DIAGNOSI NELLE MALATTIE INFETTIVE

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1 DIAGNOSI NELLE MALATTIE INFETTIVE

2 DIAGNOSI EZIOLOGICA Identificazione dell agente patogeno responsabile di una malattia Suggerire un trattamento terapeutico appropriato Valutare l efficacia di una terapia Valutare la presenza di portatori sani (potenziale fonte di contagio per la comunità)

3 Diagnosi di laboratorio Esigenza di utilizzare metodologie scientificamente valide ed eseguibili in tempi accettabili Necessità di acquisire in tempi rapidi informazioni utili alla diagnosi ed alla terapia

4 Fase pre-analitica 1. Richiesta del Clinico (scelta degli esami) 2. Informazione e Preparazione del Paziente 3. Raccolta del campione 4. Identificazione del campione 5. Trasporto del campione FASE ANALITICA Fondamentale momento di interfaccia tra il laboratorio e le altre parti coinvolte nel processo momento cruciale nel quale si compiono il 46% degli errori!

5 L appropriatezza di tutta la fase pre-analitica si traduce in maggiore qualità del servizio diagnostico e maggiore sicurezza dell operatore Solo la stretta collaborazione tra tutte le figure coinvolte a diverso titolo nell indagine microbiologica (che ha inizio al letto del malato con la decisione di richiedere le indagini fino al momento dell utilizzo dei referti) ed il rispetto in tutte le fasi delle corrette procedure può assicurare la piena valorizzazione dell indagine microbiologica.

6 Fasa pre-analitica 1. richiesta degli esami di laboratorio La richiesta di accertamenti microbiologici è giustificata: nella patologia infettiva ad eziologia definita, per diagnosi di forme clinicamente atipiche o iniziali, per la determinazione della sensibilità ai farmaci. nelle sindromi polieziologiche, per indicazioni terapeutiche (sempre, se in assenza di specifiche informazioni epidemiologiche). nella patologia infettiva del paziente immunocompromesso, per indicazioni terapeutiche (quasi sempre necessarie). in ogni caso, per valutazioni epidemiologiche indispensabili per lo studio della circolazione dei microrganismi e la identificazione dei fattori di rischio, l adozione di idonee misure preventive, la definizione di un corretto approccio diagnostico e terapeutico.

7 FASE PRE-ANALITICA 2. Informazione e preparazione del Paziente Il Paziente deve essere adeguatamente istruito sulle corrette modalità di prelievo, conservazione e trasporto del campione biologico Esempio: Prelievo urine (tecnica del mitto intermedio ) Prelievo dell espettorato

8 FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico Campione clinico: materiale biologico da esaminare per verificare la presenza o assenza di specifici microrganismi patogeni Può essere prelevato da: siti sterili (sangue, midollo, liquido cefalo-rachidiano (liquor), liquido pleurico/pericardico/peritoneale/articolare, vie respiratorie inferiori, urine, tessuti profondi) ogni isolamento ha significato eziologico siti contaminati da flora autoctona (bocca, naso, vie respiratorie superiori, feci, espettorato, tratto gastro-intestinale, tratto genitale femminile, terzo distale dell uretra, cute) i risultati vanno interpretati a seconda del caso necessaria una richiesta mirata del clinico, volta alla ricerca di uno o più specifici patogeni nel contesto dell abbondante flora contaminante Ad ogni campione è associato un potenziale rischio biologico per la salute degli operatori sanitari

9 Flora microbica residente Tutte le superfici corporee esposte (a contatto con l ambiente circostante, i.e. bocca, naso, intestino, cute, vie genitali femminili, uretra) sono colonizzate da una flora autoctona Svantaggi Può contaminare i campioni Può causare malattia Vantaggi è in grado di proteggere dalle infezioni prevenendo la colonizzazione delle superfici epiteliali da parte dei patogeni (resistenza alla colonizzazione) la riduzione (o rimozione) della flora normale mediante impiego di antibiotici può causare superinfezioni, generalmente sostenute da microrganismi resistenti

10 Tipologie di campioni biologici Campione prelevato da una zona in cui coesistono patogeni e flora residente (tampone) Campione INDIRETTO: prelevato previo passaggio in una zona con flora residente (lavaggio bronco-alveolare) Campione DIRETTO: il patogeno è localizzato in un sito normalmente sterile ed una barriera (la cute, generalmente) deve essere superata per la sua raccolta (liquor, ago-aspirato) Campioni INUTILI ai fini diagnostici: non vanno prelevati in quanto non forniscono alcuna indicazione (vomito, aspirato gastrico, contenuto intestinale, etc.)

