MEDICINA DI LABORATORIO: MICROBIOLOGIA CLINICA

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1 MEDICINA DI LABORATORIO: MICROBIOLOGIA CLINICA Giovanni Di Bonaventura, PhD Università G. D Annunzio di Chieti-Pescara tel (541509) gdibonaventura@unich.it

2 LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA CLINICA Compito principale della Microbiologia Clinica, nell ambito della Medicina di Laboratorio, è quello di porre diagnosi eziologica, ossia identificare l agente patogeno responsabile di una malattia infettiva allo scopo di suggerire un appropriato trattamento terapeutico. Altri obiettivi sono: - valutare l efficacia della terapia - valutare la presenza di portatori sani (potenziale fonte di contagio in comunità) Il Laboratorio di Microbiologia fornisce: sostanziale supporto alla diagnosi, al trattamento ed alla prevenzione della patologia da infezione, sia quella sostenuta da patogeni primari (in soggetti normoreattivi) che quella sostenuta da patogeni opportunisti o condizionati (in soggetti con difese compromesse)

3 Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive Esigenza di utilizzare metodologie scientificamente valide ed eseguibili in tempi accettabili Necessità di acquisire in tempi rapidi informazioni utili alla diagnosi ed alla terapia

4 La Qualità del servizio diagnostico dipenderà dall equilibrio: Consapevolezza delle urgenti necessità cliniche Capacità tecniche Risorse finanziarie disponibili

5 FASE PRE-ANALITICA in MICROBIOLOGIA Rappresenta un momento cruciale nell ambito del processo di Laboratorio, durante la quale si compie il 46% degli errori Rappresenta un fondamentale momento di interfaccia tra il laboratorio e le altre parti interessate al processo Significa occuparsi di come il laboratorio è in grado di rispondere ai bisogni di chi vi si rivolge

6 FASE PRE-ANALITICA in MICROBIOLOGIA 1. Richiesta del Clinico (scelta degli esami) 2. Informazione e Preparazione del Paziente 3. Raccolta del campione 4. Identificazione del campione 5. Trasporto del campione FASE ANALITICA

7 Quali strumenti ci possono aiutare a gestire la qualità nella fase pre-analitica? Una richiesta congua rispetto al quesito diagnostico (scheda ottica, informazioni varie..) Un campione appropriato alla richiesta e rappresentativo della patologia sulla quale si indaga La conformità del prodotto in entrata che si realizza attraverso l uso di protocolli (istruzioni su esami effettuati, modalità di prelievo, trasporto e conservazione)

8 Appropriatezza della fase pre-analitica L appropriatezza di tutta la fase preanalitica si traduce in maggiore qualità del servizio diagnostico e maggiore sicurezza dell operatore Solo la stretta collaborazione tra tutte le figure coinvolte a diverso titolo nell indagine microbiologica (che ha inizio al letto del malato con la decisione di richiedere le indagini fino al momento dell utilizzo dei referti) ed il rispetto in tutte le fasi delle corrette procedure può assicurare la piena valorizzazione dell indagine microbiologica.

9 Responsabilità del Clinico Raccogliere il campione in maniera corretta Identificare adeguatamente il campione Compilare in maniera adeguata il modulo di richiesta Inoltrare tempestivamente il campione al Laboratorio o, qualora non fosse possibile, conservarlo con modalità idonee

10 Responsabilità del Microbiologo Clinico Definire precise linee guida sulle modalità di prelievo, conservazione e trasporto specifiche per ogni tipo di campione Monitorare la loro osservanza e applicazione Le tabelle di prelievo e di conservazione dei campioni per indagini batteriologiche", devono essere utili ai fini di assicurare la "qualità" dei campioni destinati ad indagini microbiologiche, con l obiettivo di qualificare l indagine microbiologica e il suo contributo alla cura del paziente. Tutti gli operatori assicurano comunque la loro disponibilità a fornire ulteriori chiarimenti o le indicazioni che, di volta in volta, si dovessero rendere necessarie, in particolare per: indicazioni nella scelta delle indagini, modalità di raccolta, interpretazione dei risultati, informazioni epidemiologiche.

11 FASE PRE-ANALITICA 1. Richiesta degli esami di laboratorio Il Laboratorio fornisce supporto indispensabile alla pratica clinica. Il ricorso ad esso deve essere comunque e sempre ragionato. Nella pratica clinica è indispensabile procedere alla: inquadramento clinico-epidemiologico dell infezione individuazione dell organo o degli organi interessati formulazione del sospetto diagnostico scelta del materiale patologico da inviare al laboratorio La limitazione delle risorse economiche già condiziona e condizionerà sempre più in futuro gli interventi medici. Dunque, la valutazione del rapporto costo-beneficio dovrà essere tenuta in sempre maggiore considerazione dal medico in ogni sua scelta ivi inclusa quella concernente il ricorso all ausilio laboratoristico.

12 FASE PRE-ANALITICA 1. Richiesta degli esami di laboratorio La richiesta di accertamenti microbiologici è giustificata: nella patologia infettiva ad etiologia definita, per diagnosi di forme clinicamente atipiche o iniziali, per la determinazione della sensibilità ai farmaci. nelle sindromi polietiologiche, per indicazioni terapeutiche (sempre, se in assenza di specifiche informazioni epidemiologiche). nella patologia infettiva del paziente immunocompromesso, per indicazioni terapeutiche (quasi sempre necessarie). in ogni caso, per valutazioni epidemiologiche indispensabili per lo studio della circolazione dei microrganismi e la identificazione dei fattori di rischio, l adozione di idonee misure preventive, la definizione di un corretto approccio diagnostico e terapeutico.

13 Lo studio della Microbiologia Clinica deve essere pertanto finalizzato alla: Acquisizione di conoscenze sulle complessive potenzialità diagnostiche del laboratorio di microbiologia e sulla possibilità che esso fornisca indicazioni per la realizzazione di una terapia mirata delle malattie da infezione e per la messa a punto di adeguate strategie di prevenzione. Valutazione del ruolo e della incidenza dei singoli microrganismi nella eziopatogenesi delle diverse malattie da infezione, della loro circolazione in situazioni ambientali differenti, della loro capacità di esibire resistenze ai farmaci antimicrobici, della circolazione - nelle popolazioni microbiche - dei determinanti genetici di resistenza, con acquisizione, in questo caso, di indicazioni per la realizzazione di una terapia ragionata che eviti, quando non richiesto, il ricorso al laboratorio diagnostico di microbiologia, o che comunque possa essere adottata in attesa delle sue risposte.

