71 CONGRESSO VERONA 2/5 GIUGNO VINO: LE NUOVE FRONTIERE DELLA RICERCA E DELLA COMUNICAZIONE N 5

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1 71 CONGRESSO VERONA 2/5 GIUGNO VINO: LE NUOVE FRONTIERE DELLA RICERCA E DELLA COMUNICAZIONE N 5 MAGGIO MILANO - VIA PRIVATA VASTO, 3 - TEL FAX POSTE ITALIANE SPA - SPEDIZIONE IN ABBONAMENTO POSTALE 70% LO/MI N 5

2 LE 3Q IN FERMENTAZIONE ALCOLICA: QUALE, QUANTO E QUANDO DELLA NUTRIZIONE AZOTATA La gestione della nutrizione del lievito nel corso della fermentazione richiede un attenta valutazione dei suoi fabbisogni sulla base delle caratteristiche dei mosti, la scelta dei nutrienti più adatti e l identificazione dei momenti migliori per la loro aggiunta. Applicando una filosofia di uso ragionato delle biotecnologie, HTS enologia ha sviluppato il modello delle 3Q, il Quale, Quanto e Quando dei nutrienti azotati, che mette a disposizione del produttore le conoscenze, i prodotti e gli strumenti per raggiungere l obiettivo della Q più importante, quella della Qualità. Di Luigi Scavone HTS enologia - Titolare Diego De Filippi HTS enologia - Technical and R&D Manager Fabrizio Ghinolfi HTS enologia - Executive Sales Manager Etienne Dorignac Fermentis - Fruit Fermentations Technical Manager (Da sinistra nella foto) INTRODUZIONE Come tutti gli organismi viventi i lieviti Saccharomyces cerevisiae hanno bisogno, per la loro crescita e il loro metabolismo, di nutrienti in forma di fonti di carbonio (gli zuccheri che vengono trasformati in alcol e CO 2), di azoto, di macro e microelementi, oltre che di vitamine come fattori di crescita e di lipidi e steroli come fattori di sopravvivenza e di ossigeno per la loro sintesi. La disponibilità di macro e micronutrienti e la possibilità di gestione e controllo di ognuno di questi fattori consente il regolare svolgimento della fermentazione alcolica, evitando il rischio di rallentamenti o arresti, ma è al contempo alla base dei processi metabolici che portano alla definizione di molti dei fattori della qualità dei vini, come la sintesi e la trasformazione dei composti aromatici, la produzione di polisaccaridi e di altre molecole organoletticamente attive. Il contenuto in azoto dei mosti utilizzabile dai lieviti, l Azoto Prontamente Assimilabile (APA), come anche il rapporto tra azoto in forma inorganica (FAN) e azoto organico N 5 MAGGIO

3 in forma amminoacidica (FON), variano in funzione della varietà, del grado di maturazione, del loro stato sanitario, delle pratiche colturali e dell andamento stagionale. La Ricerca e Sviluppo di HTS enologia da anni studia, in collaborazione con gli istituti di ricerca e le aziende produttrici di biotecnologie e tecnologie con le quali collabora, i prodotti e i protocolli più adatti per la nutrizione del lievito, con l obiettivo di identificare le forme, i momenti e i quantitativi ideali per ogni fermentazione alcolica. Fig. 1 - La forma fisica degli autolisati influisce sulle loro performance fermentative e sulla capacità di assimilazione dei lieviti. Nella Fig. 1a si osservano le differenze nella cinetica fermentativa tra l aggiunta di uno stesso autolisato formulato in forma di polvere fine o di polvere microgranulata. Nella Fig 1b e nella Fig. 1c la comparazione è tra un autolisato microgranulato e lo stesso prodotto in forma liquida. L effetto positivo del secondo prodotto si osserva sia sulla cinetica sia sulla popolazione dei lieviti. Fig. 1a: velocità di fermentazione - cinetica QUALE NUTRIENTE AZOTATO? Il lievito è in grado di assimilare e utilizzare nella sintesi proteica l azoto inorganico, in forma di ione ammonio e gli alfa-amminoacidi (ovvero tutti gli amminoacidi presenti nel mosto con l