Lo Stato dell Arte della Diagnostica Immunoematologica: Criticità, Innovazione e Sicurezza

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1 Competenza, Professionalità e Sicurezza: PROGRAMMI EDUCAZIONALI IN IMMUNOEMATOLOGIA Ospedale S. Camillo Roma, 26 Marzo 2015 Lo Stato dell Arte della Diagnostica Immunoematologica: Criticità, Innovazione e Sicurezza Antonella Matteocci UOC SIMT - Laboratorio di Immunoematologia Eritro-Piastrinica

2 Argomenti Introduzione Storia naturale degli anticorpi e implicazioni cliniche Tecnologie Automazione Test di Coombs Diretto Biologia Molecolare Antigene RhD e MEN (D-Variant, cffdna, EFM) Titolazione ABO Conclusioni Diagnostica Immunoematologica Roma,

3 Diagnostica Immunoematologica Pre-trasfusionale Pazienti Immunoematologia sierologica di II livello Qualificazione Emocomponenti Registro e Banca Gruppi Rari LABORATORIO DI IMMUNOEMATOLOGIA I e II LIVELLO Globuli Rossi Piastrine Monitoraggio ABO trapianti Diagnostica AEA Indagini finalizzate alla prevenzione e gestione della MEFN Diagnostica immuno-piastrinica Immunoematologia molecolare

4 Diagnostica immunoematologica Evoluzione delle Tecnologie in Immunoematologia Biologia molecolare sistemi G-E/HPA Genotipizzazione RHD fetale da plasma materno Nuove Tecnologie Sierologiche e Automazione Diagnostica Immunoematologica Roma,

5 Diagnostica immunoematologica Sistemi Gruppo-Ematici 339 antigeni 296 antigeni appartenenti a 34 Sistemi (ISBT) 19 antigeni appartenenti a Collezioni (ISBT) 24 antigeni appartenenti a Serie (ISBT) 46 geni alleli Blood Group Antigen Gene Mutation Database (dbrbc) aggiornato al 23 Marzo 2015

6 STORIA NATURALE DEGLI ANTICORPI E IMPLICAZIONI CLINICHE Diagnostica Immunoematologica Roma,

7 Diagnostica immunoematologica SIGNIFICATIVITA CLINICA Generalmente Clinicamente Significativi A volte Clinicamente Significativi Clinicamente non Significativi se non reagiscono a 37 C Generalmente clinicamente non significativi A e B At a A 1 HLA/Bg Rh Colton H Ch/Rg Kell Cromer Le a Cost Kidd Dombrock Lutheran JMH Duffy Gerbich M, N Knops S, s, U Indian P1 Le b P, PP1P k Jr a Sd a Xg a Vel H in O h Diego Lan LW Scianna Yta Clinicamente significativi A volte significativi Raramente significativi

8 % RBC ANTIBODY PERSISTENCE Schonewille H, Transfusion 2000 D e t e c t a b l e Anti-C Anti-D Sistema Rh A n t I b o d i e s Anti-c Months after first detection Anti-E

9 % D e t e c t a b l e A n t I b o d i e s Anti-Jk RBC ANTIBODY PERSISTENCE Schonewille H, Transfusion 2000 Anti-K Anti-Fy Months after first detection Altri sistemi Anti-S

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11 Diagnostica immunoematologica FATALITIES REPORTED TO FDA FOLLOWING BLOOD COLLECTION AND TRANSFUSION DHTR, 1:6,000 DHTR fatali, 1:400,000 Annual Summary for Fiscal Year 2013 /

12 Diagnostica immunoematologica Serious Hazards of Transfusion (SHOT) Bolton-Maggs P, Cohen H, Watt A et al: Annual SHOT report

13 SISTRA SISTEMA INFORMATIVO DEI SERVIZI TRASFUSIONALI Centro Nazionale Sangue Regione Lazio Anni Reazioni Trasfusionali Emolisi immunologica Emolisi non immunologica Infezioni trasmesse Altre reazioni trasfusionali Trasfusione non corretta senza esiti clinici 2012 N N. Totale N. Totale % 1 3 * Totale *N.1 sintomatologia lieve; N.3 Necessità di intervento terapeutico

14 Diagnostica immunoematologica IMMUNOGENICITA SISTEMI GRUPPO-EMATICI CA Tormey, Blood 2009 c 70% D E K e k s Jkb 0,01% Jka S C Fya H Schonewille, Transfusion 2006 GIBLETT EQUATION, 1961