14 FASE PRE-ANALITICA 2. Informazione e preparazione del Paziente Il Paziente deve essere adeguatamente istruito sulle corrette modalità di prelievo, conservazione e trasporto del campione biologico Esempio: Prelievo urine tecnica del mitto intermedio Prelievo dell espettorato

15 FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico Campione clinico: materiale biologico da esaminare per verificare la presenza o assenza di specifici microrganismi patogeni Può essere prelevato da: siti sterili (sangue, midollo, liquido cefalo-rachidiano (liquor), liquido pleurico/pericardico/peritoneale/articolare, vie respiratorie inferiori, urine, tessuti profondi) ogni isolamento ha significato eziologico siti contaminati da flora autoctona (bocca, naso, vie respiratorie superiori, feci, espettorato, tratto gastro-intestinale, tratto genitale femminile, terzo distale dell uretra, cute) i risultati vanno interpretati a seconda del caso necessaria una richiesta mirata del clinico, volta alla ricerca di uno o più specifici patogeni nel contesto dell abbondante flora contaminante Ad ogni campione è associato un potenziale rischio biologico per la salute degli operatori sanitari

16 Flora microbica residente Tutte le superfici corporee esposte (a contatto con l ambiente circostante) (bocca, naso, intestino, cute, vie genitali femminili, uretra) sono colonizzate da una flora autoctona Svantaggi può contaminare i campioni può causare malattia Vantaggi è in grado di proteggere dalle infezioni prevenendo la colonizzazione delle superfici epiteliali da parte dei patogeni (resistenza alla colonizzazione) la riduzione (o rimozione) della flora normale mediante impiego di antibiotici può causare superinfezioni, generalmente sostenute da microrganismi resistenti

17 Tipologie di campione clinico Campione prelevato da una zona in cui coesistono patogeni e flora residente (tampone) Campione INDIRETTO: prelevato previo passaggio in una zona con flora residente (lavaggio bronco-alveolare) Campione DIRETTO: il patogeno è localizzato in un sito normalmente sterile ed una barriera (la cute, generalmente) deve essere superata per la sua raccolta (liquor, ago-aspirato) Campioni INUTILI a fini diagnostici: non vanno prelevati in quanto non forniscono alcuna indicazione (vomito, aspirato gastrico, contenuto intestinale, etc.) INSERIRE FIG 1/TAB 3 PAG 41 (CEVENINI)

18 FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico L attendibilità dell esame batteriologico dipende da vari fattori, tra i quali molto importante è l adeguata raccolta (appropriatezza) del campione. In particolare, il campione dovrebbe essere: A. raccolto nel momento giusto; B. prelevato da un distretto corporeo rappresentativo della patologia infettiva; C. prelevato in quantità sufficiente da poter effettuare i tests diagnostici necessari; D. raccolto in maniera da evitare contaminazioni.

19 FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico APPROPRIATEZZA del campione: QUANDO A. Il campione dovrebbe essere prelevato nel momento giusto nella fase acuta della malattia (carica microbica maggiore) prima dell inizio di una terapia antimicrobica, quando possibile, o a distanza di almeno 48 h dalla sua sospensione gli antibiotici interferiscono con la crescita microbica e influiscono sull esito dei test di laboratorio per cui se non è possibile interrompere il trattamento è necessario segnalarlo al laboratorio, indicando anche lo schema terapeutico.

20 FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico APPROPRIATEZZA del campione: DOVE B. Il campione deve essere prelevato da un distretto corporeo rappresentativo dell area infetta. Esempio: La febbre tifoide ha un caratteristico decorso bimodale: una fase precoce (1 e 2 settimana), caratterizzata da febbre e costipazione, durante la quale la emocoltura è positiva nel % dei casi, mentre la coprocoltura è frequentemente negativa; una seconda fase (3 settimana), spesso diarroica, durante la quale Salmonella typhi può essere isolata più frequentemente dalle feci e con minore frequenza dal sangue. Il sospetto clinico di febbre tifoide, unito alla conoscenza della storia naturale di questa malattia infettiva, suggerisce, pertanto, la ricerca del microrganismo nel sangue durante la 1 e 2 settimana e nelle feci nella 3 e 4 settimana.

21 FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico APPROPRIATEZZA del campione: QUANTO C. Il campione deve essere prelevato in quantità sufficiente per poter effettuare i tests diagnostici necessari. Esempio: Le batteriemie sono generalmente pauciparassitemiche. La sensibilità dell esame emocolturale è, quindi, influenzata dalla quantità del campione prelevato e dalla frequenza di prelievo (max 3 prelievi/die) Two blood culture sets (10 ml in both aerobic and anerobic bottles) before administration of antibiotics is 98% sensitive (J. Clin. Microbiol. 1998; 36: ) Nel tifo e nella brucellosi la batteriemia è continua e, quindi, il momento del prelievo è meno critico

22 FASE PRE-ANALITICA 3. Raccolta del campione clinico APPROPRIATEZZA del campione: COME D. Il campione deve essere raccolto in maniera da evitare contaminazioni Se il prelievo non viene eseguito con modalità rigorosamente asettiche, altri microorganismi (flora autoctona ) non responsabili della patologia potrebbero contaminare i campioni e falsare così il risultato delle indagini microbiologiche Esempi: - La ricerca di Streptococcus pyogenes va effettuata a mezzo di un tampone nelle fosse peritonsillari, evitando il contatto con l orofaringe. - Nella raccolta di un campione endometriale, si deve cercare di limitare la contaminazione con la flora vaginale.