eccezione della prolina). Sebbene i sali di ammonio, come il fosfato biammonico (DAP), rappresentino la soluzione più economica per il produttore e quella più facilmente assimilabile per la cellula, la fonte più nobile di azoto, con la quale il mosto in fermentazione si arricchisce in precursori aromatici, è quella data dagli amminoacidi presenti nella stessa cellula del lievito. L uso dei derivati del lievito e la scelta tra questi di quelli più adatti, consente inoltre di arricchire il mosto in tutti quei fattori nutritivi, vitamine, microelementi e fattori di sopravvivenza come steroli e acidi grassi insaturi della membrana cellulare, ugualmente necessari per un regolare svolgimento della fermentazione. Tra i derivati del lievito tuttavia esistono molte differenze e, a seconda dei metodi di produzione, di frazionamento e di purificazione applicati e della forma fisica con la quale sono proposti, essi variano la propria azione e bio-disponibilità nella fermentazione alcolica. Fermentis Gruppo Lesaffre for beverage, partner di HTS enologia, leader nella produzione di biotecnologie destinate al settore enologico, in particolare per la nutrizione del lievito, detiene un avanzato know how nella produzione dei derivati di lievito più adatti per ogni applicazione nel campo enologico e non solo. I prodotti nei quali sono presenti tutte le strutture cellulari comprese quelle degli in- Fig. 1b: Velocità di fermentazione - cinetica Fig. 1c: Popolazione di lieviti 88 N 5 MAGGIO 2016

4 volucri della cellula (membrana e parete cellulare) si distinguono dai prodotti nei quali sono invece presenti solo le pareti (scorze di lievito) o solo il contenuto citoplasmatico (estratto di lievito). Lieviti inattivi e autolisati, conformi al Codex enologico, appartengono al gruppo dei prodotti ove è presente sia l involucro esterno che il contenuto citoplasmatico. Il solo contenuto citoplasmatico (estratto di lievito totalmente solubile), non può essere impiegato in enologia in quanto non conforme al Codex enologico. Tra i nutrienti più completi, utilizzabili nella nutrizione azotata del lievito, ci sono gli autolisati, nella cui composizione sono presenti sia le parti solubili del citoplasma che le scorze insolubili della parete e i composti lipidici della membrana cellulare. Il processo di produzione degli autolisati prevede un primo trattamento termico per inattivare il lievito e, successivamente, ulteriori trattamenti termici a temperatura controllata, che consentono agli enzimi endogeni della cellula, come ad esempio le proteasi, di degradare il contenuto cellulare fino alla liberazione degli amminoacidi che, assieme ad altri elementi della costituzione citoplasmatica, possono essere assimilati dal Saccharomyces cerevisiae nel corso della fermentazione alcolica. La scorza e la membrana cellulare costituiscono tra il 28 e il 35% del peso secco di un autolisato. La loro funzione è fondamentale in quanto la scorza adsorbe le molecole tossiche o solforate, mentre la membrana cellulare apporta acidi grassi insaturi e steroli, sintetizzabili altrimenti dal lievito solo in presenza di ossigeno, necessari per la sopravvivenza e la resistenza ai fattori critici di temperatura e grado alcolico. Le forme fisiche più comuni dei derivati del lievito proposti sul mercato sono le polveri composte da particelle fini comprese tra i 50 e gli 80 micron. La nuova gamma di derivati di lievito Easy to Use (E2U), sviluppata da Fermentis in collaborazione con HTS enologia, propone sia dei microgranulati che un innovativo autolisato in forma liquida (Viniliquid). Il comportamento fisico in acqua dei derivati di lievito in polvere fine e dei micro granulati è