Fase Preanalitica. Errori di laboratori: scambio di provetta!!!!

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1 Fase Preanalitica Errori di laboratori: scambio di provetta!!!!

2 Fase Preanalitica Errori di laboratori: scambio di provetta!!!!

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4 PROVETTE CON ANTICOAGULANTE SODIO CITRATO DA 0,4 E 0,5 ML.

5 Emostasi Serie di reazioni biochimiche e cellulari, sequenziali e sinergiche, che hanno lo scopo di impedire la perdita di sangue dai vasi. È un meccanismo di difesa, finalizzato al mantenimento dell integrità dei vasi sanguigni e della fluidità del sangue ALTERAZIONI DELL EMOSTASI AUMENTO RIDUZIONE TROMBOSI EMORRAGIA

6 Emostasi: Vasocostrizione e formazione del tappo

7 Piastrine e aggregazione Fibrina

8 A B C

9 Processo di coagulazione I meccanismi di protezione dal danno vascolare riguardano Vasocostrizione riflessi centrali e spasmi di muscolatura liscia (serve per rallentare brevemente il flusso del sangue in vasi di piccole dimensioni) Adesione e Aggregazione piastrinica convergono verso la ferita aderendo alle fibre del collagene del vaso lacerato Coagulazione in seguito alla Aggregazione Piastrinica il sangue perde la sua fluidità e forma un coagulo gelatinoso cui seguono una serie di eventi meglio conosciuti come cascata coagulativa

10 Fasi del processo emostatico 1- Vascolare contrazione muscolatura vasale Riduzione lume vascolare 2- Piastrinica adesione risposta biochimica degranulazione aggregazione Formazione tappa piastrinico 3- Coagulativa attivazione proteasi plasmatiche Formazione coagulo fibrina 4- Fibrinolitica attivazione sistema fibrinolitico Dissoluzione Coagulo RIPARAZIONE LESIONE VASCOLARE

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12 Fase vascolare- insulti emorragici In seguito al danno vascolare si attiva immediatamente un segnale nervoso che evoca una reazione di vasocostrizione nella zona del vaso danneggiato. Anche i vasi adiacenti sono coinvolti nel meccanismo di vasocostrizione Il flusso del sangue viene rallentato determinando una conseguente minore quantità circolante Induce la produzione di fattori tissutali procoagulanti

13 Fase vascolare- difesa antitrombotica Volta a prevenire formazione eccessiva di trombina: coinvolgimento della parete endoteliale. Continuità dello stato cellulare Glicosaminoglicani impediscono l adesione piastrinica attraverso la repulsione elettrostatica Sintesi di sostanze vasodilatatrici (EDRF) antiaggreganti (PGI 2 ) anti coagulanti (trombo modulina) e profibrino litiche (attivatori del plasminogeno t-pa)

14 Fase vascolare Contrazione tunica media Stimolazione nervosa Rilascio endotelina Rilascio serotonina

15 PIASTRINE Derivano dai megacariociti

16 PIASTRINE Membrana profondamente invaginata (sistema canalicolare aperto o di connessione superficiale) Sistema tubulare denso (STD) Microtubuli (shape-change) Filamenti contrattili Granuli alfa (PF4, BTG, FIBR.) Granuli densi (serotonina, ADP, ATP, Ca) Glicoproteine di membrana (recettori che mediano l adesione e l aggregazione)

17 1- Adesione al sottoendotelio FASI DELLA RISPOSTA PIASTRINICA 2- Attivazione piastrinica con innesco delle vie di trasduzione del segnale 3- Cambiamento di forma con emissione di propaggini (pseudopodi) 4- Secrezione piastrinica: rilascio del contenuto dei granuli piastrinici 5- Aggregazione piastrinica: Primaria (reversibile) Secondaria (irreversibile) Tappo emostatico primario Tappo emostatico secondario

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20 Adesione piastrinica L endotelio integro e la superficie piastrinica si respingono in virtù delle loro cariche negative. La perdita dell endotelio espone il collageno sottoendoteliale che lega il GpIa. La GpIb si lega al vwf a sua volta adeso al collageno. Membrana Basale Lesione Endotelio GpIb Piastrina GpIa Piastrina Collageno Fattore di von Willebrand (multimero)