23 FASE PRE-ANALITICA 4. Identificazione del campione Il contenitore deve essere opportunamente contrassegnato e confezionato prima del suo trasporto. I contenitori inviati in laboratorio debbono essere identificati con l'etichetta riportante il relativo codice a barre ed accompagnati da un foglio di richiesta indicante: Identificativo del paziente (nome, cognome, età, sesso) Provenienza anatomica del campione Nominativo del prelevatore Data ed ora di campionamento (informazione critica!) Diagnosi clinica presuntiva (eventuale) Schema del trattamento antibiotico in corso

24 FASE PRE-ANALITICA 5. Trasporto del campione Al fine di ottenere la massima recovery dei microrganismi, il campione deve essere trasportato: in adeguati contenitori sterili, per assicurare la corretta esecuzione delle indagini microbiologiche e consentire il corretto trasporto e manipolazione dal campione; rapidamente: il trasporto del campione frequentemente causa una riduzione della vitalità dei microrganismi in esso presenti; in adeguati terreni di trasporto, se necessario (es. tamponi), al fine di mantenere inalterata la facies microbica del campione, conservandone le caratteristiche possedute al momento del prelievo; Terreni liquidi o semisolidi (agarizzati) a temperatura controllata :generalmente a +4 C, occasionalmente a temperatura ambiente Trasporto in sistemi dedicati, come nel caso della ricerca di germi anaerobi

25 FASE PRE-ANALITICA 5. Trasporto del campione L invio deve inoltre avvenire garantendo la sicurezza nel trasporto e l isolamento del campione, per evitare dispersione del materiale biologico e l eventuale contaminazione di altri materiali, di attrezzature e del personale che dovrà manipolare il campione stesso trasportare il campione nelle apposite buste di plastica a due scomparti: uno per il campione biologico, l altro per il modulo di richiesta debitamente compilato Nel caso in cui fosse impossibile inviare immediatamente il campione al Laboratorio, la conservazione dello stesso deve avvenire secondo le indicazioni fornite dal Microbiologo: Ad esempio: feci e urine (+4 C per max 6-8 ore) Qualora ci fosse la necessità di inviare campioni in orario diverso, è bene prendere accordi con il Laboratorio prima della sua raccolta ed invio

26 Criteri per definire un campione non idoneo per una diagnosi microbiologica (non conformità nella fase pre-analitica) Campione non identificabile: Modulo di richiesta esame mancante od incompleto Contenitore impropriamente identificato od anonimo Campione contaminato da flora orofaringea Impropria conservazione e/o trasporto (tempo, temperatura, contenitore) contenitore non sterile contenitore non perfettamente chiuso o danneggiato (rischio biologico per tutti gli operatori: per chi preleva, chi trasporta e chi analizza il materiale) trasporto ritardato (urine: > 1h a RT; campioni per gonorrea: >1h non in terreno di trasporto) Campione inviato in quantità insufficiente (ricerca micobatteri) o non idoneo (prelevato in paziente antibiotizzato; saliva vs escreato)

27 Riflessioni sulla fase pre-analitica Il contributo di chi richiede e preleva i campioni alla qualità degli esami di laboratorio dipende sia dalla consapevolezza del fenomeno che nella capacità di attenersi a quella serie di norme che permettono di ridurre al minimo i fattori che possono modificare il risultato finale delle analisi. Un campione non idoneo può infatti causare il mancato isolamento del microorganismo responsabile dell infezione. Inoltre, si evitano in tal modo "dispersioni" di germi patogeni, specie quelli resistenti (MRSA, Pseudomonas spp), che vanno indirettamente ad incrementare l'incidenza delle infezioni nosocomiali. Il risultato dell'esame batteriologico sarà qualitativamente valido e più rapido. In ultima analisi, gli operatori coinvolti nella fase pre-analitica sono responsabili della qualità del percorso diagnostico del paziente almeno fino all arrivo del campione in Laboratorio!

28 DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

29 DIAGNOSI BATTERIOLOGICA DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dell agente patogeno mediante: A. Esame microscopico (batterioscopico) B. Esame colturale (isolamento) C. Ricerca di antigeni D. Ricerca di sequenze geniche

30 Diagnosi DIRETTA A. Esame microscopico Campioni a fresco oppure fissati (al calore o chimicamente) La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente: microscopia in campo oscuro il condensatore illumina obliquamente l oggetto in modo che le strutture cellulari riflettano la luce verso l occhio dell operatore, a differenza dell ambiente circostante. Ricerca di spirochete (T. pallidum) nelle lesioni cutanee associate alla sifilide. microscopia in contrasto di fase Le differenze nell indice di rifrazione nei campioni sono convertite in differenze nella intensità della luce nell immagine. Consente la visualizzazione di strutture in campioni non colorati (funghi e parassiti, ma anche batteri). microscopia in fluorescenza le molecole fluorescenti assorbono luce ad una e la riemettono ad una più lunga. Tale differenza viene rilevata dall impiego di filtri. Utile per l identificazione di batteri e funghi. Spesso si utilizzano colorazioni dedicate Gram, alcool-acido resistenza (Ziehl Nielsen)

31 Diagnosi DIRETTA A. Esame microscopico ( a fresco ) Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente colorabili con le tecniche disponibili, evidenziabili invece in campo oscuro: ricerca di Spirochete (Treponema, Borrelia) ricerca di Leptospire Osservazione in campo oscuro: Treponema pallidum

32 Diagnosi DIRETTA A. Esame microscopico (previa colorazione) Campioni fissati (al calore o chimicamente) Fornisce indicazioni riguardo: Idoneità del campione (espettorato: neutrofili / cellule squamose) Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili Presenza/assenza di microrganismi (batteri, funghi, parassiti) Colorazione del campione con tecnica di Gram: morfologia (cocchi, bastoncelli,cocco-bacilli, lanceolata) disposizione (catenelle, clusters, diplococchi) quantità assoluta di batteri presenti percentuale relativa di Gram+ e Gram- localizzazione in sede intra- od extra-cellulare Specifiche colorazioni: colorazione di Ziehl Nielsen (bacilli alcool-acido resistenti) verde malachite (endospore batteriche) colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina) colorazione di Leifson (flagelli)

33 Diagnosi DIRETTA A. Esame microscopico previa colorazione Colorazioni SEMPLICI, che prevedono l impiego di un solo colorante: cristalvioletto fucsina basica blu di metilene Colorazioni DIFFERENZIALI, che prevedono l impiego di più di un colorante: Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen

34 Le colorazioni in microbiologia Allestimento di un preparato (fissazione) (1 di 2) La fissazione garantisce che: i) il materiale venga disteso ed essiccato non venga allontanato dal vetrino nel corso dei successivi lavaggi; ii) le cellule vengano uccise per coagulazione (sicurezza biologica e maggiore penetrazione ai coloranti) Partendo da una sospensione batterica (brodocoltura) centro di un vetrino pulito Se si preleva il materiale (colonie) da terreno agarizzato, aggiungere una goccia di soluzione tampone (PBS) al campione