11 APPROPRIATEZZA DEL CAMPIONE Molto importante è l adeguata raccolta (appropriatezza) del campione. In particolare, il campione dovrebbe essere: A. raccolto nel momento giusto; B. prelevato da un distretto corporeo rappresentativo della patologia infettiva; C. prelevato in quantità sufficiente da poter effettuare i test diagnostici necessari; D. raccolto in maniera da evitare contaminazioni.

12 Appropriatezza del campione A. QUANDO: nel momento giusto Nella fase acuta della malattia (carica microbica maggiore) Prima dell inizio di una terapia antimicrobica, quando possibile, o a distanza di almeno 48h dalla sua sospensione (se ciò non è possibile segnalarlo al laboratorio) B. DOVE: dal distretto corporeo rappresentativo dell area infetta Esempio:Il sospetto clinico di febbre tifoide, unito alla conoscenza della storia naturale di questa malattia infettiva, suggerisce la ricerca di Salmonella typhi nel sangue durante la 1 e 2 settimana e nelle feci nella 3 e 4 settimana.

13 Appropriatezza del campione C. QUANTO: in quantità sufficiente Esempio: quantità di sangue sufficiente per rilevare batteriemie (spesso la carica batterica ematica è molto bassa) D. COME: in maniera da evitare contaminazioni Se il prelievo non viene eseguito con modalità rigorosamente asettiche, altri microorganismi (flora autoctona ), non responsabili della patologia, potrebbero contaminare i campioni e falsare così il risultato delle indagini microbiologiche. Esempio: ricerca di Streptococcus pyogenes va effettuata a mezzo di un tampone nelle fosse peritonsillari, evitando il contatto con l orofaringe

14 FASE PRE-ANALITICA 4. Identificazione del campione I contenitori inviati in laboratorio debbono essere identificati con l'etichetta riportante il relativo codice a barre ed accompagnati da un foglio di richiesta indicante: Identificativo del paziente (nome, cognome, età, sesso) Provenienza anatomica del campione Nominativo del prelevatore Data e ora di campionamento(informazione critica!) Diagnosi clinica presuntiva (eventuale) Schema del trattamento antibiotico in corso

15 FASE PRE-ANALITICA 5. Trasporto del campione Al fine di ottenere la massima recovery dei microrganismi, il campione deve essere trasportato: in adeguati contenitori sterili, per assicurare la corretta esecuzione delle indagini microbiologiche e consentire il corretto trasporto e manipolazione dal campione; rapidamente: il trasporto del campione frequentemente causa una riduzione della vitalità dei microrganismi in esso presenti; in adeguati terreni di trasporto, se necessario(es. tamponi), al fine di mantenere inalterata la facies microbica del campione, conservandone le caratteristiche possedute al momento del prelievo; Terreni liquidi o semisolidi (agarizzati) a temperatura controllata : generalmente a +4C, occasionalmente a temperatura ambiente Trasporto in sistemi dedicati, come nel caso della ricerca di germi anaerobi

16 Riflessioni sulla fase pre-analitica Il contributo di chi richiede e preleva i campioni alla qualità degli esami di laboratorio dipende sia dalla consapevolezza del fenomeno che nella capacità di attenersi a quella serie di norme che permettono di ridurre al minimo i fattori che possono modificare il risultato finale delle analisi. Un campione non idoneo può infatti causare il mancato isolamento del microorganismo responsabile dell infezione. Inoltre, si evitano in tal modo "dispersioni" di germi patogeni, specie quelli resistenti (MRSA, Pseudomonas spp), che vanno indirettamente ad incrementare l'incidenza delle infezioni nosocomiali. Il risultato dell'esame batteriologico sarà qualitativamente valido e più rapido. In ultima analisi, gli operatori coinvolti nella fase pre-analitica sono responsabili della qualità del percorso diagnostico del paziente almeno fino all arrivo del campione in Laboratorio!

