ESTRAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI FRAZIONI FLAVONICHE DA PASTAZZO DI BERGAMOTTO
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- Giorgina Locatelli
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1 ESTRAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI FRAZIONI FLAVONICHE DA PASTAZZO DI BERGAMOTTO D. Castaldo *, A. Pirrello, F. Siano, D. Cautela Stazione Sperimentale per le Industrie delle Essenze e dei Derivati dagli Agrumi Via Gen. Tommasini, Reggio Calabria, Italy ( * )autore per la corrispondenza, castaldo@calnet.it Introduzione I flavonoidi glucosidici rappresentano una classe di sostanze oggetto di un crescente interesse sia per le loro proprietà antiossidanti (Benavente-Garcìa et al. 1997, Luximinon-Ramma A.et al ) sia come substrato per la produzione di dolcificanti ipocalorici (Horowitz et al Di Giacomo et al,1991). In particolare i diidrocalconi ottenuti per idrogenazione catalìtica della naringina e della neoesperidina, principali flavonoidi glucosidici presenti nel bergamotto, hanno un potere edulcorante rispettivamente pari a 300 e 1100 volte quello del saccarosio (Horowitz et al Di Giacomo et al,1991). Lo scopo della prima fase di questo progetto riguarda l'estrazione di frazioni flavonoiche da pastazzo di bergamotto mediante l'utilizzo di miscele idroalcoliche, al fine di trarre indicazioni di processo, di valutare e ottimizzare i parametri chimico fisici utili ad uno scalig-up del processo estrattivo. Materiali e metodi Campioni - II pastazzo impiegato per le prove di estrazione proveniva dalla campagna agrumaria Il pastazzo è stato cubettato a 1 cm 3 di dimensione e suddiviso in aliquote di 2 Kg, subito congelale e conservale a -28 C. Un aliquota è stata scongelala per ciascun esperimento, o serie di esperimenti e su ogni aliquota è stato determinato il residuo secco medio del pastazzo 1
2 secondo il metodo MUACV. Estrazione con miscele idroalcoliche - Sono state testate miscele estraenti a vari rapporti volumetrici (Metanolo Acqua: 60/40, 70/30 Etanolo Acqua: 60/40, 70/30). Le estrazioni sono state condotte in triplice, a diversi tempi (2, 6, 12 e 24 ore) in contenitori a chiusura ermetica, sotto agitazione e a temperatura ambiente. I rapporti pastazzo-miscela estraente impiegati sono stati 1:1;1:5 e 1:10. Ogni singola estrazione è stata condotta su un aliquota di 50g di pastazzo. Gli estratti idroalcolici sono stati opportunamente filtrati, portati a secco con RotaVapor mod. Buchi E 111 e risolubilizzati in tampone ACN-fosfato 0,25M (Tampone B). Il pastazzo esausto è stato riestratto a caldo con 50mL di N,N dimetilformammide, sotto agitazione per 5 ore a 200 rpm, successivamente filtrato e portato al volume di 100 ml con acqua bidistillata per la determinazione della resa estrattiva. Sugli estratti sono stati caratterizzati quali-quantitativamente i flavonoidi glucosidici mediante cromatografìa liquida ad alle pressioni utilizzando un HPLC capillare Mod- Surveyor della ThemoFinnigan. Le condizioni cromatografiche adottate sono riportate in tabella 1. Volume iniezione Colonna Lunghezza d onda analitica Flusso Gradiente di eluizione Fase Mobile 5 L C 18 l50x3mm (Phenomenex) 287 nm 500 L/min tempo min. % eluenti Gli standard dei flavonoidi glucosidici sono stati reperiti Tampone A (KH 2PO 4 5mM ph 3.05) Tampone B %Tampone A 38% Tampone A- 42% Tampone B dalla Sigma-Aldrich (ACN:H 2O:H 2PO 4-70:26: L H 3PO 4 87%) % Tampone B 100% Tampone A e dalla Extrasynthese. Tab. 1: Condizioni cromatografiche adottate per l analisi HPLC degli estratti. L identificazione dei flavonoidi è stata effettuata in base ai tempi di ritenzione e la quantificazione è stata calcolata per integrazione dell'area dei picchi dei campioni e dei rispettivi standard mediante la costruzione di una retta di calibrazione. 2
