Valutazione della prevalenza di aziende da latte infette da Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis nel sud Italia

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1 F. Ostanello et al. Large Animal Review 2015; 21: Valutazione della prevalenza di aziende da latte infette da Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis nel sud Italia N F. OSTANELLO 1, A. SERRAINO 1, N. ARRIGONI 2, M. RICCHI 2, P. BONILAURI 3, F. GIACOMETTI 1 1 Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie - Università di Bologna - Via Tolara di Sopra, Ozzano Emilia (BO) 2 Centro di Referenza Nazionale per la Paratubercolosi, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia-Romagna, Sezione di Piacenza - Strada della Faggiola, Gariga di Podenzano (PC) 3 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia-Romagna, Sezione di Reggio Emilia Via Pitagora, Reggio Emilia RIASSUNTO In questo lavoro è stata valutata la prevalenza di aziende di bovine da latte infette da Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in tre Regioni dell Italia meridionale attraverso una procedura di screening che prevedeva l analisi ripetuta sia di campioni di latte di massa (esaminati mediante test ELISA), sia dei filtri dell impianto di mungitura (esaminati mediante real-time PCR) e prelevati in 569 allevamenti da latte. Un totale di 121 allevamenti sono risultati positivi allo screening (21,3%; IC 95%: 18,0-24,9%). Per stimare la prevalenza apparente intra-aziendale (PA), in 102 dei 121 allevamenti risultati positivi allo screening è stato esaminato, mediante test ELISA, il latte individuale di tutti gli animali in lattazione. Il prelievo del latte individuale è stato realizzato anche in un campione casuale di 24 aziende risultate negative allo screening. Complessivamente, sono stati sottoposti a test ELISA campioni di latte individuale. La PA varia dallo 0,0% al 22,7% (media 5,7%). Il confronto tra i dati delle diverse Regioni non ha evidenziato differenze significative della prevalenza di aziende infette o della PA intra-aziendale. La procedura di screening è stata in grado di rilevare il 56,2% degli allevamenti con PA 2,0% fino ad un massimo del 100% degli allevamenti con PA 8,0%. Complessivamente, la procedura di screening è in grado di individuare l 85,6% degli allevamenti con almeno 1 capo positivo al test ELISA del latte individuale. La procedura di screening utilizzata è relativamente economica (circa 60 euro) e rappresenta un utile strumento per l individuazione di allevamenti ad alto rischio di diffusione dell infezione e contaminazione del latte. Potrebbe quindi essere applicata, nel contesto di piani volti a ridurre la prevalenza di infezione negli allevamenti da latte e/o a ridurre la contaminazione del latte, per assegnare una scala di priorità adeguata alle misure di controllo da adottare nei singoli allevamenti. PAROLE CHIAVE Paratubercolosi, screening, aziende bovine da latte, epidemiologia, Italia. INTRODUZIONE Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) è l agente eziologico della paratubercolosi, conosciuta anche come malattia di Johne, un enterite granulomatosa cronica e progressiva che interessa i ruminanti, in particolar modo i bovini da latte, oltre ad altre specie domestiche e selvatiche 1. L infezione è diffusa in tutto il mondo e la sua prevalenza negli allevamenti di bovini da latte è stimata essere >15% in Canada 2 e Australia 3 e >50% in Europa 4,5 e USA 6. La paratubercolosi è causa di perdite economiche ingenti al patrimonio zootecnico: le bovine da latte infette possono presentare perdita di peso, riduzione della produzione di latte e, nei casi clinici conclamati, diarrea cronica con conseguente riforma anticipata o mortalità. Un ulteriore problema è rappresentato dall ipotesi che MAP possa essere un potenziale agente di zoonosi. Questa supposizione, inizialmente avanzata sulla base delle similitudini Autore per la corrispondenza: Fabio Ostanello (fabio.ostanello@unibo.it). cliniche e anatomo-patologiche tra la malattia di Johne e il morbo di Crohn, è stata successivamente avvalorata dai risultati di numerose indagini 7 che hanno evidenziato, nei pazienti affetti da morbo di Crohn, una probabilità 7 volte più elevata di albergare MAP a livello intestinale rispetto a soggetti affetti da altre patologie enteriche. Tali evidenze scientifiche hanno indotto alcuni Paesi extraeuropei (ad es. Cina e India) a richiedere certificazioni relative allo stato sanitario degli allevamenti il cui latte è utilizzato per i prodotti lattiero-caseari oggetto di importazione e, per tali ragioni, numerosi Paesi, compresa l Italia 8 hanno implementato piani di profilassi volontari o obbligatori con lo scopo di controllare o eradicare la malattia. L identificazione degli allevamenti infetti e la conoscenza della situazione epidemiologica del territorio sono il presupposto fondamentale per la corretta applicazione di piani di profilassi aventi l obiettivo di ridurre la prevalenza e l incidenza di allevamenti e capi infetti e, conseguentemente, ridurre il rischio di contaminazione della catena alimentare 9. In questo contesto, la definizione dello stato sanitario relativo all infezione da MAP in ciascun allevamento è un fattore cruciale per il controllo della malattia, per la possibilità di di-