diverso: i primi sono tendenzialmente idrofobi, tendono a formare grumi e a disperdersi con maggiore difficoltà rispetto ai secondi che, al contrario sono igroscopici, si disperdono nel liquido in modo omogeneo e non formano grumi. L autolisato totale Viniliquid si presenta in forma liquida e mantiene la sua sospensione omogenea stabile nel tempo, nonostante la presenza sia della parte solubile che delle scorze insolubili. Questo diverso comportamento influisce sulla distribuzione nel mosto in fermentazione e quindi sulla velocità e capacità di assimilazione da parte dei lieviti. Le prove svolte su mosto sintetico e su mosto naturale dimostrano come le prestazioni fermentative dei lieviti, sia nel caso di utilizzo dei nutrienti in forma micro granulata che dell autolisato in forma liquida, siano migliori rispetto a quelle ottenute con prodotti in polvere. Le differenze sono evidenti per quanto riguarda i prodotti Easy to Use (E2U) che hanno un effetto migliore sulla popolazione dei lieviti e sulla loro vitalità. (Figg. 1a, 1b, 1c). QUANTO AZOTO PER OGNI FERMENTAZIONE? La quantità di nutrienti azotati da utilizzare, come anche il fabbisogno in fattori di sopravvivenza necessari per il regolare svolgimento della fermentazione, variano in funzione della disponibilità di composti azotati, in forma organica (FON - Free Organic Nitrogen) e inorganica (FAN Free Ammoniacal Nitrogen), presenti nei mosti ed espressi con la misura dell APA (Azoto Prontamente Assimilabile), ma anche dell impegno richiesto ai lieviti per portare a termine il consumo degli zuccheri, e pertanto della concentrazione dei mosti. Sebbene gli studi realizzati negli ultimi decenni riportino spesso una soglia minima di APA di mg/l, occorre ricordare che per mosti molto concentrati come quelli ai quali gli andamenti climatici degli ultimi anni ci stanno abituando questi valori devono necessariamente essere rivisti e adeguati, tenendo conto anche delle differenze nei fabbisogni nutrizionali esistenti tra i diversi ceppi di Saccharomyces cerevisiae. (Bisson et al., 2000) Si parla di Dose Necessaria (DN) per esprimere la quantità minima di azoto necessaria al lievito per condurre regolarmente la fermentazione alcolica. Gli studi realizzati in anni di ricerca ed esperienza hanno portato HTS enologia a definire tale dose espressa in mg/l di APA come il prodotto tra la concentrazione in zuccheri e un coefficiente di 0,8 e di stabilire che il rapporto ideale tra azoto organico e azoto inorganico nella composizione della DN sia di 2/3 del primo e 1/3 del secondo. Zuccheri (g/l) x 0,8 = mg/l APA (66,6% FON + 33,3% FAN). Fig. 2 - La velocità di fermentazione (variazione di CO 2 prodotta nell unità di tempo) è la grandezza più adatta a descrivere la cinetica fermentativa nelle diverse fasi di sviluppo e attività del lievito N 5 MAGGIO

5 QUANDO AGGIUNGERE AZOTO IN FERMENTAZIONE? BIONICA, LA SOLUZIONE INTELLIGENTE Fig. 3 - Comparazione tra una strategia con aggiunte di nutriente frazionate all inizio, metà e 2/3 della fermentazione (in alto) e la gestione della nutrizione con Bionica, con dosaggio automatico e continuo nei momenti ideali di Viniliquid e della macro-ossigenazione Le ricerche svolte soprattutto all INRA di Montpellier da Jean Marie Sablayrolles (Sablayrolles et al, 1996) e da Jean Michel Salmon (Rosenfield et al., 2003) hanno messo in evidenza l importanza del momento di aggiunta dei nutrienti azotati e dell ossigeno in funzione della fase fisiologica e metabolica del lievito nel corso della fermentazione. La velocità di fermentazione, espressa in quantità di anidride carbonica prodotta o di zuccheri consumati istantaneamente nell unità di tempo, è la