35 Le colorazioni in microbiologia Allestimento di un preparato (fissazione) (2 di 2) Aiutandosi con un ansa, stemperare il campione nel tampone/brodo e stenderlo fino a coprire circa la metà della superficie del vetrino (preparazione dello smear) Lasciare essiccare il preparato all aria o forzatamente (bunsen). Fissare il preparato esponendo il vetrino (lato non contenente il campione) per 4-5 volte direttamente alla fiamma

36 Hans Christian Joachim Gram Nato a Copenhagen il 13 Settembre1853. Batteriologo danese. Nel 1884 mise a punto la colorazione omonima nel tentativo di differenziare Klebsiella pneumoniae dagli pneumococchi

37 Colorazione di Gram Tecnica 1. Fissare gli strisci al calore 2. Coprire con cristalvioletto per 1-2 min 3. Lavare con acqua. Non asciugare 4. Coprire con la soluzione iodio-iodurata di Lugol per 1-2 min 5. Lavare con acqua. Non asciugare 6. Decolorare per 10 sec con alcool-acetone 7. Lavare con acqua. Non asciugare 8. Coprire con safranina (2.5% in alcool 95%) per 1-2 min 9. Lavare con acqua e lasciare asciugare Colorazione di Gram: colorazione regressiva e differenziale

38 Colorazione di Gram Principio Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all interno della cellula. Il decolorante condensa, per disidratazione, la struttura peptidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene catturato dalla parete cellulare. Nei batteri Gram- il decolorante agisce come solvente lipidico, dissolvendo la membrana esterna della parete cellulare, permettendo così il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.

39 Colorazione di Gram Osservazione microscopica I batteri Gram+ (Staphylococcus spp, Streptococcus spp, etc) appaiono colorati in blu (Staphylococcus epidermidis) I batteri Gram- (E. coli, P. aeruginosa, Neisseriaceae, etc.) appaiono colorati in rosso (Escherichia coli)

40 Colorazione di Gram Casi particolari Batteri Gram+ possono apparire come Gram- in presenza di colture vecchie, quando morti, od in presenza di danni alla parete per azione di antibiotici Trichomonas vaginalis (protozoo) è Gram+ Candida albicans (lievito), Aspergillus fumigatus (muffa) sono Gram+ Occasionalmente, anche Mycobacterium tuberculosis è

41 Colorazione di Gram Utilità clinica (1 di 2) Idoneità del campione da sottoporre a coltura Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva) meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni piogene Suggerire la necessità di attuare tecniche di coltivazione non routinarie anaerobi, funghi Ausilio nella interpretazione dell esame colturale angina di Vincent (spirochete, fusobatteri) paziente antibiotizzato Informazioni sulla natura dell infezione infezioni poli/mono-microbiche

42 Colorazione di Gram Utilità clinica (2 di 2) Quindi: La conoscenza del risultato di una colorazione di Gram può salvare una vita! Tuttavia: La colorazione di Gram non deve essere effettuata su campioni clinici (feci, escreato) in cui la flora patogena non può essere differenziata da quella commensale La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di: Legionella spp. (immunofluorescenza) bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (Ziehl- Neelsen)

43 Colorazione di Gram L eccezione La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i batteri. Mycobacterium tuberculosis, M. leprae incapacità di colorare la cellula per la natura cerosa dell involucro esterno, altamente impermeabile ai coloranti colorazione di Ziehl-Nielsen

44 Mycobacterium spp. Parete cellulare Composizione: Grosse quantità di glicolipidi: acido micolico (60%) complessi lipidi-arabinogalattani lipoarabinomannani Scarso petidoglicano Funzioni: Condiziona la forma e previene la lisi osmotica (peptidoglicano) Inibisce ingresso composti chimici crescita lenta maggiore resistenza agli agenti chimici maggiore resistenza alla fagocitosi Mediante l acido micolico, induce la sintesi di citochine (TNF- ) Colorazioni: Ziehl-Neelsen, Kinyoun

45 Colorazione di Ziehl-Neelsen Tecnica (1 di 2) Step 1: versare la fucsina fenicata (fucsina basica in acqua, alcool e fenolo) Step 2: fare evaporare il colorante alla fiamma per 5 min lavare con acqua

46 Colorazione di Ziehl-Neelsen Tecnica (2 di 2) Step 3: Decolorare (2 min, circa) con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante Lavare con acqua Step 4: Contrastare con blu di metilene per 1-2 min Lavare con acqua

47 Colorazione di Ziehl-Neelsen Osservazione microscopica Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rosso Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu

48 Le colorazioni in Microbiologia Colorazioni speciali La colorazione negativa consiste nella colorazione di sottofondo con un colorante acido (nero nigrosina). Viene usata quando un organismo od una sua struttura non viene colorata facilmente (esempio, la capsula). La colorazione delle spore richiede calore per facilitare la penetrazione del colorante (verde di malachite, fucsina fenicata) attraverso gli involucri sporali. La colorazione dei flagelli impiega un mordenzante (precipitazione dei sali dell acido tannico) per evidenziare la struttura flagellare altrimenti invisibile (d: nm)

49 Le colorazioni in Microbiologia Colorazione di flagelli Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori (da: Di Bonaventura et al., J. Clin. Microbiol., 1997)

50 Diagnosi DIRETTA A. Esame microscopico Le informazioni desunte dall esame microscopico possono consentire una diagnosi presuntiva e, comunque, risultano importanti per orientare l iter diagnostico (es. scelta dei terreni colturali per l isolamento) TUTTAVIA: L esame microscopico può fornire precise indicazioni diagnostiche qualora si esamini: un materiale normalmente sterile o comunque proveniente da zone non in comunicazione con l esterno (liquido cefalorachidiano, essudato pleurico o peritoneale, materiale purulento proveniente da raccolte chiuse) un materiale nella cui popolazione batterica normale non siano compresi batteri con i caratteri morfologici e/o tintoriali del batterio osservato

51 DIAGNOSI BATTERIOLOGICA DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dell agente patogeno mediante: A. Esame microscopico (batterioscopico) B. Esame colturale (isolamento) C. Ricerca di antigeni D. Ricerca di sequenze geniche