2 14 Valutazione della prevalenza di aziende da latte infette da Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis nel sud Italia sporre di informazioni che consentano la corretta gestione del rischio e per la creazione di condizioni favorevoli per un commercio consapevole di animali e dei loro prodotti. In Italia, la stima della prevalenza della paratubercolosi non è nota per tutto il territorio nazionale; alcuni studi, effettuati in Regioni del Nord e del Centro, riportano una prevalenza apparente (PA) di aziende infette variabile dal 42% al 65%, con una PA di capi positivi che varia dal 2,4% al 4,6% Relativamente alle aziende delle Regioni del Sud, i soli dati a disposizione risalgono al , ma si riferiscono ad aziende di bovini da carne. Solo recentemente è stato condotto uno studio 14 volto a valutare l efficacia di un piano di screening che consentisse l individuazione degli allevamenti infetti da MAP attraverso l esame ripetuto di campioni collettivi rappresentati dal latte di massa e dai filtri dell impianto di mungitura. Nel presente lavoro vengono riportate ulteriori e più dettagliate osservazioni di carattere epidemiologico relative ai 569 allevamenti di bovine da latte di tre Regioni del Sud Italia investigati nel precedente lavoro 14. MATERIALI E METODI Prelievo dei campioni per lo screening L indagine è stata condotta, tra gennaio 2010 e maggio 2013, in 569 allevamenti di bovine da latte di tre Regioni (A, B e C) dell Italia meridionale. Preliminarmente, è stato sottoscritto un accordo di riservatezza con le cooperative degli allevatori che non consente di indicare le Regioni di provenienza degli allevamenti coinvolti. In base ai dati ISTAT 15, nelle Regioni oggetto dell indagine le aziende da latte con un numero di capi adulti >5 sono, rispettivamente, 688, 568 e 1963 per un patrimonio zootecnico di 31900, e capi in produzione. La percentuale di aziende esaminate rispetto a quelle presenti a livello regionale è pari a circa il 36% (Regione A), 17% (Regione B) e 12% (Regione C). In termini di produzione di latte per il consumo diretto, le aziende arruolate in questo studio forniscono circa l 83%, 58% e 24% di quanto prodotto a livello regionale, rispettivamente, nelle Regioni A, B e C. La distribuzione per classe di consistenza aziendale e per numero di capi allevati in ciascuna classe è simile a quella presente nell ambito di ciascuna Regione. In nessuno degli allevamenti arruolati erano stati effettuati in precedenza test per la diagnosi di paratubercolosi e in nessuna azienda sono state implementate misure specifiche di profilassi nei confronti dell infezione da MAP nel corso dello studio. Nelle aziende, di dimensioni comprese tra 8 e 608 vacche da latte (valore medio: 123) venivano principalmente allevate bovine di razza Holstein Friesian, mentre in alcuni allevamenti era presente anche una piccola percentuale (circa il 10%) di Brown Swiss e Jersey. Negli allevamenti è stato realizzato un piano di screening che prevedeva l esame di campioni collettivi (latte di massa - LM e filtro dell impianto di mungitura - FIM) ripetuto a distanza di circa 6 mesi (per un massimo di 4 campioni esaminati per azienda: 2 LM e 2 FIM). Il LM è stato prelevato utilizzando provette Falcon sterili mentre per i FIM sono stati utilizzati sacchetti stomacher sterili. Tutti i campioni sono stati congelati a -20 C lo stesso giorno del prelievo, quindi inoltrati entro 15 giorni al laboratorio, accreditato secondo la norma ISO/IEC 17025:2005, del Centro di Referenza Nazionale per la Paratubercolosi, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia-Romagna (IZSLER). Le analisi da LM e FIM sono state eseguite, rispettivamente, mediante test ELISA (kit ID VET) e real-time PCR (qpcr), come descritto precedentemente 14. Gli allevamenti risultati positivi ad almeno uno dei campioni esaminati nella fase di screening sono stati considerati infetti (anche nel caso in cui non sia stato possibile esaminare tutti i campioni previsti dal piano di screening). Gli allevamenti in cui lo screening completo (esame di 2 campioni di LM e 2 FIM) ha fornito esito negativo sono stati considerati negativi. La rappresentazione schematica del piano di campionamento