grandezza più adatta a descrivere le fasi che caratterizzano il processo, dalla latenza alla fase esponenziale di crescita, dalla fase stazionaria fino alla chiusura della fermentazione, e a identificare i momenti nei quali le aggiunte di nutrienti risultino più efficaci (Fig.2). In modo particolare fin dai primi studi dei ricercatori francesi, era emerso con evidenza come l azoto presente all inizio della fermentazione non influenzasse la capacità dei lieviti di portare a termine il consumo degli zuccheri, ma solo la durata della fase di latenza e quindi del periodo di avvio della fermentazione, la fase di crescita e il picco di massima velocità fermentativa, come anche il numero di generazioni e lo sviluppo di calore legato all attività dei lieviti (di conseguenza il fabbisogno di frigorie necessarie per il controllo della temperatura di fermentazione). Pertanto, nel mosto o nella prima fase della fermentazione alcolica è consigliabile utilizzare un derivato di lievito (autolisato parziale) che oltre all azoto, apporti un importante quantità di fattori di crescita, sopravvivenza, vitamine e sali minerali. Nella fasi successive della fermentazione è consigliabile invece, utilizzare un derivato di lievito (autolisato totale) con una maggiore concentrazione in azoto, elemento determinante per la corretta gestione della fermentazione, per evitare rischi di rallentamento e ottenere dal metabolismo dei lieviti la massima qualità desiderata. Il periodo di maggiore efficacia per il dosaggio dell ossigeno necessario al lievito per la sintesi di acidi grassi insaturi e steroli, indispensabili per mantenere efficiente l attività della membrana cellulare, corrisponde al momento nel quale il lievito, raggiunta la massima velocità fermentativa passa dalla fase di crescita esponenziale a quella cosiddetta stazionaria. Il momento ottimale per l aggiunta dei nutrienti azotati corrisponde invece, a circa 1/3 del consumo degli zuccheri o allo sviluppo di 35 g/l di CO 2 di fermentazione (Biondi Bartolini, 2007). Nella pratica più comune il controllo del processo fermentativo si realizza con la misura periodica, generalmente giornaliera, della densità del mosto, che varia e decresce in funzione del suo contenuto in zuccheri (Scrinzi, 2007). Le curve della velocità di fermentazione e l identificazione dei punti tipici e dei momenti più adatti per le aggiunte di azoto e ossigeno delle quali abbiamo parlato tuttavia non sono monitorabili con misure discontinue e periodiche, e richiedono invece misure precise e frequenti su un parametro di processo adatto ad essere rilevato in modo continuo e automatico. BIONICA, l ultima innovazione nata dalla ricerca di HTS enologia in collaborazione con Parsec srl, premiata nell Innovation Challenge Lucio Mastroberardino a SIMEI 2015, è un sistema intelligente che al monitoraggio in continuo della fermentazione alcolica di ogni serbatoio, realizzato misurando la sovrappressione generata dal rilascio di anidride carbonica, associa il dosaggio automatico attraverso una canna di iniezione a doppia 90 N 5 MAGGIO 2016

6 uscita dell ossigeno e dell autolisato totale in forma liquida Viniliquid. Il sistema ADCF (Analisi Dinamica della Fermentazione Alcolica), grazie a un sistema di sensori applicati sul chiusino di ogni serbatoio e al software sviluppato sulla base di una serie di algoritmi definiti e validati sperimentalmente, permette di identificare con precisione i momenti chiave per la nutrizione e l ossigenazione sulle curve di fermentazione prodotte in tempo reale e consultabili anche in remoto. Con BIONICA è possibile intervenire in modo automatico, nei tempi più adatti, con il dosaggio dell ossigeno e