21 Attivazione piastrinica

22 Attivazione piastrinica Cambiamento forma Degranulazione In seguito all adesione le piastrine attivano meccanismi di trasduzione Che determinano il cambiamento di forma e la degranulazione

23 Aggregazione piastrinica L aggregazione piastrinica si verifica perché il fibrinogeno si pone a ponte GpIIb-IIIaIIIa Fibrinogeno GpIIb-IIIaIIIa tra il GpIIb-IIIa IIIa di una piastrina e l altra. Il fibrinogeno è quindi, in questo caso, un collante dell aggregazione. Il cross-linking della trombospondina stabilizza il legame

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25 Fase piastrinica -1 Le piastrine sono immediatemente mobilitate e con il coinvolgimento di numerose molecole (collageno sub-endoteliale, fibronectina, trombospondina, recettori delle piastrine, fattore di von Willebrand, fattore VII ) si aggregano dando inizio al primo passaggio della aggregazione.

26 Fase piastrinica -2 Le piastrine aggregate sono tenute insieme dal fibrinogeno Le piastrine producono una serie di sostanze con attività vasocostrittrice e/o proaggregante (serotonina, trombassano A 2 ), fattori della coagulazione (fattore di von Willebrand, fattore V) e inibitori della fibrinolisi (PAI-1 e α2- antiplasmina) Il tappo piastrinico contiene una striscia fosfolipidica ideale per l attivazione della coagulazione

27 RELEASE REACTION DELLE PLT Fattore piastrinico 4 (PF4): proteina con affinità per l eparina di cui neutralizza l azione inibente sulla trombina Beta-Tromboglobulina :proteina che si lega alle cellule endoteliali esercitando un azione inibente sulla prostaciclina Trombospondina: proteina che si lega al fibrinogeno e ne stabilizza il legame con le piastrine Platelet Activating Factor (PAF): fosfolipide di membrana che stimola i movimenti intracellulari di Ca Fattore di crescita di derivazione piastrinica (PGDF): proteina che attiva la proteinchinasi C, la mobilizzazione di Ca e la proliferazione cellulare

28 Fase Coagulativa

29 Fase Coagulativa -1 I prodotti proteici coinvolti nell innesco della fase plasmatica o coagulativa vengono prodotti inizialmente in forma inattiva Successivamente enzimi proteolitici (della classe serina) intervengono nel determinare un cambiamento a catena Lo scopo finale è la formazione della trombina, una proteasi che modifica la molecola del fibrinogeno trasformandolo in fibrina.

30 Fase Coagulativa -2 Via intrinseca. Si attiva in seguito a esposizione fibre collagene o superficie estranee che scatena l attivazione del fattore XII. I fattori della fase di contatto hanno la capacità di legarsi. Via estrinseca. Ruolo del fattore tissutale che causa l attivazione del fattore VII Fattore VII. Fattore protrombinico permette il legame con il calcio e le superficie fosfolipidiche dove si svolge il processo coagulativo

31 Fase Coagulativa

32 Fattore Tissutale (TF) Proteina transmembrana che serve come recettore di superficie e cofattore essenziale per il FVIIa Legandosi il TF al FVIIa il complesso acquista attività catalica e attiva i fattori X e IX Presente sulle membrane dei fibroblasti, cellule tumorali. In condizioni normali non presente nella membrana di monociti e cellule endoteliali, nelle quali però può essere espresso a seguito di diversi stimoli

33 Agenti in grado di indurre l espressione di TF sulle cellule endoteliali Virus, batteri Endotossine Complessi immuni Proteina C reattiva Interleuchine (IL-1, TNF) Trombina

34 Navigando sulle onde della cascata. coagulativa

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36 ATTIVAZIONE DELLA VIA INTRINSECA TUTTE LE SOSTANZE DI CARICA ELETTRICA NEGATIVA (materiali polianionici) Attivatori non biologici (vetro) Attivatori biologici (membrane basali, collagene)

37 FATTORI PLASMATICI DELLA COAGULAZIONE Fatt. I Fibrinogeno Fatt.II Protrombina Fatt.III Tromboplastina tissutale* Fatt.IV Calcio Fatt.V Proaccelerina* Fatt.VII Proconvertina Fatt.VIII Fatt.antiemofilico A* Fatt.IX Fatt. Christmas Fatt.X Fatt.Stuart-Prower Fatt.XI Antecedente tromboplastinico plasmatico Fatt.XII Fatt.Hageman Fatt.XIII Fatt.stabilizzante la fibrina o fatt. Laki-Lorand