52 Diagnosi DIRETTA B. Esame colturale (isolamento) Quasi tutti i batteri di interesse medico possono essere coltivati in sistemi artificiali (in vitro) denominati terreni di coltura. I terreni di coltura si distinguono in base allo stato fisico: LIQUIDI (brodo). Composizione del brodo normale : peptone (digestione parziale di proteine animali) 0,5% estratto di carne 0,3% NaCl (per rendere isotonico il terreno) tampone fosfato (PBS; ph 7,0) H 2 O SOLIDI (brodo normale solidificato con agar). L agar: polisaccaride acido (70% agarosio, 30% agaropectina) estratto da alghe rosse del genere Gelidium addizionato al brodo in quantità pari a 1,5-2% liquido a temperature 80 C, gelifica a C non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri

53 Diagnosi DIRETTA B. Esame colturale (isolamento) I terreni di coltura si distinguono in base allo stato chimico: Composizione DEFINITA: molto costosi, utilizzati esclusivamente per l identificazione di batteri con particolari esigenze nutrizionali Composizione INDEFINITA: contengono sostanze naturali quali peptone, siero, liquido ascitico, sangue, estratto di lievito etc.

54 TERRENI DI COLTURA Terreni minimi Contengono carbonio, azoto, zolfo e fosforo sotto forma di sali inorganici, aggiunti in concentrazione nota Terreni di arricchimento Caratterizzati dall aggiunta di: sangue siero estratto di lievito infusi di cuore e cervello carboidrati amminoacidi Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni particolarmente esigenti dal punto di vista nutritivo

55 TERRENI DI COLTURA Terreni selettivi Contengono agenti selettivi quali: coloranti (cristalvioletto, verde brillante, fucsina basica) antibiotici, con attività batteriostatica/battericida nei confronti dei microrganismi contaminanti (flora autoctona) Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni che si isolano in campioni contaminati da flora microbica residente (cute, faringe, naso, intestino, vagina)

56 TERRENI DI COLTURA Terreni differenziali Contengono carboidrati (zuccheri) ed indicatori di ph (rosso fenolo, blu di bromofenolo), che consentono di distinguere tra microrganismi in grado di fermentare specifici carboidrati, in base alla colorazione delle colonie e alla loro morfologia. Esempio: agar sale mannite o terreno di Chapman. Contengono sangue (5%, di montone o di cavallo) utilizzato per evidenziare la capacità emolitica di alcuni batteri: α-emolisi = emolisi parziale, con formazione di un alone verde intorno alla colonia (degradazione di bilirubina a biliverdina) β-emolisi = emolisi completa, con formazione di un alone trasparente intorno alla colonia γ-emolisi = mancanza di emolisi

57 TERRENI DI COLTURA Terreni differenziali Mannitol Salt Agar (agar sale-mannite, Chapman agar): terreno selettivo (per gli stafilococchi) e differenziale (S. aureus fermentante vs Staphylococcus spp non fermentanti). Agar sangue (5% sangue di montone) (sheep blood agar, SBA): evidente β-emolisi.

58 Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica; R. Cevenini, V.Sambri ; Piccin

59 FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA TEMPERATURA Psicrofili -10 C a +20 C (L. monocytogenes, 5-8 C) Mesofili +10 a +50 C Termofili +40 a +70 C

60 FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA OSSIGENO Aerobi obbligati: crescono solo in presenza di ossigeno atmosferico Anaerobi facoltativi: crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di ossigeno; crescono bene in atmosfera addizionata di CO 2

61 FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA OSSIGENO Aerobi obbligati Aerobi facoltativi Anaerobi obbligati Anaerobi facoltativi Microaerofili

62 CRESCITA IN ANAEROBIOSI I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido, depositandosi sul fondo come sedimento. Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali. Terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici (tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l ossigeno atmosferico fino ad esaurirlo. Incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche (bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono umidificate, producono CO 2 e H 2 e successivamente H 2 O con scomparsa dell ossigeno.

63 Crescita in anaerobiosi Cappa (camera) per anaerobiosi Giara per anaerobiosi Figure 6.5

64 FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA ph Acidofili: crescono al di sotto di ph 6 (ph 2 6, generalmente) funghi e lieviti (ph 5-6) Neutrofili: crescono tra ph 6 8 maggior parte dei batteri Alcalofili: crescono a ph > 8 (ph 8 9.5, generalmente)

65 FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA PRESSIONE OSMOTICA I microrganismi replicano generalmente meglio in un terreno con concentrazione osmotica più bassa della propria, in quanto questa condizione permette la penetrazione dell acqua all interno della cellula. La pressione osmotica del terreno può essere modificata in base alla concentrazione di cloruro di sodio o di glucosio Alofili: crescono ad elevate [saline] (generalmente 1 M), tollerando elevate pressioni osmotiche (es. stafilococchi)

66 CRESCITA BATTERICA IN TERRENO LIQUIDO Gran parte dei batteri patogeni ha un tempo di duplicazione nell ordine dei min. In particolare: Escherichia coli (in vitro) min Escherichia coli (in vivo) 12 ore Mycobacterium tuberculosis (in vitro) 18 ore Treponema pallidum (in vitro) 33 ore

67 ISOLAMENTO BATTERICO E necessario tenere conto del sito di provenienza del campione: pus liquido cefalo rachidiano sangue generalmente contengono un solo tipo di microrganismo materiale fecale tamponi oro-faringei altri materiali biologici generalmente contengono microrganismi contaminanti, oltre al patogeno o ai patogeni responsabili dell infezione

68 ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN SUPERFICIE Utilizzare terreni solidi (agarizzati) preparati in piastre di Petri Deporre una piccola quantità di materiale patologico da esaminare al margine della piastra (se il materiale è molto denso stemperarlo con soluzione fisiologica o brodo sterile) Mediante l utilizzo di una spatola o di un ansa, distribuire il materiale sulla superficie del terreno in modo da avere la formazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di semina e colonie isolate nell ultimo tratto Successivamente, prelevare sterilmente i batteri di una colonia isolata (formata cioè da una sola cellula batterica iniziale) ed allestire una coltura pura