dell autolisato Viniliquid nelle dosi definite sulla base delle caratteristiche del mosto, senza il rischio di perdere i momenti di maggiore efficacia in qualunque istante essi si verifichino (Biondi Bartolini, 2015). Il sistema BIONICA si applica a tutti i serbatoi di fermentazione, indipendentemente dalle dimensioni e, nella versione speciale Spark, alle autoclavi per la gestione delle fasi di presa di spuma nella produzione dei vini frizzanti e spumanti ottenuti con metodo Charmat o Martinotti. I vantaggi del dosaggio automatico di Viniliquid con il sistema BIONICA sono stati messi in evidenza nelle numerose prove comparative realizzate. Nella fermentazione di un mosto di Trebbiano in due serbatoi da 2000 hl (Fig. 3) sono state ad esempio valutate le differenze nell andamento fermentativo tra il sistema di dosaggio automatico di Viniliquid e della macro-ossigenazione realizzati in continuo con BIONICA e l apporto di dosi puntuali di nutrienti azotati frazionate tra la fase di avvio, la metà e i 2/3 della fermentazione alcolica. I risultati hanno messo in evidenza come l aggiunta continua nei momenti di maggiore efficacia di Viniliquid e di ossigeno, consenta Fig. 4 - Effetto dell applicazione del sistema Bionica (in basso) sul consumo degli zuccheri e la popolazione dei lieviti nella presa di spuma in comparazione con una gestione standard di nutrizione e ossigenazioni (in alto) alla velocità di fermentazione di mantenersi a valori più elevati anche nelle fasi che seguono il picco di velocità massima, portando in tal modo a un consumo più rapido degli zuccheri e a una chiusura più regolare. In rifermentazione (Fig. 4) è stata realizzata una comparazione di due autoclavi da 300 hl gestite nella presa di spuma per la produzione di un vino spumante, la prima in modo tradizionale con aggiunte di nutrienti e ossigeno al momento del riempimento e la seconda con il sistema BIONICA SPARK, mediante aggiunte puntuali e programmate, sulla base dell andamento di degradazione degli zuccheri. La prova ha evidenziato una maggiore velocità e regolarità di quest ultima nel raggiungere il contenuto in zuccheri residui finale desiderato. L analisi microbiologica ha consentito di spiegare come questo diverso comportamento nell andamento fermentativo sia legato alla popolazione dei lieviti che nella seconda autoclave si sono mantenuti più vitali anche nelle fasi finali della fermentazione. BIONICA, chiude quindi con un applicazione di altissima tecnologia il cerchio del modello delle 3Q e fornisce al tecnico uno strumento efficace, di semplice utilizzo e totalmente automatico, che si integra perfettamente nella filosofia Easy to Use (E2U), per la quale le innovazioni tecnologiche e biotecnologiche devono ottimizzare e semplificare le operazioni di cantina rendendole sostenibili, garantendo altissimi standard qualitativi, efficienza, sicurezza, e riducendo al minimo il rischio di errori. BIBLIOGRAFIA Sablayrolles J.M., Dubois C. Manginot C., Roustan J.L., Barre P., Effectiveness of combined ammoniacal nitrogen and oxygen additions for completion of sluggish and stuck wine fermentations. J. Ferm. Bioeng. 82: Rosenfeld E, Beauvoit B, Blondin B, Salmon JM., 2003, Oxygen consumption by anaerobic Saccharomyces cerevisiae under enological conditions: effect on fermentation kinetics. Appl Environ Microbiol Jan;69(1): Bisson L., Butzke C., 2000, Diagnosis and Rectification of Stuck and Sluggish Fermentations Am. J. Enol. Vitic : Biondi Bartolini A., Lievito e azoto in primo piano. VQ, 4, 2007: Scrinzi C Nutrizione azotata: una case history. VQ, 4, 2007: Biondi Bartolini A. Fermentazione alcolica e rifermentazione smart. Vignevini, 6, N 5 MAGGIO