premio di laurea Trasformazione genetica del frumento duro: il gene pmi come marcatore selezionabile

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1 Sommario Nel presente studio è stato messo a punto un efficiente protocollo di selezione positiva per la trasformazione genetica del frumento duro basato sul gene della fosfomannosio-isomerasi (pmi) di E. coli come marcatore selezionabile e il mannosio come agente selettivo. Il pmi può rappresentare una valida alternativa ai tradizionali geni marcatori di resistenza agli erbicidi e antibiotici, in quanto più efficiente e meno rischioso per l ambiente e la salute umana. Summary In the present study an efficient positive selection method for durum wheat transformation was established based on the E. coli phosphomannose-isomerase gene (pmi) as the selectable marker and mannose as the selective agent. Pmi may represent a valid alternative to the use of commonly employed herbicide resistance genes, showing to be more efficient and less harmful to environmental and human health. Trasformazione genetica del frumento duro: il gene pmi come marcatore selezionabile Angelica Giancaspro Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale Sezione di Genetica e Miglioramento Genetico - Università degli Studi di Bari - Via Amendola 165/A Bari - Italia angelica.giancaspro@libero.it Durum wheat transformation: pmi gene as a selectable marker Parole chiave: selezione positiva, pmi, bar, Triticum turgidum Key words: positive selection, pmi, bar, Triticum turgidum INTRODUZIONE Nonostante i continui progressi nel campo della trasformazione genetica dei vegetali, l efficiente identificazione delle piante transgeniche in assenza di selezione risulta possibile solo per poche specie (Hohn et al., 2001). Gli esperimenti di trasformazione genetica delle specie agrarie, caratterizzati da un efficienza molto bassa, vengono condotti inserendo un gene marcatore nel vettore di trasformazione e selezionando i tessuti vegetali per l espressione di tale gene. I marcatori solitamente utilizzati sono geni che Tecnica Molitoria -???

2 conferiscono alle piante la resistenza ad agenti selettivi tossici, come antibiotici ed erbicidi. Durante la trasformazione genetica, però, il marcatore si integra nel genoma della pianta ospite insieme al transgene di interesse e alle sequenze del vettore. La presenza dei geni di resistenza nelle piante GM destinate alla coltivazione in campo o all alimentazione umana ed animale, risulta problematica a causa dei potenziali rischi per l ambiente e la salute umana derivati dal loro possibile trasferimento incontrollato. Una recente alternativa ai numerosi sistemi proposti per la rimozione dei geni marcatori dopo la trasformazione genetica, è rappresentata dalla realizzazione di una selezione positiva delle piante trasformate. Diversamente dalla tradizionale selezione negativa, essa non prevede l utilizzo di agenti selettivi tossici come gli antibiotici o gli erbicidi, ma si basa su geni marcatori innocui che conferiscono alle cellule trasformate la capacità di metabolizzare zuccheri normalmente non utilizzabili dalle cellule vegetali. Il principio della selezione positiva è che le cellule non trasformate non vengono uccise dall agente selettivo, ma non proliferano a differenza di quelle trasformate che si accrescono sfruttando il vantaggio di poter metabolizzare lo zucchero. Tra i più recenti sistemi di selezione positiva si annovera quello basato sul gene della fosfomannosio-isomerasi (pmi) di E. coli come marcatore selezionabile e il mannosio come agente selettivo (Joersbo et al., 1998). La fosfomannosio-isomerasi catalizza l interconversione reversibile di mannosio-6-fosfato e fruttosio-6-fosfato, consentendo alle cellule vegetali trasformate di crescere e differenziarsi su un substrato contenente il mannosio. Nel presente studio sono stati confrontati in frumento duro (Triticum turgidum L. var. durum) il sistema di selezione negativa basato sull utilizzo del gene marcatore bar di S. hygroscopicus per la resistenza all erbicida Bialaphos, e quello di selezione positiva che utilizza il gene pmi. MATERIALI E METODI Plasmidi e geni Per gli esperimenti di trasformazione genetica del frumento duro sono stati utilizzati i vettori plasmidici pnov2820 e pahc20. Il vettore pnov2820 (4628bp) contiene la sequenza codificante del gene pmi di E. coli per la fosfomannosio-isomerasi sotto il controllo del promotore costitutivo CMPS (Cestrium Yellow Leaf Curling Virus Promoter-Short version) e della sequenza di terminazione nos di A. tumefaciens (fig. 1a). Il plasmide pahc20 (5505bp) contiene la sequenza del gene bar di S. hygroscopicus per la fosfinotricina-acetiltransferasi (PAT) sotto il controllo del promotore ubiquitario Ubi di mais e della sequenza di terminazione nos (fig. 1b). 2 Tecnica Molitoria -??? 2008