38 FIBRINOLISI Fibrinogeno fibrina Plasminogeno Attivatori plasmatici o estrinseci (XII,precallicreina) Attivatori tissutali o estrinseci (t-pa,urochinasi,streptochinasi) inibitori attivatori plasmina inibitori FDP/FSP I,V,VIII,protrombina

39 Conta piastrinica Test di screening di I livello (Att.ne pseudopiatrinopenia) Tempo di sanguinamento (met.mielke) vn fino a 9 min Soltanto dopo: ANAMNESI FAMILIARE ANAMNESI PERSONALE ANAMNESI FARMACOLOGICA ESAME OBIETTIVO

40 Farmaci, cibi, spezie e vitamine che possono causare alterazioni funzionali piastriniche FANS Antibiotici β-lattamici Farmaci cardiovascolari Farmaci psicoattivi Antistaminici Mezzi di contrasto Cibi Acidi grassi polinsaturi omega 3,Vit C, E Spezie

41 Tempo di sanguinamento allungato Piastrinopenia Piastrinopatia intrinseca estrinseca Test di aggregazione Malattia di Von Willebrand Dosaggio fattore vw

42 Test di screening di I livello Conta piastrinica Tempo di sanguinamento PT aptt

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44 Tempo di emorragia metodo Ivy È il tempo calcolato per l arresto della emorragia praticato in un punto specifico. I valori sono anche variabili con l età. 3-9 minuti nelle femmine 3-6 minuti nei maschi Tempi allungati indicano un alterata funzionalità piastrinica che si può accertare con esami più specifici (adesività e aggregazione piastrinica)

45 Test di adesività Si determina la riduzione del numero di piastrine dopo passaggio di una quantità nota di sangue in una colonnina contente palline di vetro ad una velocità costante. Una scarsa riduzione ci indica la compromessa funzionalità piastrinica, tipica delle trombocitopatie congenite. Conteggio delle piastrine Il numero delle piastrine varia da 150,000 a 400,000 /mm 3 aumentate nelle malattie mieloproliferative sono notevolmente

46 Test di aggregazione piastrinica Il test viene eseguito utilizzando sostanze che stimolano o che inducono l aggregazione. la variazione della densità ottica nel tempo consente la determinazione di indici di aggregazione Tempo di reazione Massima variazione di densità ottica Tempo di latenza (tra l aggiunta dell aggregante e l inizio della variazione della densità ottica) Ampiezza o variazione della densità ottica iniziale

47 Test di aggregazione piastrinica

48 Tempo di tromboplastina parziale attivato (aptt) Indica il tempo medio di coagulazione del campione rispetto ad un campione di riferimento. Permette l osservazione della progressione nel tempo del coagulo. Deficit in emopatie v.n secondi Tempo di protrombina (PT) Indica la funzionalità del meccanismo estrinseco della coagulazione ed è sensibile alla concentrazioni dei fattori coinvolti ( X, VII; V, protrombina e fibrinogeno) Deficit in malattie congenite v.n secondi

49 Tempo di tromboplastina parziale attivato (aptt) XII XI IX - VIII Via intrinseca Via estrinseca VII Via comune X V II I FIBRINA Tempo trombina Tempo di protrombina (PT)

50 Tempo di tromboplastina parziale (aptt) aptt - Tempo necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando il plasma viene ricalcificato in presenza di sostituti del fattore piastrinico 3 (cefalina) associati ad attivatori della fase di contatto (ac.ellagico, silice micronizzata, caolino) studia la via intrinseca e la via comune della coagulazione.