15 TECNOLOGIE IN IMMUNOEMATOLOGIA

16 Diagnostica immunoematologica

17 Diagnostica immunoematologica Requisiti di un Sistema Diagnostico Sensibilità Specificità Costi VPP VPN Efficienza Facilità d uso Turnaround time Riproducibilità Diagnostica Immunoematologica Roma, Immunohematology, 2013

18 Diagnostica immunoematologica INNOVAZIONE E METODI DIAGNOSTICI SPRCA CAT Provetta Sensibilità Provetta CAT Specificità SPRCA Diagnostica Immunoematologica Roma,

19 Diagnostica immunoematologica Sensibilità nello screening anticorpale The authors tested 368 samples containing antibodies of clinically significant specificities Method Tube LISS IAGT DiaMed-ID Ortho BioVue Bio-Rad Scangel CLB Mast Cell-Bind Biotest Solid Screen Immucor Capture- R Sensitivity 43.2% 93.5% 90.5% 94.6% 94.0% 89.7% 97.3% Diagnostica Immunoematologica Roma,

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21 DG Gel Grifols Diamed ID Ortho BioVue Volume emazie test 50µl 50µl 50µl Volume siero campione 25µl 25µl 40µl Tempo incubazione 37 C 15 min 15 min 10 min Tempo centrifugazione 9 min 10 min 5 min Diagnostica Immunoematologica Roma,

22 AUTOMAZIONE IN IMMUNOEMATOLOGIA Diagnostica Immunoematologica Roma,

23 Diagnostica immunoematologica AUTOMAZIONE E SICUREZZA Identificazione Campioni e Reagenti Standardizzazione Metodiche, Lettura e Interpretazione Tracciabilità Risultati, User, Lotti Reagenti Diagnostica Immunoematologica Roma,

24 Piattaforme Analitiche in Immunoematologia Tecnologia Astra Formedic A. De Mori Micropiastra EMT Biorad Diamed CAT Micropiastra Fase solida Grifols Immucor Ortho Clinical Diagnostics CAT Microarray Micropiastra SPRCA Microarray CAT Analizzatori Media Elevata Produttività Caricamento N.campioni Nuovi strumenti Biologia Molecolare Diagnostica piastrinica LIFE 2 Qwalys /544 Tango Infinity IH1000 WADiana Erytra Echo NEO Autovue Innova 120/180 48/96 20/ IH500 RHD Fetal kit Progenika Bioarray NEO Lifecodes Vision

25 Diagnostica immunoematologica Tecnologie e Apparecchiature nella Regione Lazio al Galileo/Neo Immucor 60% Tango Biorad 5% Qwalys Astra Formedic 5% Innova Ortho 55% Erytra Grifols 18% IH1000 Diamed 32% Diagnostica Immunoematologica Roma,

26 Integrazione Tecnologie Micropiastra Fase solida Agglutinazione su colonna Donatori Test 1 livello Pazienti Test 1 livello Pazienti/Donatori Test 2 livello Assegnazione Urgenze Diagnostica Immunoematologica Roma,

27 TEST DI COOMBS DIRETTO Diagnostica Immunoematologica Roma,

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29 Diagnostica immunoematologica LA BIOLOGIA MOLECOLARE IN IMMUNOEMATOLOGIA Diagnostica Immunoematologica Roma,

30 Diagnostica immunoematologica RAZIONALE Limiti sierologia Studio geni-alleli varianti ABO/RhD Bio-nanotecnologie (microarray) Piattaforme ad elevata produttività Diagnostica Immunoematologica Roma,

31 Diagnostica immunoematologica Limiti delle Tecniche Sierologiche Presenza di campi misti nei politrasfusi o trapiantati Difficoltà nella tipizzazione in pazienti con TAD + Utilizzo di alcuni sieri rari e costosi, scarsa reattività Difficoltà nella definizione di varianti ABO e/o RhD (discrepanze) Mancata definizione della D-zigosità Performance limitata per la tipizzazione estesa su larga scala

32 M E T O D I M O L E C O L A R I PCR-SSP PCR-RFLP Bassa Produttività Microarray MALDI-TOF MS SNaPshot Elevata Produttività PCR Real Time PCR SBT Media Produttività