17 Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive A) DIAGNOSI DIRETTA Ricerca dell'agente eziologico (intero o di una sua componente) e sua identificazione: Esame batteriologico/micologico/parassitologico/virologico B) DIAGNOSI INDIRETTA Ricerca di anticorpi specifici (test sierologici): sviluppo di una risposta anticorpale specifica

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19 Diagnosi diretta A. Esame microscopico B. Esame colturale (isolamento) C. Ricerca di antigeni D. Ricerca di sequenze geniche

20 a. Esame microscopico Scopo: accertare la presenza, nel materiale patologico adatto, del microrganismo patogeno sospettato e identificarlo. Preparati a fresco Preparati fissati e colorati Batteri Parassiti Funghi Batteri Parassiti Funghi Virus

21 a. Esame microscopico Campioni a fresco oppure fissati (al calore o chimicamente) La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente: microscopia in campo oscuro: il condensatore illumina obliquamente l oggetto in modo che le strutture cellulari riflettano la luce verso l occhio dell operatore, a differenza dell ambiente circostante. Ricerca di spirochete (T. pallidum) nelle lesioni cutanee associate alla sifilide. microscopia in contrasto di fase: le differenze nell indice di rifrazione nei campioni sono convertite in differenze nella intensità della luce nell immagine. Consente la visualizzazione di strutture in campioni non colorati (funghi e parassiti, ma anche batteri). microscopia in fluorescenza: le molecole fluorescenti assorbono luce ad una e la ri-emettono ad una più lunga. Tale differenza viene rilevata dall impiego di filtri. Utile per l identificazione di batteri e funghi. Spesso si utilizzano colorazioni dedicate i.e. Gram, alcool-acido resistenza (ZiehlNielsen)

22 Esame microscopico ( a fresco ) Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente colorabili con le tecniche disponibili, evidenziabili invece in campo oscuro: ricerca di Spirochete(Treponema, Borrelia) ricerca di Leptospire Osservazione in campo oscuro: Treponema pallidum

23 Esame microscopico (previa colorazione) Campioni fissati (al calore o chimicamente) Fornisce indicazioni riguardo: Idoneità del campione (espettorato: neutrofili / cellule squamose) Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili Presenza/assenza di microrganismi (batteri, funghi, parassiti) Colorazione del campione con tecnica di Gram: morfologia (cocchi, bastoncelli,cocco-bacilli, lanceolata) disposizione (catenelle, clusters, diplococchi) quantità assoluta di batteri presenti percentuale relativa di Gram+ e Gram- localizzazione in sede intra-od extra-cellulare Specifiche colorazioni: colorazione di Ziehl Nielsen (bacilli alcool-acido resistenti) verde malachite (endospore batteriche) colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina) colorazione di Leifson (flagelli)

24 Esame microscopico (previa colorazione) Colorazioni SEMPLICI, che prevedono l impiego di un solo colorante: cristalvioletto fucsina basica blu di metilene Colorazioni DIFFERENZIALI, che prevedono l impiego di più di un colorante: Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen

25 Colorazione di gram: regressiva e differenziale Tecnica 1.Fissare gli strisci al calore 2.Coprire con cristalvioletto per 1-2 min 3.Lavare con acqua. Non asciugare 4.Coprire con la soluzione iodio-iodurata di Lugol per 1-2 min 5.Lavare con acqua. Non asciugare 6.Decolorare per 10 sec con alcool-acetone 7.Lavare con acqua. Non asciugare 8.Coprire con safranina (2.5% in alcool 95%) per 1-2 min 9.Lavare con acqua e lasciare asciugare Principio Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all interno della cellula. Il decolorante condensa, per disidratazione, la struttura peptidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene catturato dalla parete cellulare. Nei batteri Gram- il decolorante agisce come solvente lipidico, dissolvendo la membrana esterna della parete cellulare, permettendo così il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.