51 Tempo di tromboplastina parziale attivato (aptt) E sensibile all attività dei fattori della fase di contatto e via intrinseca (precallicreina, chininogeno, XII, XI, IX e VIII) e della via comune (II, V, X e fibrinogeno) Presenza eparina Presenza di anticorpi antifosfolipidi (LAC)

52 Tempo di tromboplastina parziale attivato (aptt) L allungamento dell aptt è maggiore quanto più è a monte la carenza Deficit FXII (< 1%) Deficit FVIII (< 1%) aptt = sec aptt = sec

53 Tempo di protrombina (PT) Tempo in secondi non paragonabile in vari sistemi Attività percentuale: Si preparano diluizioni 1:2, 1:4, 1:8 di un plasma normale (o pool di plasma normali) e si attribuisce un attività di 50%, 25%, 12.5% Si riportano I dati su assi cartesiani costruendo una curva da usare per valutare I campioni

54 Tempo di protrombina (PT) Tempo di coagulazione (secondi) Attività (percentuale) PT ratio (paziente/normale) INR (paziente/normale) ISI

55 Tempo di trombina (TT) TT - Tempo necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando il plasma viene ricalcificato in presenza di concentrazioni ottimali di trombina studia la fibrino-formazioneformazione Misura il tempo di coagulazione dopo l aggiunta di trombina. Evidenzia la presenza di deficit di fibrinogeno fino a 22 s

56 Test COAGULATIVI Misurano il tempo necessario per ottenere la coagulazione di un campione di plasma citratato dopo aggiunta di opportuno reattivo. La presenza di eparina provocherà un allungamento del tempo di coagulazione direttamente correlato alla concentrazione eparinica.

57 Interpretazione dati laboratori: Emostasi Test di monitoraggio anticoagulanti orali Utilizzato per la valutazione della risposta anticoagulativa all uso di farmaci orali. Determinato in base a valori INR (International normalized ratio) p.es. il grado di anticoagulazione raggiunta con la terapia alla warfarina può essere misurata, indifferentemente dalla tromboplastina usata. INR L utilizzo di un parametro riconosciuto internazionalmente permette la comparabilità dei risultati da laboratorio a laboratorio. p.es. In soggetto sotto trattamento con Coumadina il tempo di protrombina sarà 2 o 3 volte più veloce. La valutazione dovrà dunque essere effettuata prima che il soggetto inizi un qualsiasi trattamento specialmente nei soggetti che hanno valvole cardiache.

58 Equazione INR INR = Patient s PT in Seconds ( Mean Normal PT in Seconds ) ISI INR = International Normalized Ratio ISI = International Sensitivity Index

59 La Tromboplastina Influenza il PT Ratio e INR Tromboplastina Reagente Pazienti PT (Secondi) Media Normale (Secondi) PTR ISI INR A B C D E

60 La Tromboplastina Influenza il PT Ratio e INR Tromboplastina Reagente Pazienti PT (Secondi) Media Normale (Secondi) PTR ISI INR A B C D E

61 Vantaggi dell INR Univoca quantificazione del livello di anticoagulazione Normalizzazione della variabilità fra diversi lotti di tromboplastine Possibilità di movimento dei pazienti Possibilità di un linguaggio comune fra i Centri Definizione dei range terapeutici ottimali per le diverse patologie

62 Tempo di protrombina (PT) INR Sistema messo a punto solo per gli anticoagulati Non sarebbe da usare per gli altri pazienti perché può dare false certezze e perché non è sicuro che la correzione dell ISI in realtà non accentui l errore invece di correggerlo nei pazienti non anticoagulati Meno problemi se la tromboplastina ha ISI vicino a 1 Un INR specifico per gli epatopatici non è proponibile perché non si sa come impiegare epatopatici omogenei e confrontabili come si fa per gli anticoagulati quando si calcola l ISI NB Indice MELD per valutare indicazione a trapianto fegato usa INR!!! con possibile valutazione disomogenea dei pazienti a seconda del laboratorio che esegue PT

63 Controllo finale della coagulazione

64 FIBRINOLISI XII, PK tpa upa plasminogeno plasmina fibrina DD

65 Degradazione Plasmina Fibrinogeno Crosslinked fibrina D E D D E D D E D D E D D D

66 Cause di D-dimero elevato Fibrinogeno Fibrina D-dimero Aumentata formazione fibrina Aumentata fibrinolisi Diminuita clearance

67 Elevati livelli di D-dimero Invecchiamento Gravidanza Infiammazione Infezione Tumore Tromboembolia venosa Danno Cardiaco Congestizia Danno Coronarie Infarto miocardio Post-chirugico