33 Diagnostica immunoematologica Limiti della Biologia Molecolare SNP in regioni codificanti SNP in regioni non codificanti Gene non ancora scoperto Meccanismo molecolare complesso Mancanza alleli per gruppi etnici IL GENOTIPO NON E IL FENOTIPO

34 Diagnostica immunoematologica INTEGRAZIONE APPROPRIATA DELLE TECNOLOGIE Tecniche Sierologiche reference Tecniche Molecolari support REPORT FINALE LA GESTIONE DEI TEST MOLECOLARI RICHIEDE UNA EXPERTISE SPECIFICA ESECUZIONE PROFICIENCY TEST

35 Antigene RhD e MEN Diagnostica Immunoematologica Roma,

36 LA TIPIZZAZIONE RhD NELLA PREVENZIONE DELLA MEN Raccomandazioni MEN SIMTI 2014 MADRE NEONATO PADRE FETO DEFINIZIONE VARIANTI RHD DETERMINAZIONE DELLA D-ZIGOSITÀ PATERNA GENOTIPIZZAZIONE RHD FETALE DA PLASMA MATERNO (NIPD non invasive prenatal diagnosis) Diagnostica Immunoematologica Roma,

37 Diagnostica immunoematologica Varianti dell antigene RhD Genetica molecolare Espressione membrana Antisieri Tecnologie

38 D-variant a confronto: la realtà non è sempre come appare. VARIANTI N. SITI ANTIG/ EMAZIA Tutti Epitopi Presenti Produzione Ac anti-d Paziente Donatore Posizione Membrana Routine Typing Partial -D NO SI RhD NEG RhD POS Esterna NEG/POS Weak -D SI/NO NO/SI RhD NEG/ RhD POS RhD POS Interna POS/NEG DEL SI SI/NO RhD NEG/?? RhD POS Interna NEG Reid ME, Lomas-Francis C. The blood group antigen facts book, 3 nd ed. San Diego, USA, Elsevier Academic Press; 2012.

39 Diagnostica immunoematologica

40 Diagnostica immunoematologica D-variant Esoni Associazione con fenotipo Rh N. Siti Antigenici/ Emazia D-weak tipo 2 9 ce 500 DVI tipo1 4,5 ce DVI tipo2 4,5,6 Ce DVII 2 Ce Diagnostica Immunoematologica Roma,

41 Test D-weak e DEL ISBT 2011 Diagnostica Immunoematologica Roma,

42 Transfusion 2007 BJOG, Transfusion Medicine 2014 Prenatal Diagnosis 2014 Perché determinare il genotipo RHD fetale? Diagnostica prenatale non invasiva (NIPD) da plasma materno Raccomandazioni MEN SIMTI 2014 Individuare coppia madre D-neg/feto D-pos (in Italia circa RhD neg) Corretta gestione delle immunoglobuline anti-d in fase antenatale (28^ settimana) Gestione delle donne D-neg con anticorpo anti-d e partner eterozigote (valutazione D-zigosità) settimane: 3% DNA fetale (range: 0,4%-12%) settimane: 6% DNA fetale (range: 2,3%-11,4%)

43 Genotipizzazione RHD Fetale in Europa Finning K, et al Tiblad E, et al Clausen FB, et al Scheffer PG, et al Rouillac-Le Sciellour C, et al Pavia Roma

44 Diagnostica immunoematologica LIMITI DEL METODO: PCR REAL TIME Sensibilità % FALSI NEGATIVI (DNA fetale scarso) 0,05% (Transfusion 2013) Specificità 98-99% FALSI POSITIVI (contaminazioni, varianti RhD materne, chimerismo - cellule fetali di pregresse gravidanze) 1-2% (Vox Sanguinis, 2012) Mancanza di un Marcatore Fetale (marker epigenetico) Promoter del gene Maspin (SERPINB5) (Chim, 2005) _ Ipometilazione del DNA fetale (placenta) _ Ipermetilazione del DNA materno Promoter del gene RASSF1A (Chan, 2006) : Ipermetilazione del DNA fetale (placenta) Ipometilazione del DNA materno MASTER MEDICINA TRASFUSIONALE Firenze,

45 Diagnostica immunoematologica Valutazione EFM Diagnostica Immunoematologica Roma,

46 Diagnostica immunoematologica QUALE Post-partum: METODO 75% UTILIZZARE? UI 70% EFM dopo il parto, 30% per eventi dopo 20^ settimana Diagnostica Immunoematologica Roma,

