11 a ora nella porzione esterna della massa caseosa rimangono solo tracce di glucosio e di galattosio (0,005 g e 0,02 g, rispettivamente) (Tab.1) e la produzione di acido lattico praticamente si arresta. Nel cuore della forma la concentrazione più elevata di glucosio e di galattosio si riscontra alla 11 a ora (rispettivamente 0,23 e 0,55 g) (Tab.1). Nelle successive 12 ore, intorno alla 23 a ora si assiste alla scomparsa dei due monosaccaridi. L esame della figura 6, consente di evidenziare come già alla 6 a ora il numero di batteri lattici termofili nell anello periferico scenda a poco più di 70 milioni di UFC/g e come all 11 a ora si riduca a pochi milioni; al centro, per contro, si evidenzia una forte crescita dall 11 a alla 23 a ora, in cui si superano i 300 milioni di UFC, per poi decrescere repentinamente per l assenza di zuccheri fermentescibili fino a ridursi a poche decine di milioni intorno alla 48 a ora. Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

8 Figura 6 - Andamento dei batteri lattici termofili (LT) all esterno e all interno della forma di Parmigiano-Reggiano dalla 6 a alla 48 a ora (media di 6 prove). Milioni di UFC/g. Figure 6 - Thermophilic acid bacteria (LT) in external and internal Parmigiano- Reggiano cheese zones from the 6 th to the 48 th hour (mean of 6 trials). Millions of CFU/g Nella zona centrale della forma, anche nelle prime ore, si assiste ad una significativa attività lattica, con un abbassamento di 0,32 unità di ph e con una produzione di 0,27 grammi/100 g di acido lattico alla 6 a ora e, successivamente, ad un rallentamento fino all 11 a ora con un discreto accumulo di glucosio e, soprattutto, di galattosio. Tale andamento potrebbe essere giustificato dalla ridotta attività metabolica della flora lattica per la permanenza di alcune ore ad una temperatura superiore ai 50 C, come ipotizzato da Pellegrino et al. [15] o per il verificarsi di una alternanza di specie o di biotipi con caratteristiche metaboliche diverse che trovano nelle diverse zone della forma condizioni di sviluppo differenti dalla 1 a alla 11 a ora [13, 25]. La quantità di galattosio si riduce, anche al centro della forma, a 0,08 grammi dopo 23 ore e ciò rappresenta una delle più importanti garanzie per la riuscita qualitativa del formaggio. Infatti quantità più elevate di galattosio potrebbero favorire in questa fase, in assenza di antagonismo della flora lattica, lo sviluppo di fermentazioni anomale con alterazioni strutturali del formaggio [15, 26, 27]. Occorre rilevare come le diverse impostazioni del processo di caseificazione adottate dai singoli caseifici possano determinare scostamenti importanti del processo glicolitico. Infatti, alcune variabili, quali il differente dosaggio del siero-innesto, le diverse associazioni batteriche dello stesso, le diverse temperature di cottura della cagliata, e le differenti tem- 156 Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

9 perature degli ambienti in cui sono manipolate le forme, sono in grado di influenzare la curva di raffreddamento della pasta e, di conseguenza lo sviluppo della flora lattica, la produzione di acido lattico e la diminuzione del ph [18]. Nella tabella 1 e nella figura 7 sono riportati, rispettivamente, i contenuti degli acidi grassi volatili e le variazioni, all esterno e all interno della forma, del tenore di acido acetico. Figura 7 - Andamento della temperatura e dell acido acetico all esterno e all interno della forma di Parmigiano-Reggiano durante le prime (media di 6 prove). Figure 7 - Temperature and acetic acid in external and internal Parmigiano- Reggiano cheese zones during the first 48 hours (mean of 6 trials). L acido acetico aumenta significativamente alla 6 a ora nella periferia ed alla 23 a ora al centro, in coincidenza dell abbassamento della temperatura intorno ai 45 C, raggiungendo valori intorno ai 30 mg all esterno e mg all interno della forma. E evidente, pertanto, che la flora lattica eterofermentante, responsabile della produzione di acido acetico e di anidride carbonica, si sviluppa in tempi successivi a quella omolattica, in quanto risulta strettamente condizionata dalla temperatura della pasta che ne impedisce lo sviluppo nelle prime 6-7 ore in periferia e nelle prime al centro della forma, quando la temperatura non scende al di sotto dei 50 C [11, 22]. In entrambe le zone non si rileva la presenza di acido propionico, a conferma dell assenza di fermentazione precoce di tipo propionico e i valori di acido butirrico appaiono di modesta entità (2,11 e 5,41 mg/100g, rispettivamente all esterno e all interno) a dimostrazione di un corretto processo fermentativo delle forme nelle prime 48 ore. Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