68 EMOSTASI Equilibrio coagulo litico PROTEGGE TROMBOSI PROTEGGE EMORRAGIA Sangue Endotelio Tessuto Subendotelio

69 VALUTAZIONE DEGLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE Metodi immunologici e funzionali Variazione fisiologiche ( gravidanza) Influenze farmacologiche (es: estroprogestinici, antivitamine k)

70 I Fibrinolitici Il coagulo è una struttura stabile, la sua dissoluzione avviene attraverso l intervento di specifiche proteine. La plasmina viene attivata ad opera del fattore di attivazione tissutale del plasminogeno (t-ap) La plasmina dissolve la fibrina del coagulo e inattiva la conversione del fibrinogeno in fibrina Altre capacità comprendono un inibizione dei fattori VIII, V e XII Il t-ap non è un unico fattore, sono piuttosto una serie di proteasi liberate da elementi delle vie estrinseca, ma soprattutto intrinseca

71 Gli inibitori della coagulazione Fisiologicamente tendono a prevalere sui sistemi coagulativi e li contrastano una volta innescati. Sono: SISTEMA PROTEINA C Agisce sul F. VIIIa -via intrinseca- e sul F.Va -che ampifica l attività del F.Xa-

72 ANTITROMBINA III Agisce inibendo i F. X, IX e XII liberi, non riuscendo ad arrivare agli stessi una volta complessati. Il suo ruolo quindi è quello di limitare il processo coagulativo alla sede di danno. La sua attività, di per sé trascurabile, è grandemente aumentata dall EPARINA

73 IL TFPI tissue factor pathway inhibitor Il TFPI è in grado di regolare l attivazione della via intrinseca secondo una rezione di tipo sì-no In caso di insufficiente FT la sua azione inibitoria sul complesso VIIa-TF evita la necessaria conversione di F.X affinchè il meccanismo si autosostenga. Se gli stimoli attivatori sono oltre una carta soglia il TFPI non modifica o rallenta in alcun modo il processo

74 TROMBOFILIE EREDITARIE La trombofilia identifica una tendenza a sviluppare alterazioni trombosi del sistema conseguenti coagulativo fibrinolitico su base ereditaria o acquisita ad o

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77 TROMBOFILIE EREDITARIE Riconoscono una modalità di trasmissione genetica di tipo autosomico dominante Si caratterizzano per episodi di trombosi prevalentemente venosi Assenza di fattori di rischio Esordio della trombosi in età giovanile (al di sotto di 40-50aa) Gli episodi di trombosi tendono a recidivare E spesso presente una storia familiare Aborti ripetuti e/o feti nati morti

78 Fattore V di Leiden(G1691A) (arginina 506 è sostituita con ac.glutammico-cromosoma cromosoma 1) Presente solo negli individui caucasici Prevalenza del 2-15% (40% in pts con trombosi) Rischio di TVP 5-8% negli eterozigoti, negli omozigoti Incidenza annua di TVP 0.19%-0.67% 0.67% Gravidanza, contraccettivi orali, chirurgia minore, viaggi prolungati, malattie intercorrenti Frequente esordio dopo i 45 aa

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80 Via intrinseca Via estrinseca Superficie di contatto XII XIIa XI XIa Membrana delle piastrine IX IXa + VIII Complesso protrombinasico X Xa lesione TF + VIIa Membrana delle piastrine + PS Va Leiden Proteina C Attivata + PS Va Protrombina Trombina

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82 MANIFESTAZIONI CLINICHE TVP degli arti inferiori con o senza embolia polmonare (circa 40% dei casi) Trombosi venose superficiali, del circolo splancnico e cerebrali sono più rare Le trobofilie ereditare sono responsabili di circa il 40% delle TVP non provocate da fattori acquisiti Le trombosi arteriose possono associarsi a protrombina G20120A nei soggetti giovani e all iperomocisteinemia

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84 ALTRI FATTORI DI RISCHIO I difetti combinati (fattorev+g20120a) duplicano il rischio di TVP (20 volte) L iperomocisteinemia lieve+ fattore V o G20120A aumentano il rischio di 20/50 volte Aplotipo HR2 omozigote del fattore V costituisce una causa di resistenza della proteina C attivata (rischio del 5%) Aumentati livelli di fibrinogeno fattore VIII fattore IX e fattore XI, inibitore della fibrinolisi trombino attivabile (TAF1)

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