26 Colorazione gram: utilità clinica Idoneità del campione da sottoporre a coltura Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva) meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni piogene Suggerire la necessità di attuare tecniche di coltivazione non routinarie anaerobi, funghi Ausilio nella interpretazione dell esame colturale angina di Vincent (spirochete, fusobatteri) paziente antibiotizzato Informazioni sulla natura dell infezione infezioni poli/mono-microbiche Tuttavia: La colorazione di Gram non deve essere effettuata su campioni clinici (feci, escreato) in cui la flora patogena non può essere differenziata da quella commensale La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di: Legionella spp.(immunofluorescenza) bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (Ziehl-Neelsen)

27 Esame microscopico in micologia Preparati a fresco o fissati e colorati Cryptococcus: lieviti Candida: lieviti Microsporum: conidi Aspergillus: testa conidiale Candida: ife in striscio vaginale

28 Esame microscopico in parassitologia È di alto valore diagnostico Preparati a fresco (utile per parassiti mobili) o fissati e colorati Leishmania: promastigoti e amastigoti Giardia intestinalis Sarcoptes scabiei Plasmodium: trofozoiti Entamoeba Taenia: proglottide matura

29 Diagnosi diretta A. Esame microscopico B. Esame colturale (isolamento) C. Ricerca di antigeni D. Ricerca di sequenze geniche

30 B. Esame colturale (isolamento) BATTERI quasi tutti terreni artificiali M. leprae, T. pallidum non coltivabili chlamydie rickettsie colture cellulari VIRUS Uova embrionate colture cellulari (primarie/continue) molti virus non coltivabili o coltivabili con difficoltà

31 B. Esame colturale (BATTERI) Quasi tutti i batteri di interesse medico possono essere coltivati in sistemi artificiali (in vitro) denominati terreni di coltura. I terreni di coltura si distinguono in base allo stato fisico: LIQUIDI(brodo).Composizione del brodo normale : peptone (digestione parziale di proteine animali) 0,5% estratto di carne 0,3% NaCl (per rendere isotonico il terreno) tampone fosfato (PBS; ph 7,0) H2O SOLIDI (brodo normale solidificato con agar). L agar: Polisaccaride acido (70% agarosio,30% agaropectina) estratto da alghe rosse del genere Gelidium Addizionato al brodo in quantitàpari a1,5-2% liquido a temperature 80C, gelifica a 42-47C Non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri Permettono l isolamento di specie microbiche (colonie)

32 Terreni di coltura Terreni minimi crescita della maggior parte dei batteri Carbonio Azoto Zolfo Fosforo Sotto forma di Sali inorganici, aggiunti in concentrazione nota Terreni selettivi crescita di alcuni, inibizione della crescita di altri Terreni arricchiti microrganismi con particolari richieste metaboliche sangue siero estratto di lievito infusi di cuore e cervello carboidrati amminoacidi Terreni differenziali identificazione in base alle caratteristiche differenti di crescita Streptococchi: α emolitici β emolitici γ emolitici Agar sale-mannite Agar sangue

33 ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN SUPERFICIE

34 Diagnosi diretta A. Esame microscopico B. Esame colturale (isolamento) identificazione C. Ricerca di antigeni D. Ricerca di sequenze geniche

35 IDENTIFICAZIONE Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terreni solidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate si procede alla identificazione: IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA caratteri microscopici (colorazioni,forma,organizzazione) caratteri macroscopici (aspetto coloniale) IDENTIFICAZIONE FINALE (DEFINITIVA) A. biochimica B. immunologica (sierologica) C. molecolare

36 A. IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA La determinazione di specie si basa sulla capacità del microrganismo in esame di: metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per via fermentativa (via anaerobica) produrre specifici enzimi produrre specifici prodotti metabolici Utilizzo di metodi manuali od automatizzati. Identificazione possibile in tempi rapidi (4-6h). La fermentazione degli zuccheri e l utilizzazione di altri substrati (ureasi, indolo, gelatina, etc.) viene evidenziata da un indicatore di ph responsabile della reazione colorimetrica