69 Tecnica di semina per isolamento

70 Semina per isolamento

71 DIAGNOSI BATTERIOLOGICA DIAGNOSI DIRETTA: IDENTIFICAZIONE Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terreni solidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate si procede alla identificazione: ID PRESUNTIVA caratteri microscopici» colorazioni (forma, organizzazione) caratteri macroscopici» aspetto coloniale ID FINALE (DEFINITIVA) biochimica immunologica molecolare

72 ID presuntiva dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2) Forma Rilievo puntiforme d < 1 mm effuso sottile, allungato circolare piatto filamentosa irregolare, a filo intrecciato sopraelevato rizoide irregolare, ramificata convesso irregolare umbonato

73 ID presuntiva dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie (2 di 2) Superficie Margine liscia intero rilevata ondulata ondulato radiata eroso concentrica anelli concentrici filamentoso rugosa raggrinzita arricciato

74 Aspetto macroscopico coloniale: diversi fenotipi

75 DIAGNOSI DIRETTA Identificazione dei microrganismi 1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen 2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc. crescita su terreni selettivi 3. Caratteristiche biochimiche 4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) 5. Identificazione molecolare

76 IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA La determinazione di specie si basa sulla capacità del microrganismo in esame di: metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per via fermentativa (via anaerobica) produrre specifici enzimi produrre specifici prodotti metabolici Utilizzo di metodi manuali od automatizzati. Identificazione possibile in tempi rapidi (4-6 h).

77 ID BIOCHIMICA Metodo manuale: API (BioMérieux) Identification System La fermentazione degli zuccheri e l utilizzazione di altri substrati (ureasi, indolo, gelatina, etc.) viene evidenziata da un indicatore di ph responsabile della reazione colorimetrica. Anaerobes (Rapid ID 32 A) Enterobacteriaceae (ID 32 E) Gram Negative Rods (ID32 GN) Staphylococci (ID32 STAPH ) Streptococci (Rapid ID32 STREP) Yeasts (ID32 C)

78 ID BIOCHIMICA Metodo automatizzato: VITEK (BioMérieux) Due tipologie di card: per la identificazione (30 pozzetti/card contenenti dei substrati biochimici in forma disidratata) e l antibiogramma. Non sono richiesti reagenti addizionali, riducendo così il rischio di omissione o di errore. Il database del VITEK copre oltre 300 specie sia di origine clinica che industriale. Possibilità di generare reports statistici epidemiologici (es. frequenza di antibiotico-resistenze) Gram-positives (GP) Gram-negatives (GN) Yeasts (YST) Bacillus spp. (BCL) Anaerobes, Corynebacterium (ANC) Neisseria, Haemophilus (NH)

79 Identificazione batterica: Flow charts contenenti dati derivanti dall osservazione Gram e dai tests biochimici importanti nella identificazione di specie.

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82 Identificazione dei microrganismi 1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen 2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc. crescita su terreni selettivi 3. Caratteristiche biochimiche 4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) 5. Identificazione molecolare

83 IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA Ha come obiettivo finale quello di ricerca ANTIGENI microbici direttamente nel campione biologico esaminato. Le tecniche di identificazione sierologica che prevedono l impiego di anticorpi comprendono: A. Reazione di agglutinazione B. Reazione di immunofluorescenza C. Tecniche immunoenzimatiche (ELISA) D. Western blot

84 IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA A. REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE Agglutinazione su vetrino Prevede l impiego di anticorpi, ottenuti in un animale immunizzato, messi a contatto con il batterio o con suoi antigeni solubili Agglutinazione al lattice (AL) Utilizzato per evidenziare gli antigeni polisaccaridici della capsula batterica, costituiti da sequenze ripetitive di zuccheri in grado di legare gli anticorpi in più punti. Per il test si utilizzano anticorpi legati (adsorbiti) a particelle di lattice (adsorbimento in fase solida). Tecniche immunologiche rapide vengono frequentemente utilizzate per la ricerca di antigeni batterici (S. pneumoniae, H. influenzae, E. coli, N. meningitidis) nel liquor (o sul suo centrifugato).

85 Un campione di fluido cerebrospinale viene sottoposto a ricerca di Haemophilus influenzae. Il campione viene mescolato con una sospensione di particelle di lattice ricoperte di anticorpi specifici, diretti contro la capsula di H. influenzae. L interazione tra antigene e anticorpi causa un immediata agglutinazione di particelle (epifenomeno) visibile ad occhio nudo. negativo positivo

86 IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA Il fluorocromo (ad es. fluoresceina) che quando viene eccitato da una luce ad una certa lunghezza d onda (UV) emette una luce ad una lunghezza d onda maggiore (nel visibile). I fluorocromi possono essere legati ad anticorpi modificando la loro capacità di legarsi ad uno specifico antigene: Anticorpi monoclonali (MAb) Prodotti da cellule di ibridoma Riconoscono un singolo epitopo Due tipi di immunofluorescenza: diretta e indiretta Il limite della tecnica è rappresentato dalla necessità di una adeguata consistenza (concentrazione) del batterio ricercato.

87 IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA Si utilizza un anticorpo coniugato con fluoresceina isotiocianato, che sia specifico per l antigene in esame. IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA Si utilizza un anticorpo specifico per l antigene in esame ma non coniugato, che viene riconosciuto da un secondo anticorpo coniugato e diretto contro regioni costanti delle immunoglobuline della specie in cui è stato prodotto il primo anticorpo.

88 Test con anticorpi fluorescenti per la ricerca e l identificazione di antigeni microbici (o tessutali) o di anticorpi diretti contro entrambi. Nel test diretto, l anticorpo marcato con colorante fluorescente è applicato su una sezione di tessuto contenente l antigene, quindi l anticorpo in eccesso viene lavato e l anticorpo rimasto legato viene visualizzato attraverso microscopio a fluorescenza. Nel test indiretto, l antigene è rilevato mediante aggiunta di un anticorpo non marcato e successivamente con un anti-anticorpo marcato con una sostanza fluorescente, che amplifica il segnale (se il primo anticorpo è umano, il secondo anticorpo sarà un anticorpo contro le immunoglobuline umane, prodotto in una specie diversa da quella umana).