10 CONCLUSIONI Il processo glicolitico che caratterizza le fasi iniziali della maturazione risulta condizionato dal gradiente termico che si instaura nella massa caseosa tra il centro e la zona periferica della forma [2, 13, 15, 18-20]. L idrolisi degli zuccheri inizia nell anello esterno, dove, per il rapido raffreddamento della pasta, si assiste già dopo 6 ore circa alla completa scomparsa degli zuccheri, alla produzione di circa 1,3-1,4 grammi di acido lattico e, conseguentemente, all abbassamento del ph intorno a valori prossimi a 5. Al contrario, nel cuore della forma il raffreddamento della pasta risulta molto lento e, solo dopo circa dieci ore, scende sotto i 50 C consentendo il successivo sviluppo della flora lattica termofila. In tale zona gli zuccheri risultano completamente idrolizzati ed il contenuto di acido lattico tende ad eguagliare quello della zona esterna soltanto intorno alla 23 a ora. L uso nel tempo di elevate temperature di cottura e i lunghi tempi di permanenza della cagliata a tali temperature hanno determinato la selezione di una flora lattica del siero-innesto con una elevata termofilia [1, 23]. Tale peculiarità consente ai batteri lattici una significativa attività anche al centro della forma nelle ore immediatamente successive all estrazione della massa caseosa, con una riduzione del ph di 0,3 unità circa ed una produzione di 0,4-0,5 grammi di acido lattico a cui fa seguito un rallentamento dell acidificazione fino all 11 a ora. Tale andamento potrebbe essere giustificato dall effetto stressante della flora lattica per la permanenza di alcune ore alle elevate temperature adottate con la cottura della cagliata [15] o dall alternanza, all interno della forma, di ceppi microbici o di biotipi con diversa resistenza alle alte temperature [13, 25]. Gli acidi D e L lattico, inizialmente presenti in quantità simile nella cagliata all estrazione, evolvono nelle prime ore dopo la fabbricazione con diversa intensità: il contenuto di acido L lattico a 24 ore, soprattutto all interno della forma, risulta superiore al D lattico. Infine, l acido acetico tende ad accumularsi in periferia, solo dopo la 6 a ora, e al centro, dopo la 23 a, e cioè in coincidenza di temperature prossime ai 45 C, a dimostrazione del carattere mesofilo della flora eterofermentante presente nel siero-innesto e principale responsabile della produzione di acido acetico [11, 22]. RIASSUNTO - L obiettivo della ricerca è stato quello di studiare il meccanismo del processo glicolitico che caratterizza la prima fase della maturazione del Parmigiano-Reggiano. Si è operato su sei forme ottenute in altrettanti caseifici produttori di Parmigiano-Reggiano. Su ognuna di esse si è proceduto al momento dell estrazione e dopo 6, 11, 23 e 32 ore, al prelievo di una porzione di formaggio mediante una sonda cilindrica e a 48 ore al taglio e all analisi della forme. Su ogni campione di formaggio si è 158 Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