3 Fig. 1 - a) Struttura e mappa di restrizione del vettore pahc20. Il plasmide contiene la sequenza codificante del gene bar di S. hygroscopicus preceduta dal promotore ubiquitario Ubi di mais e seguito all estremità 3 dalla sequenza di terminazione nos di A. tumefaciens. b) Struttura e mappa di restrizione del vettore pnov2820 contenente la sequenza codificante del gene pmi di E. coli sotto il controllo del promotore costitutivo CMPS e della sequenza di terminazione nos. Clonaggio dei vettori plasmidici I vettori pnov2820 e pahc20 sono stati moltiplicati mediante clonaggio in cellule competenti di E. coli (MAX Efficiency DH5αF IQ Competent Cells, Invitrogen) con il metodo dell heat-shock. La selezione delle cellule batteriche trasformate è stata effettuata su un terreno di coltura solido LB 1X contenente 50 mg/l di ampicillina. L estrazione dei due vettori plasmidici dalle cellule di E. coli è stata realizzata utilizzando il kit d estrazione QIAGEN Plasmid MAXI Kit. Il DNA plasmidico estratto è stato infine controllato mediante amplificazione PCR con coppie di primer specifiche per i geni marcatori contenuti nei vettori, e digestione enzimatica (fig. 2). Trasformazione genetica con il metodo biolistico e selezione positiva Come fonti di espianto per la coltura in vitro sono state utilizzate cariossidi immature di frumento duro prelevate 21 giorni dopo l antesi e sterilizzate in superficie mediante lavaggio in etanolo al 70%. I calli sono stati ottenuti dagli embrioni mediante coltura al buio per una settimana su un mezzo nutritivo base MS (Murashige e Skoog, 1962) contenente150 mg/l di L-aspargina, 0,50 mg/l di Tiamina-HCl, 40 g/l di maltosio, 2 mg/l di auxina e 3,5 g/l di Phytagel (fig. 3a). La trasformazione genetica è stata realizzata con il metodo biolistico utilizzando l apparecchio ad elio PDS 1000/ Tecnica Molitoria -???

4 Fig. 2 - Pattern elettroforetico ottenuto dalla digestione enzimatica dei plasmidi pahc20 e pnov2820. La corsia 1 contiene il marker di peso molecolare (λ/hindiii); le corsie 2-6 contengono i prodotti delle digestioni del pahc20 con gli enzimi HindIII, EcoRI, PstI, HindIII + PstI e HindIII + Bgl II. Le corsie 8-11 contengono i prodotti di digestione del pnov2820 rispettivamente con gli enzimi HindIII, PstI, HindIII + EcoRI e PstI + EcoRI. La corsia 7 è vuota. I frammenti di restrizione contenenti i due geni marcatori sono indicati dalle frecce colorate [ = bar (2,7 Kbp); = pmi (2,0 Kbp)]. He particle gun (Biorad) come descritto da Weeks et al. (1993). Il DNA plasmidico è stato precipitato su microproiettili costituiti da particelle d oro del diametro di 1 µm, e trasferito nei calli alla pressione di psi sotto vuoto spinto (26in. Hg). Dopo tre settimane di coltura su un terreno nutritivo non selettivo (Recovery Media), i calli trasformati sono stati sottoposti a rigenerazione su un mezzo selettivo contenente 0,2 mg/l di auxina e 5 g/l di maltosio - 10 g/l di mannosio per la selezione positiva con il gene marcatore pmi, e 1 mg/l di Bialaphos per la selezione negativa con il gene bar. La rigenerazione è stata condotta in una camera di crescita a 25 C in condizioni di umidità e luce controllate (fig. 3b). La successiva radicazione dei germogli è avvenuta in tubi contenenti un substrato privo di auxina (Rooting Media), in presenza di una maggiore pressione selettiva (15 g/l di mannosio per il pmi e 3 mg/l di Bialaphos per il bar). 4 Tecnica Molitoria -??? 2008