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90 IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA A B C A) Treponema pallidum; B) Chlamydia trachomatis; C) Helicobacter pylori

91 IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA C. TEST IMMUNOENZIMATICO (ELISA: enzyme-linked immunodsorbent assay) Si ricopre la superficie plastica di un pozzetto (micropiastra) con anticorpi specifici contro l antigene. Si aggiunge l antigene che viene poi evidenziato da anticorpi, anch essi contro l antigene ricercato, legati covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasi alcalina, -galattosidasi) (sandwich ELISA) La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso la valutazione dell intensità del colore prodotto in risposta alla conversione enzimatica del relativo substrato cromogeno. La reale concentrazione dell antigene viene determinata per confronto con diluizioni standard dell antigene stesso.

92 ELISA test Saggio immunologico su fase solida (test immunoenzimatico, ELISA). (a) L antigene test e aggiunto all anticorpo-1 in fase solida ed il legame e evidenziato aggiungendo un secondo anticorpo marcato con l enzima e valutando l enzima legato (ad esempio perossidasi o fosfatasi alcalina) attraverso una reazione colorimetrica o luminometrica. (b) L anticorpo da saggiare viene aggiunto all antigene in fase solida ed e rilevato aggiungendo un anti-immunoglobulina marcata con enzima che usa un antiimmunoglobulina fluorescente per rilevare l anticorpo legato. Il marcatore nei saggi ELISA può essere una sonda fluorescente piuttosto che un enzima.

93 ELISA test

94 IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA D. WESTERN BLOT Separazione degli antigeni su gel di poliacrilammide in base al peso molecolare (elettroforesi) Trasferimento degli antigeni (bande elettroforetiche) su membrana di nitrocellulosa Incubazione degli antigeni con l anticorpo specifico Esposizione ad un anticorpo secondario (anti-anticorpo primario) marcato con un enzima (perossidasi) La formazione di immunocomplessi (e quindi la presenza dell antigene ricercato) viene evidenziata dall aggiunta di un substrato sul quale agisce l enzima, che provoca la precipitazione di colorante

95 Western blot

96 Identificazione dei microrganismi 1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) colorazione di Gram colorazione di Ziehl-Neelsen 2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc. crescita su terreni selettivi 3. Caratteristiche biochimiche 4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) 5. Identificazione molecolare

97 Tests molecolari Le biotecnologie hanno fornito strumenti diagnostici molto potenti per: la ricerca rapida e l identificazione di patogeni umani la tipizzazione dei microrganismi a fini epidemiologici la ricerca di microrganismi non coltivabili oppure a lenta crescita la determinazione dell antibiotico-sensibilità l indagine diagnostica su campioni negativi all esame colturale

98 IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE: SONDE MOLECOLARI Sonde specifiche a DNA per geni che identificano uno specifico patogeno Le sonde legano il DNA complementare presente nel campione (ibridazione), indicando la presenza del patogeno Permettono di individuare anche esigue quantità di acidi nucleici (elevata sensibilità) La reazione di ibridazione può essere condotta su diverse tipologie di campioni: colonie batteriche preparazioni di DNA purificato campioni clinici

99 < La digestione del DNA per mezzo di enzimi di restrizione, seguita da ibridazione con differenti sonde geniche genera patterns speciespecifici (ossia caratteristici di una specie microbica).

100 Principali tecniche di ibridazione degli acidi nucleici Il DNA target denaturato (singolo filamento) viene direttamente immobilizzato su un supporto solido (p. es., membrana di nitrocellulosa) ed ibridato con una specifica sonda a DNA a singolo filamento marcata, per facilitarne la successiva rivelazione (dot blot). In alternativa, differenti frammenti di DNA con diverso peso possono essere separati attraverso elettroforesi su gel di agarosio, denaturati e poi trasferiti su membrane per l ibridazione con sonda e rilevazione (Southern blot). Se si utilizzano molecole di RNA separate con elettroforesi si parla di Northern blot.

101 DIAGNOSI BATTERIOLOGICA DIAGNOSI DIRETTA: ANTIBIOGRAMMA Una volta eseguita l identificazione del microrganismo in esame, si procede alla determinazione della sensibilità/resistenza dell isolato agli antibiotici (antibiogramma).

102 Tests di antibiotico-sensibilità Obiettivo dei tests per la determinazione della antibiotico- S è di predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica. I tests vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici. I tests sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire la riproducibilità dei risultati. I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dell antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l esperienza professionale.

103 Tests di antibiotico-sensibilità Definizioni MIC (Concentrazione Minima Inibente) è una misura quantitativa dell attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile. NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) pubblica i criteri per la interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità (categorie interpretative). Categorie Interpretative (Sensibilità, S Intermedia, Resistenza) individuate da valori di MIC detti breakpoints (soglia, limite)

104 Interpretazione dei risultati BREAKPOINTS I breakpoints vengono individuati dalla NCCLS in base a: Livelli raggiunti in vivo (sangue, tessuti) dall antibiotico Correlazione tra risultati in vitro (MIC) ed in vivo (risoluzione del caso clinico)

105 Sensibilità Una infezione sostenuta dal ceppo batterico isolato può essere trattata appropriatamente con il dosaggio usuale dell antibiotico testato e raccomandato per il tipo di infezione clinica. Sensibilità Intermedia Gli isolati batterici mostrano MIC corrispondenti a livelli sierici e tessutali di antibiotico per i quali l efficacia potrebbe essere più bassa di quella registrata per gli isolati sensibili. Questa categoria suggerisce l efficacia clinica nei siti corporei dove gli antibiotici sono fisiologicamente concentrati (chinoloni nelle urine) o quando l antibiotico può essere utilizzato a concentrazioni più alte di quelle normali ( -lattamici). Resistenza Questa categoria predice il possibile fallimento dell antibiotico testato. I ceppi resistenti non sono inibiti dalle normali concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo dall antibiotico in seguito a somministrazione di dosi normali.