11 proceduto alla determinazione del ph, del lattosio, del glucosio, del galattosio e dell acido lattico, degli acidi grassi volatili e del numero di batteri lattici termofili. La glicolisi presenta un andamento significativamente diverso tra periferia e centro. All esterno, per la rapida discesa della temperatura, si completa dopo 6 ore l idrolisi degli zuccheri; l acido lattico si accumula in ragione di 1,3 g/100 g di formaggio e il ph scende a valori prossimi a 5. All interno, dopo una iniziale attività lattica con produzione alla 6 a ora di 0,5 g circa di acido lattico e una riduzione del ph di 0,3 unità, si assiste ad una stasi fermentativa fino all 11 a ora, quando la temperatura raggiunge valori prossimi a 50 C. Nelle successive 12 ore si assiste alla completa scomparsa degli zuccheri ed al raggiungimento di valori di ph e di acido lattico simili a quelli riscontrati nell anello periferico intorno alla 6 a ora. L acido L lattico, inizialmente presente nella stessa quantità dell isomero D, risulta dopo 23 ore circa, significativamente superiore, soprattutto nel cuore della forma.l acido acetico tende ad accumularsi solo quando la temperatura scende a valori prossimi a 45 C (in periferia, solo dopo la 6 a ora, e al centro, dopo la 23 a ), cioè quando la temperatura risulta idonea allo sviluppo della flora lattica eterofermentante responsabile della produzione dell acido acetico. Parole chiave: Parmigiano-Reggiano, glicolisi, lattosio, glucosio, galattosio, acido lattico, temperatura e ph ABSTRACT - Glycolysis in Parmigiano-Reggiano cheese during the first ripening phase. - This work aimed to study the glycolysis process in Parmigiano-Reggiano during the first ripening phase. Therefore no.6 Parmigiano-Reggiano cheeses, each one of different cheese factory origin, were tested. By way of a cylindrical probe, a portion of curd was taken from each test cheese at the intervals of 6 th,11 th,23 rd, and 32 nd hour after cheesemaking, while at the 48 th hour the cheeses were cut and tested. The samples were tested to evaluate, at each interval of time, the grade of acidity (ph), the amount of glucose, galactose, lactic acid, volatile fatty acids and thermophilic acid bacteria. The Glicolysis tests proved that this process is related to the cheese zone. After 6 hours, the rapid drop in temperature of the external zone, leaded to a complete sugar s hydrolysis hence the lactic acid level resulted to be increased up to 1.3% and ph value close to 5, while in the core, the production of acid lactic reached the value of 0.5% only. The lactic fermentation, in the core, remained almost stable in the range of 5% in the window of time between the 6 th and 11 th hour till temperature drop to 50 C. During the following 12 hours, sugars were completely fermented and ph values decreased quicker. D and L isomerics lactic acid levels were initially similar, but after the 23 rd hour, L isomeric value resulted to be higher, particularly in the core of the cheese. Acetic acid content increased when temperature decreased approaching 45 C (after 6 hours in external zone and after 23 hours in the core), which is the Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

12 optimum condition for the growth of heterofermentative lactobacilli. Keywords: Parmigiano-Reggiano cheese, glycolysis, lactose, glucose, galactose, lactic acid, temperature and ph Ringraziamenti: Lavoro eseguito nell ambito del programma di sperimentazione della regione Emilia Romagna, realizzato con il coordinamento tecnico-organizzativo del Centro Ricerche Produzioni Animali (CRPA) di Reggio Emilia. BIBLIOGRAFIA 1) Bottazzi V (1997). Capolavori microbici: i formaggi tipici. Caseus, 2, ) Addeo F, Mucchetti G, Neviani E (1997). Gli aspetti biochimici della maturazione del formaggio con particolare riferimento alle varietà a pasta dura. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 48, ) Neviani E, Carini S (1994). Microbiology of Parmesan cheese. Microbiologie, Aliments, Nutrition, 12, ) Battistotti B (1995). Il siero-innesto nei processi di maturazione del formaggio Grana: nuove acquisizioni. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 46, ) Lodi R (2000). Ruolo della microflora caratteristica nella produzione di formaggi tipici. Atti Convegno I controlli nel settore lattiero-caseario, 9 giugno 2000, Milano. 6) Bottazzi V, Scolari GL, Cappa F, Battistotti B, Bosi F, Brambilla E (1992). Batteri lattici per la produzione di formaggio grana. III parte: velocità di acidificazione e comparsa di gonfiore. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 43, ) Panari G, Perini S, Guidetti R, Pecorari M, Merialdi G, Albertini A (2001). Indagine sul comportamento di germi potenzialmente patogeni nella tecnologia del formaggio Parmigiano-Reggiano. Sci. Tecn. Latt.- Cas., 52, ) Merialdi G, Perini S, Panari G, Guidetti R, Pecorari M (2001). Evoluzione di contaminazioni artificiali con batteri patogeni nella tecnologia del formaggio Parmigiano-Reggiano. XI Convegno AIVI Sicurezza Alimentare: un approccio di filiera 6-8 settembre 2001 Alghero (SS). 9) Pellegrino L, Resmini P (2001). Cheese making condition and compositive characteristics supporting the safety of raw cheese Italian Grana. Sci. Tecn. Latt.- Cas., 52, ) Bottazzi V, Vescovo M, Dallaglio F (1973). Ricerche sulla microbiologia del formaggio Grana. IX parte: caratteri e distribuzione dei biotipi di L. helveticus nelle colture naturali (il siero fermento). Sci. Tecn. Latt.- Cas., 24, ) Nanni M, Coppola R, Iorizzo M, Sorrentino A, Sorrentino E, Grazia L 160 Pecorari et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (3),

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