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38 B. Identificazione sierologica Ha come obiettivo finale quello di ricercare ANTIGENI direttamente nel campione biologico esaminato. Le tecniche di identificazione sierologica comprendono: agglutinazione: quando l antigene è corpuscolato (globuli rossi, batteri) precipitazione: quando l antigene è solubile fissazione del complemento: quando l antigene è corpuscolato (lisi) neutralizzazione: quando l antigene, per azione del corrispondente anticorpo, perde la sua attività IF immunofluorescenza RIA radioimmunoassy test immunoenzimatici ELISA, immunoblot Alla base di ogni reazione sierologica c è la formazione dell immunocomplesso (antigene+anticorpo)

39 C. Identificazione molecolare SONDE MOLECOLARI Sonde specifiche a DNA per geni che identificano uno specifico patogeno. Le sonde legano il DNA complementare presente nel campione (ibridazione), indicando la presenza del patogeno Permettono di individuare anche esigue quantità di acidi nucleici (elevata sensibilità) La reazione di ibridazione può essere condotta su diverse tipologie di campioni: colonie batteriche preparazioni di DNA purificato campioni clinici

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41 La digestione del DNA per mezzo di enzimi di restrizione, seguita da ibridazione con differenti sonde geniche genera patterns specie-specifici (ossia caratteristici di una specie microbica).

42 PRINCIPALI TECNICHE DI IBRIDAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI Il DNA target denaturato (singolo filamento) viene direttamente immobilizzato su un supporto solido (p. es., membrana di nitrocellulosa) ed ibridato con una specifica sonda a DNA a singolo filamento marcata, per facilitarne la successiva rivelazione (dot blot). In alternativa, differenti frammenti di DNA con diverso peso possono essere separati attraverso elettroforesi su gel di agarosio, denaturati e poi trasferiti su membrane per l ibridazione con sonda e rilevazione (Southern blot). Se si utilizzano molecole di RNA separate con elettroforesi si parla di Northern blot.

43 Diagnosi diretta A. Esame microscopico B. Esame colturale (isolamento) C. Ricerca di antigeni identificazione antibiogramma D. Ricerca di sequenze geniche

44 ANTIBIOGRAMMA: TEST DI ANTIBIOTICO- SENSIBILITà Una volta eseguita l identificazione del microrganismo in esame, si procede alla determinazione della sensibilità/resistenza dell isolato agli antibiotici (antibiogramma). Obiettivo dei test per la determinazione della antibiotico-s è di predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica. I test vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici. I test sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire la riproducibilità dei risultati. I risultati di questi test debbono essere usati per guidare la scelta dell antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l esperienza professionale.

45 Dopo aver seminato su terreno solido il germe in esame si appoggiano sulla superficie dei dischetti imbevuti degli antibiotici-test. Incubazione; Il mancato sviluppo del germe (alone di inibizione) significa sensibilità a quell antibiotico. Determinazione della MIC (CONCENTRAZIONE MINIMA INIBENTE): Misura quantitativa dell attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile.

46 Diagnosi diretta A. Esame microscopico B. Esame colturale (isolamento) C. Ricerca di antigeni: A. Test di agglutinazione B. Test di precipitazione C. Fissazione del complemento D. Immunofluorescenza, ELISA, RIA, Wester blot D. Ricerca di sequenze geniche (PCR)

47 Diagnosi indiretta Volta a rilevare una RISPOSTA IMMUNE UMORALE SPECIFICA dell ospite all agente infettivo La diagnosi INDIRETTA è, ovviamente, più tardiva di quella DIRETTA in quanto si può ricorrere ad essa soltanto quando si sia sviluppata già la reattività immunitaria dell ospite. Ciò non è sempre possibile, come nel caso di pazienti anergici. Le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico, pertanto, soltanto quando l isolamento del microrganismo sia difficoltoso, fallito, o non possibile. L accertamento indiretto non comportando l isolamento del germe, preclude la possibilità di saggiare la sensibilità dell agente etiologico verso i farmaci antimicrobici.