106 Tecniche per la determinazione in vitro dell antibiotico-sensibilita Brodo diluizione (micro- e macrometodo) Diffusione in agar (Kirby-Bauer) Agar diluizione Sistemi Automatizzati

107 ANTIBIOGRAMMA Metodo della brodo diluizione Preparare una soluzione madre di antibiotico Allestire diluizioni seriali 2-fold dell antibiotico in brodo Mueller- Hinton Preparare un inoculo a DO uguale a (0.5 McFarland) Seminare ogni diluizione di antibiotico con l inoculo standardizzato Incubare a 37 C per ore Seminare un pozzetto controllo (senza antibiotico)

108 MC-FARLAND STANDARDS La scala degli standards di Mc-Farland è rappresentata da una serie di fiale contenenti BaSO 4, di opacità differenti, che permettono la valutazione della densità delle sospensioni batteriche La densità di una sospensione batterica è valutata per confronto con una sospensione di opacità nota contenuta in una fiala dello stesso diametro

109 MC-FARLAND STANDARD Standard Concentrazione batterica 1 x Densità ottica teorica 2 a 550 nm La concentrazione batterica varia secondo le dimensioni dei microrganismi 2 I valori corrispondono alle densità ottiche delle sospensioni batteriche e non a quelle delle particelle di BaSO 4

110 Minima Concentrazione Inibente (MIC) Minima Concentrazione Battericida (MBC).

111 Brodo diluizione NCCLS-breakpoints ANTIBIOTICO S I R Piperacillina Cefazolina Cefotaxime Cefpodoxime Imipenem Vancomicina Gentamicina S = Sensibilità, I = Sensibilità Intermedia, R = Resistenza

112 Tecniche per la determinazione in vitro dell antibiotico-sensibilita Brodo diluizione (micro- e macrometodo) Diffusione in agar (Kirby-Bauer) Agar diluizione Sistemi Automatizzati

113 ANTIBIOGRAMMA Tecnica di Kirby-Bauer Sospendere 4-5 colonie in 4 ml di brodo Incubare a 37 C per 18 ore Immergere un tampone nella brodocoltura e scaricarlo contro la parete della provetta Strisciare il tampone sulla piastra in modo uniforme ruotando la piastra di 60 Applicare i dischi a distanza maggiore di 25 mm dal bordo della piastra e ad distanza tra i centri dei dischi non inferiore a 24 mm Capovolgere la piastra ed incubarla a 37 C per ore Misurare gli aloni di inibizione

114 1 Diffusione in agar (Kirby-Bauer) 2 1. Allestimento brodocoltura da coltura pura 2. Semina brodocoltura Apposizione dischetti antibiotizzati 4. Incubazione (37 C, 18-24h) 5. Misurazione diametro alone di inibizione

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116 Diffusione in agar Risultati

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120 Attività battericida di un antibiotico Infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi Focolaio di infezione situato in distretti anatomici difficilmente accessibili all antibiotico Concentrazione Minima Battericida (MBC): La più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica di almeno il 99.9% (1 germe su elude l azione antibiotica) della popolazione iniziale.

121 Minima Concentrazione Inibente (MIC) Minima Concentrazione Battericida (MBC).

122 MIC/MBC test (Brodo diluizione)

123 MBC/MIC killing quotient Tasso di uccisione = MBC / MIC 1-4 per antibiotici battericidi (beta-lattamici, chinoloni) >4 per antibiotici batteriostatici (sulfamidici, tetracicline)

124 DIAGNOSI BATTERIOLOGICA DIAGNOSI INDIRETTA = volta a rilevare una risposta immune umorale specifica dell ospite all agente infettivo: A. Reazione di fissazione del Complemento B. Reazione di agglutinazione C. Test immunoenzimatico (ELISA) D. Saggio in immunofluorescenza E. Saggio radioimmunologico

125 Diagnosi INDIRETTA La diagnosi INDIRETTA è, ovviamente, più tardiva di quella DIRETTA in quanto si può ricorrere ad essa soltanto quando si sia sviluppata già la reattività immunitaria dell ospite. Ciò non è sempre possibile, come nel caso di pazienti anergici. Le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico, pertanto, soltanto quando l isolamento del microrganismo sia difficoltoso, fallito, o non possibile. L accertamento indiretto non comportando l isolamento del germe, preclude la possibilità di saggiare la sensibilità dell agente etiologico verso i farmaci antimicrobici.

126 Diagnosi INDIRETTA A. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO PRINCIPIO: capacità del Complemento di legarsi agli immunocomplessi METODICA: - il siero del paziente viene scomplementato (privato del Complemento) (30 min, 56 C) - il siero (diluizioni del-) inattivato viene cimentato con l antigene, in presenza di Complemento fresco (di coniglio) aggiunto in quantità nota - se nel siero del paziente sono presenti anticorpi specifici questi si legano all antigene ed il Complemento si lega all immunocomplesso. - si aggiunge, quindi, un sistema rivelatore (eritrociti di montone + anticorpi anti-eritrociti di montone): se il siero del paziente è positivo (cioè contiene anticorpi contro l antigene) gli eritrociti rimangono integri, in quanto il Complemento si è legato al primo immunocomplesso se il siero del paziente è negativo (cioè non contiene anticorpi contro l antigene) gli eritrociti vengono lisati, in quanto il Complemento si lega all immunocomplesso eritrocita+anticorpo anti-eritrocita La reazione si evidenzia con liberazione di emoglobina Un classico esempio applicativo della FC è la reazione di Wassermann, per la diagnosi di sifilide

127 Diagnosi INDIRETTA A. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

128 Diagnosi INDIRETTA A. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO Nella reazione FC la lisi del globulo rosso indica una reazione negativa, l assenza di lisi e un test positivo per la presenza di anticorpi. Questa figura mostra una reazione FC per evidenziare anticorpi verso Coxiella burnetii (agente eziologico della polmonite atipica). Nella linea superiore usando diluizioni di un siero in fase acuta, il complemento e stato fissato solo nei primi 5 pozzetti (il titolo dell anticorpo e 1/32), mentre con il siero convalescente nella seconda linea non c e lisi dei globuli rossi per tutte le diluizioni di siero e quindi il titolo dell anticorpo e uguale o maggiore di 1/512. Questo dimostra che un aumento di 4 volte nel titolo del siero tra la fase acuta e di convalescenza e indicativo dell infezione da Coxiella burnetii.

129 Diagnosi INDIRETTA B. TEST DI AGGLUTINAZIONE L antigene corpuscolato consiste di una sospensione di microrganismi, celule (emazie) o particelle uniformi (lattice) sulle quali siano adsorbiti gli antigeni Diluzioni scalari (2-fold) del siero vengono cimentate con una quantità fissa di antigene In presenza di siero positivo, ossia contenete gli anticorpi specifici, si formano aggregati di complessi immuni che risultano visibili

130 Diagnosi INDIRETTA B. TEST DI AGGLUTINAZIONE Titolo anticorpale = reciproco della più alta diluizione positiva all agglutinazione