5 Fig. 3a - Calli embriogenici di frumento duro sviluppati dopo una settimana di coltura al buio a temperatura ambiente sul mezzo nutritivo base MS. Fig. 3b - Calli durante la rigenerazione sul mezzo selettivo contenente mannosio: i calli trasformati hanno emesso le prime foglioline e le prime radichette. Le cellule non contenenti il gene marcatore pmi, incapaci di accrescersi metabolizzando il mannosio, hanno formato macchie necrotiche (freccia bianca). Le plantule rigenerate sono state successivamente trapiantate in vasi contenenti torba (XLS) e acclimatate gradualmente. Le piante sopravvissute alla selezione con il Bialaphos e il mannosio sono state sottoposte al saggio di espressione del clorofenolo rosso (CPR) come descritto da Kramer et al. (1993). Frammenti di foglie prelevati da plantule in radicazione e contenute nei vasi sono stati deposti su un substrato selettivo a ph 6 contenente 50 mg/l di CPR e: 3 mg/l di Bialaphos per il gene bar, 15g/L di mannosio per il gene pmi. Le piante trasformate che avevano integrato i geni marcatori e li esprimevano, sono state identificate attraverso l osservazione del colore del mezzo selettivo dopo 3-4 giorni di coltura a temperatura ambiente (fig. 4). RISULTATI E DISCUSSIONE In questo studio sono stati confrontati due sistemi di selezione nella trasformazione genetica del frumento duro: la selezione negativa con il gene marcatore bar di S. hygroscopicus che conferisce resistenza all erbicida Bialaphos, e la selezione positiva con il gene pmi di E. coli basata sull utilizzo del manno- Tecnica Molitoria -???

6 Fig. 4 - Saggio del clorofenolo rosso (CPR) condotto su plantule sottoposte a selezione con il gene marcatore bar. Il colore del mezzo nutritivo selettivo è stato osservato dopo 3 giorni di coltura a temperatura ambiente. Le corsie A (1-3) e B (1-6) contengono frammenti di foglie derivanti da piante trasformate che hanno integrato il transgene bar ed esprimono un enzima PAT funzionale. La corsia A (4-6) contiene frammenti di foglia derivanti da piante di frumento duro wild-type e da piante non trasformate. sio come agente selettivo. Sono stati condotti un esperimento di trasformazione con il plasmide pahc20 contenente il gene bar, ed uno con il plasmide pnov2820 contenente il gene pmi, ciascuno su 500 calli di frumento duro. I due sistemi di selezione sono stati confrontati mediante valutazione dell efficienza di trasformazione e selezione. Il valore dell efficienza di trasformazione, calcolata come il numero di piante transgeniche ottenute sul numero totale di calli bombardati, è risultato simile per i due protocolli selettivi: 1,2% con il plasmide contenente il gene marcatore pmi e 0,8% con quello contenente il gene bar. L efficienza di selezione del mannosio e del Bialaphos, calcolata come rapporto tra il numero di piante T 0 contenenti il gene marcatore e il numero totale di plantule rigenerate, è stata valutata in tutti gli stadi compresi tra la rigenerazione dei calli e la formazione di plantule. L effetto selettivo del mannosio si è rivelato molto efficiente nella fase di rigenerazione dei calli di frumento; infatti, dopo quattro settimane di coltura, solo il 29% di essi ha prodotto delle aree verdi, rispetto al 44% prodotte in presenza di Bialaphos. Al contrario, nella fase di radicazione la selezione positiva si è rivelata più blanda della selezione negativa, come dimostrato da 6 Tecnica Molitoria -??? 2008