48 Tecniche per la diagnosi indiretta A. Reazione di fissazione del Complemento B. Reazione di agglutinazione C. Test immunoenzimatico (ELISA) D. Saggio inimmunofluorescenza E. Saggio radioimmunologico Praticamente le stesse viste per la ricerca diretta dell antigene nel campione, solo che qui cerchiamo l anticorpo diretto contro l antigene!

49 Agglutinazione diretta antigeni corpuscolati vengono posti a contatto con siero contenente anticorpi specifici antigeni presenti sulla superficie delle cellule batteriche

50 Agglutinazione indiretta Antigeni solubili o Anticorpi vengono fatti aderire artificialmente alla superficie di particelle corpuscolate come il lattice di polistirolo. Ricorda! La reazione di agglutinazione è molto sensibile anche a piccole quantità di anticorpi ed è molto usata per esempio per la TIPIZZAZIONE SIEROLOGICA (tecnica di identificazione che fa uso di antisieri che reagiscono con i vari antigeni batterici permettendone il riconoscimento).

51 Precipitazione antigene solubile (macromolecole o tossine) viene messo a contatto con un siero contenente anticorpi specifici. La formazione degli immunocomplessi si può osservare con un precipitato. Quando la concentrazione degli antigeni e degli anticorpi è ottimale si creano dei ponti tra un immunocomplesso e l altro. Questa fase corrisponde al punto di equivalenza dove è massima la quantità di precipitato.

52 Esempi di reazione di precipitazione Immunodiffusione Si tratta di pozzetti scavati nell agar. Quando si introducono antigene o anticorpo, essi diffondono e danno origine ad una banda di precipitazione nel punto d incontro. Immunoelettroforesi Si esegue prima una elettroforesi delle proteine del siero su gel di agar stratificato su lastra di vetro. Ai lati, su dei solchi viene introdotto l antisiero che contiene anticorpi contro le proteine del siero. All unione tra proteine del siero separate e i rispettivi anticorpi, si formano degli archi caratteristici.

53 FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO E una tecnica utilizzata per la diagnosi di sifilide (reazione di Wassermann) Siero in esame con anticorpi + antigene immunocomplesso + COMPLEMENTO di cavia + SISTEMA RIVELATORE formato da: Emolisine + Emazie Immunocomplesso Se il complemento è stato utilizzato dal 1^ immunocomplesso, non ci può essere emolisi, la reazione è positiva (presenza di anticorpi). Se invece si verifica emolisi, significa che il complemento si è reso disponibile per il sistema rivelatore, la reazione è negativa.

54 REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

55 immunofluorescenza Gli Ab sono coniugati con molecole fluorescenti (fluorescina), sono molecole in grado di assorbire la luce ultravioletta emettendo poi radiazioni nel campo del visibile. Per poter osservare la reazione si utilizza un microscopio a fluorescenza. IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA Si utilizza un anticorpo coniugato con fluoresceina isotiocianato, che sia specifico per l antigene in esame. IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA Si utilizza un anticorpo specifico per l antigene in esame ma non coniugato, che viene riconosciuto da un secondo anticorpo coniugato e diretto contro regioni costanti delle immunoglobuline della specie in cui è stato prodotto il primo anticorpo.

56 Immunoenzimatica E.L.I.S.A. Enzyme Linked Immunosorbent Assay Si ricopre la superficie plastica di un pozzetto (micropiastra) con anticorpi specifici contro l antigene. Si aggiunge l antigene che viene poi evidenziato da anticorpi, anch essi contro l antigene ricercato, legati covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasi alcalina, β-galattosidasi) (sandwichelisa) La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso la valutazione dell intensità del colore prodotto in risposta alla conversione enzimatica del relativo substrato cromogeno. La reale concentrazione dell antigene viene determinata per confronto con diluizioni standard dell antigene stesso.