3 Risultati e discussioni 2.00 Estrazione rapporto 1:1 - I neoeriocitrina naringina neoesperidina flavonoidi identificati negli estratti idroalcolici sono: Eriocitrina; 1.20 AU 1.00 Neoeriocitrina, Naringina, Esperidina e Neoesperidina. In eriocitrina esperidina figura 1 è riportato un tipico Time (min) Fig. 1: Profilo HPLC Flavonoidi glucosidici di unestratto idroalcolico da Pastazzo cromatogramma di un estratto idroalcolico. Come si nota da figura 2, aumentando i tempi di estrazione, incrementa il recupero dei favonoidi glicosidici totali negli estratti idroalcolici. II maggior recupero si verifica utilizzando miscele estraenti di etanolo o metanolo al 70%. Tra le due miscele, 1 EtOH al 70% consente i recuperi maggiori a tutti i tempi considerati, fino ad un recupero massimo di 5200 mg/kg nell estrazione a 24 ore. Rese di estrazione flavonoidi glucosidici e ottimizzazione rapporto pastazzo-miscela estraente. In tabella 1 sono riportate le rese dei flavonoidi glicosidici negli estratti con etanolo e metanolo al flavonoidi glucosidici (mg/kg) EtOH 60 EtOH 70 MeOH 60 MeOH time (h) Fig.2:.Flavonoidi totali HPLC in estratti idroalcolici a tempi diversi. Rapporto pastazzo miscela estraente 1:1 60 e 70%. Le rese delle estrazioni sono state calcolate come percentuale sul totale dei flavonoidi HPLC estratti sia nelle miscele idroalcoliche sia nelle riestrazioni con DMF. In tutte le miscele testate si nota un incremento della resa di circa il 7% tra l'estratto a 2 ore quello a 24 ore. Migliori rese si hanno con miscela estraente costituita da 3
4 etanolo al 70%, con un recupero pari al 71%; la ricerca è stata pertanto indirizzata all'ottimizzazione del rapporto pastazzo miscela estraente in etanolo al 70%, incrementando il rapporto del pastazzomiscela estraente a 1:5 e 1:10. Tale incremento aumenta il recupero delle frazioni flavonoiche con % Time (h) Fig. 3 : Rese %li di estrazione a diversi rapporti pastazzo miscela estraente RESE %li rapp 1 :1 RESE %li rapp 1:5 RESE %li rapp 1:10 un recupero massimo pari al 94%, per 12 ore di estrazione e relativo al rapporto 1:10. Le rese in estrazione per i rapporti 1:5 e 1:10 sono significativamente più elevate rispetto all'utilizzo di un rapporto 1:1. (figura 3) Conclusioni II pastazzo di Bergamotto presenta un residuo secco del 20%. Il processo di estrazione dei flavonoidi glucosidici mediante miscela idroalcolica rappresenta un buon metodo per il recupero di tali sostanze da pastazzo di bergamotto. Le migliori condizioni di processo consistono nell 'utilizzo di una miscela estraente costituita al 70% in etanolo, un rapporto pastazzo-miscela estraente pari a 1.5 o 1:10. Un impianto pilota pertanto potrebbe essere costituito dalle seguenti unità operative; -Un tank di estrazione, per un impianto discontinuo, a chiusura ermetica, munito di pale per l agitazione; -Un sistema di filtrazione del pastazzo esausto, un filtro-pressa rappresenta l'ideale per questo tipo di matrice e non richiede trattamenti pressori elevali, un DECANTER potrebbe anche essere ulile allo scopo; -Un tank di raccolta del pastazzo esausto in caso si voglia effettuare il recupero delle frazioni pectiche con metodo convenzionale; 4
5 -Un sistema di evaporazione flash (sotto vuoto), per la concentrazione ed il recupero dei flavonoidi glicosidici dalla miscela entraente; -Un sistema di distillazione della miscela alcolica per il recupero dell etanolo e per il riciclo nel processo. Tabella 2: Rese %li di flavonoidi glucosidici in estratti alcolici. Rapporto pastazzo miscela estraente 1:1 estratto tempo eriocitrina neoeriocitrina naringina esperidina neoesperidina totali ore % % % % % % MeOH 60% MeOH 60% MeOH 60% MeOH 60% MeOH 70% MeOH 70% MeOH 70% MeOH 70% EtOH 60% EtOH 60% EtOH 60% EtOH 60% EtOH 70% EtOH 70% EtOH 70% EtOH 70% BIBLIOGRAFIA Benavente-Gracìa O., Castillo J., Marin F., Ortuño A., Del Rìo J.A., 1997 Uses and Proprieties of Citrus Flavonoids, J. Agric. Food Chem.,45, Calvarano M.,. Postorino E, Gionfriddo F.,. Calvarano I., Bovalo F., 1996, Naringin Ectration from exhausted Bergamot Peels, Profumer & Flavourist, 21, 1-4 Di Giacomo A., Calvarano M., 1991,Sulla Preparazione dei Flavonoidi e dei Relativi Diidrocalconi a Partire dagli Scarti dell Industria Agrumaria, Essenze e derivati Agrumari, 61, Horowitz R., Pasadena, Gentili B. (1968). Conversion of Naringin to neohesperidin and neohesperidin dihydrochalcone. US patent 3,375,242, Luximinon-Ramma A.et al Antioxidant Activities of Phenolic, Proanthocyanidin and Flavonoid Component in Extracts of Cassia fistula, J. Agric. Food Chem.,50,
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