47 TITOLAZIONE ABO Diagnostica Immunoematologica Roma,

48 Diagnostica immunoematologica Significato clinico degli anticorpi ABO Antigeni A e B sono oligosaccaridi presenti anche su cellule endoteliali ed epiteliali di rene, cuore, fegato, polmone e pancreas. MALATTIA EMOLITICA NEONATO TRASFUSIONE GLOBULI ROSSI TRASFUSIONE PLASMA/PIASTRINE Incompatibilità Maggiore Incompatibilità Minore TRAPIANTO CSE TRAPIANTO ORGANI SOLIDI (RENE) Diagnostica Immunoematologica Roma,

49 Diagnostica immunoematologica Trapianto di Rene ABOi: titolo 10% trapianti da vivente Migliore sopravvivenza a lungo termine 25-30% incompatibilità ABO/HLA Titolo anti-a1 e anti-b: 8 (titolo sicuro ), 32 Titolo anti-a1 e anti-b: 128 (bassa sopravvivenza) Jordan et al, 2009 Crew et al, 2010 Shimmura et al, 2007 Tobian et al, 2010 Programmi di desensibilizzazione Alto rischio immunologico: elevato titolo iniziale, 2 trapianto, rebound post-plasmaferesi Montgomery et al, 2009 Accomodation Incompatibilità per antigene A2: a rischio minore Stegall et al, 2004

50 Quando eseguire il titolo nel trapianto di rene ABOi? TITOLAZIONE PRE-TRAPIANTO - 1 mese Plasmaferesi TITOLAZIONE POST-TRAPIANTO (OSPEDALIZZATO) Ogni giorno 3 gg/settimana 15gg TITOLAZIONE POST-TRAPIANTO (AMBULATORIALE) 2 /gg settimana 15gg 1 g/settimana 1 g/mese Diagnostica Immunoematologica Roma,

51 Diagnostica immunoematologica TRAPIANTO DI CSE: INCOMPATIBILITA ABO Minore 20-25% Maggiore 20-25% Bidirezionale 5% Incompatibilità ABO 40-50% Daniel Johnson and Schwarz, 2011

52 Definition Major AB0 incompatibility: potential adverse consequences and recommended interventions Recipient isoagglutinins incompatible (anti-a, anti-b, anti-ab) with donor RBCs -Group A,B and AB donor and group O recipient - Group AB donor and group A or B recipient ABO Blood Type - RBC reduction if >30 ml RBC and/or if -Recipient isoagglutinin titers >32 - Transfuse ABO appropriate blood products - Immediate hemolysis - Delayed RBC engraftment - PRCA Potential Adverse Consequences Interventions Isoagglutinins removal before transplantation with PEX or immunoadsorption Daniel Johnson and Schwarz, 2011

53 Diagnostica immunoematologica LE VARIABILI NELLA TITOLAZIONE TECNOLOGIA END-POINT (weak+, 1+) EMAZIE NOTE (pool, singole, tipizzazione A1/A2) Diluente, % GR, rapporto plasma/gr, t incubazione OPERATORE PIPETTE PUNTALI APPARECCHIATURE

54 VARIABILITA TRA LABORATORI 2003: 29 LABORATORI GIAPPONESI 2004: 38 LABORATORI GIAPPONESI 30 LABORATORI GIAPPONESI: COMPARAZIONE 4 TECNOLOGIE - CITOFLORIMETRIA 3 LABORATORI EUROPEI: 3 DIFFERENZE CON METODO IN HOUSE, 1 CON METODO IN GELRIPRODUCIBILITA

55 VARIABILITA E METODO STANDARD 35 LABORATORI AMERICANI END POINT PROVETTA: weak+ END-POINT GEL-CARD:1+ GEL-CARD RIDUCEVA LA VARIABILITA SE COMPARATA ALLA PROVETTA

56 Conclusioni - 1 Screening e Identificazione anticorpale TCD Definizione status RhD Valutazione EFM Diagnostica Molecolare Titolazione ABO Trapianti VANTAGGI E LIMITI DELLE TECNOLOGIE IN USO Diagnostica Immunoematologica Roma,

57 Punti di Forza delle Tecnologie Tempi brevi di esecuzione test Specificità Specificità Utilizzo 8 colonne Sensibilità Ac a basso titolo - DEL Diagnostica Immunoematologica Roma,

58 CONCLUSIONI - 2 Sistemi e Metodi Diagnostici Competenze del Personale Programmi EQA Sicurezza Trasfusionale

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