57 Radioimmunologia R.I.A. Radio Immuno Assay L' isotopo è ciascuno degli atomi di uno stesso elemento, con lo stesso numero atomico ma con differente numero di massa. Possiedono lo stesso numero di protoni ed elettroni (quindi proprietà chimiche uguali) ma un diverso numero di neutroni (quindi proprietà fisiche diverse). Sono tecniche in cui la reazione antigene anticorpo è evidenziata da un isotopo radioattivo. La radioattività prodotta viene misurata con appositi strumenti. Questa tecnica si utilizza nella determinazione della concentrazione degli ormoni.

58 Western blot Separazione degli antigeni su gel di poliacrilammide in base al peso molecolare (elettroforesi) Trasferimento degli antigeni (bande elettroforetiche) su membrana di nitrocellulosa Incubazione degli antigeni con l anticorpo specifico Esposizione ad un anticorpo secondario (anti-anticorpo primario) marcato con un enzima (perossidasi) La formazione di immunocomplessi (e quindi la presenza dell antigene ricercato) viene evidenziata dall aggiunta di un substrato sul quale agisce l enzima, che provoca la precipitazione di colorante.

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61 Isolamento, identificazione e tipizzazione dei virus

62 Coltivazione dei virus animali Essendo PARASSITI ENDOCELLULARI OBBLIGATI i virus devono: entrare in contatto (aderire) penetrare in una cellula ospite dentro la quale si possa svolgere il loro ciclo replicativo Cellula sensibile e permissiva cellule sensibili (suscettibili) possono essere infettate da un determinato virus; sono provviste di idonei recettori cellule permissive consentono un ciclo di replicazione virale completo (infezione produttiva)

63 Coltivazione dei virus animali Nell animale (conigli, topi furetti, piccoli roditori) Nelle uova embrionate di pollo Nelle colture cellulari

64 coltivazione dei virus in colture cellulari allestimento delle colture in vitro inoculazione del campione incubazione Valutazione della crescita del virus nelle colture titolazione identificazione

65 Valutazione della crescita del virus nelle colture cellulari Effetti dello sviluppo del virus ECP (+/- specifico) Emoadsorbimento Emoagglutinazione Necessità di test di identificazione del virus: inibizione dell emoagglutinazione, neutralizzazione, IEA, IF, metodi molecolari

66 Valutazione della moltiplicazione virale in colture in vitro esame microscopico diretto (microscopio ottico) effetto citopatico (CPE) degenerazione cellulare formazione di cellule multinucleate o sincizi formazione di inclusioni il tipo di CPE il tempo della comparsa la velocità di progressione dipendono dal tipo di cellule infettante e dal tipo di virus infettante

67 Cpe (effetto citopatico) Degenerazione cellulare (lisi delle cellule) Cellule VERO infettate con poliovirus Fusione delle membrane delle cellule adiacenti formazione di cellule multinucleate o sincizi HSV Linee cellulari: HEK, HEP-2, KB, NCIH292, Vero Tempo di comparsa: HSV 1: 1-2 giorni HSV 2: più lento Tipo di CPE: cellule giganti, multinucleate

68 Cpe (effetto citopatico) Inclusioni cellulari Colorazione, osservazione microscopica Localizzazione nucleo (adenovirus, herpesvirus) citoplasma (virus della rabbia, poxvirus, reovirus) entrambi (CMV, paramyxovirus) Tipo ammassi di virioni (papovavirus) viroplasma (poxvirus) materiale cellulare alterato (adenovirus)

69 dimostrazione della moltiplicazione virale in colture in vitro emoagglutinazione Sospensione di globuli rossi Sospensione di globuli rossi + surnatante colturale emoadsorbimento Cellule infettate + sospensione di globuli rossi

70 Identificazione e tipizzazione dei virus effetto citopatico (CPE) +/- caratteristiche antigeniche fissazione del complemento neutralizzazione inibizione dell emoagglutinazione immunofluorescenza (IFA) test immunoenzimatici (EIA) sequenza genomica ibridazione con sonde molecolari reazioni di amplificazione

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