7 una frequenza di radicazione del 52% in presenza dello zucchero e del 35% in presenza dell erbicida. Il saggio del clorofenolo rosso ha permesso di identificare le piante transgeniche in una fase precoce della selezione, prima ancora dell analisi del loro DNA genomico, mediante la semplice osservazione del colore di un mezzo selettivo contenente un indicatore di ph (CPR). I tessuti transgenici hanno fatto virare il colore iniziale rosso del mezzo in seguito alla liberazione di composti acidi (per il gene pmi) o basici (per il gene bar). Invece, i tessuti che non avevano integrato i geni marcatori o non li esprimevano a livelli sufficientemente elevati, non hanno modificato il ph e il colore del substrato (fig. 4). La successiva analisi molecolare delle stesse piante, condotta mediante amplificazione PCR del DNA genomico con primer specifici per i due geni marcatori, ha confermato i risultati del saggio CPR dimostrando che tutte le plantule che in base al saggio d espressione erano state classificate come sintetizzanti l enzima PMI o PAT avevano effettivamente integrato i transgeni pmi e bar nel loro genoma (fig. 5). In totale sono state identificate 6 piante contenenti il gene pmi capaci di crescere in presenza di mannosio e 4 piante resistenti al Bialaphos contenenti il gene bar Fig. 5 - Pattern elettroforetico di piante di frumento duro trasformate con il plasmide pnov2820 contenente il gene marcatore pmi. Le bande all altezza della freccia corrispondono al frammento di 512 bp prodotto dall amplificazione del DNA genomico con la coppia di primer specifici per il gene pmi. La corsia 1 contiene il marker di peso molecolare (λ, 100 bp). Le corsie 2 e 3 contengono rispettivamente i prodotti di amplificazione di una miscela di reagenti priva di DNA e del controllo negativo costituito da una pianta di frumento duro wild-type. La corsia 10 rappresenta il controllo positivo costituito dal prodotto di amplificazione del plasmide pnov2820. Le corsie 5-9 contengono il prodotto di amplificazione di piante transgeniche; la corsia 4 contiene il prodotto di una linea priva del gene marcatore pmi. Tecnica Molitoria -???

8 CONCLUSIONI Nel presente studio il gene pmi di E. coli si è rivelato un marcatore selezionabile molto più efficiente del gene bar. L efficienza della selezione positiva basata sul mannosio è stata molto più elevata (88%) di quella negativa basata sul Bialaphos (28%). Una prospettiva incoraggiante aperta da questo studio è che il gene pmi possa validamente sostituire in frumento duro i geni marcatori di resistenza agli erbicidi, permettendo così agli sperimentatori di limitare sensibilmente i rischi per l ambiente e la salute umana connessi alla trasformazione genetica di questa importante coltura. L uso del pmi permette inoltre di incrementare l efficienza di rigenerazione dei calli trasformati. Infatti, non utilizzando sostanze tossiche come agenti selettivi, nel mezzo di coltura non vengono rilasciati metaboliti nocivi dalle cellule morenti non trasformate che nelle comuni procedure di selezione negativa inibiscono la rigenerazione di quelle trasformate. Infine, mostrando un efficienza di selezione elevata anche se veicolato privo di sequenze plasmidiche (clean gene, Gadaleta et al., 2008, in press), il pmi permetterebbe di ottenere delle piante GM con pattern di integrazione meno complessi e quindi un espressione più stabile dei transgeni trasferiti. Il presente studio ha permesso inoltre di validare il saggio del CPR come metodo rapido e attendibile per identificare le piante transgeniche, nonché capace di incrementare l efficienza della selezione permettendo allo sperimentatore di individuare e scartare velocemente i falsi positivi già nelle prime fasi della selezione. Lavoro presentato per il Premio di Laurea Chiriotti Editori, 2007 BIBLIOGRAFIA Gadaleta A., Giancaspro A., Blechl A., Blanco A. A Transgenic Durum Wheat Line that is Free of Marker Genes and Expresses 1Dy10. Journal of Cereal Science, In press. Hohn B., Levy A.A., Puchta H. Elimination of selection markers from transgenic plants. Current Opinion in Biotechnology, 12, , Joersbo M., Donaldson I., Kreiberg J., Petersen S.G., Brunstedt J., Okkels F.T. Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet. Molecular Breeding, 4, , Kramer C., DiMaio J., Carswell G.K., Shillito R.D. Selection of transformed protoplastderived Zea mays colonies with phosphinothricin and a novel assay using the ph indicator chlorophenol red. Planta, 190, , Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plantarum, 15, , Weeks J.T., Anderson O.D., Blechl A.E. Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). Plant Physiology, 102, , Tecnica Molitoria -??? 2008