realizzato è riportata in Figura 1. Prelievo dei campioni individuali di latte Per stimare la PA intra-aziendale, in 102 dei 121 allevamenti risultati positivi allo screening è stato effettuato il prelievo del latte individuale di tutti gli animali in lattazione. Il prelievo del latte individuale è stato realizzato anche in un campione casuale di 24 aziende risultate negative allo screening. Nella prima tipologia di aziende, i prelievi individuali sono stati eseguiti entro 3 mesi dal risultato positivo allo screening. Nelle aziende negative, il latte individuale è stato prelevato entro 3 mesi dall ultimo prelievo previsto dallo screening. Il latte individuale è stato prelevato, conservato e inoltrato al laboratorio del Centro di Referenza Nazionale per la Paratubercolosi come descritto in precedenza. Sono stati analizzati, mediante test ELISA (kit ID VET, France): a) 9509 campioni di latte individuale provenienti da altrettante bovine allevate nelle 102 aziende risultate positive allo screening; b) 2803 campioni di latte individuale provenienti da 24 allevamenti, selezionati casualmente tra quelli negativi allo screening. Analisi statistica La valutazione preliminare della normalità della distribuzione campionaria è stata realizzata utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnoff. In base ai risultati di questo test, le variabili continue sono state analizzate utilizzando i test di Mann-Whitney o di Wilcoxon. Le variabili qualitative sono state analizzate utilizzando il test chi-quadrato. Per valutare la sensibilità e la specificità del piano di screening utilizzato in termini di probabilità di individuazione della presenza, in allevamento, di almeno un capo positivo alla ricerca di anticorpi nel latte, sono stati calcolati i quartili della distribuzione della PA intra-aziendale. L analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il software SPSS ver. 21 (IBM SPSS Statistics). RISULTATI Test di screening Complessivamente (Fig. 1 e Tab. 1), sono stati esaminati 569 campioni di latte di massa proveniente da altrettanti allevamenti e i filtri dell impianto di mungitura di 436 aziende. In 385 aziende è stato completato lo screening, esaminando 2 campioni di LM e 2 FIM. Un totale di 121 (21,3%; IC 95%: 18,0-24,9) allevamenti sono risultati positivi allo screening, (positività evidenziata in almeno un campione di LM o FIM). La prevalenza di aziende positive allo screening è la seguente: Regione A: 22,4% (IC 95%: 17,4-28,2); Regione B: 24,0% (IC 95%: 15,8-33,7); Regione C: 18,9% (IC 95%: 14,0-24,6). La prevalenza di azien-

3 F. Ostanello et al. Large Animal Review 2015; 21: Figura 1 - Rappresentazione schematica del piano di campionamento realizzato e dei risultati ottenuti nei 569 allevamenti esaminati. de positive allo screening non è risultata significativamente diversa nelle tre Regioni esaminate. L esame ripetuto di più di un campione collettivo (sia LM, sia FIM) permette l identificazione di un maggior numero di allevamenti positivi (Tab. 1). Complessivamente, l analisi dei FIM permette di identificare una maggiore proporzione di allevamenti positivi allo screening rispetto all analisi del LM (18,3% vs 13,7%); tale risultato si conferma in ciascuna delle Regioni esaminate. Tuttavia, né il solo esame del LM, né il solo esame dei FIM permette di identificare tutti i 121 allevamenti positivi allo screening. La prevalenza di aziende infette (positive all esame di LM o FIM), distinta per Regione, è riportata in Tabella 1. In funzione del tipo di campione esaminato, la prevalenza nelle tre Regioni varia da un minimo del 12,7% a un massimo del 29,4%. Nessuna differenza statisticamente significativa (p>0,05) è stata messa in evidenza fra le tre Regioni, per quanto riguarda la proporzione di positività all esame del LM o dei FIM, considerando sia gli allevamenti in cui gli esami di screening sono stati effettuati in maniera incompleta (esame di solo 1 LM o 1 FIM), sia quelli con screening completo (esame di 2 LM e 2 FIM). Campioni di latte individuale Considerando tutti i 126 allevamenti in cui è stato effettuato il prelievo individuale, la PA media intra-aziendale è risultata del 6,2% (mediana: 5,3%), 5,0% (mediana: 3,5%) e 5,7% (mediana: 6,1%), rispettivamente nelle Regioni A, B e C (Tab. 2). Per quanto riguarda la media dei valori di PA intra-aziendale, nessuna differenza statisticamente significativa (p>0,05) è stata messa in evidenza tra le tre Regioni, sia considerando tutte le 126 aziende esaminate, sia considerando solo i 102 allevamenti risultati positivi allo screening (Tab. 2). In tutte le Regioni, la PA media nelle aziende risultate positive allo scree- Tabella 1 - Screening aziendale: risultati dell esame del filtro dell impianto di mungitura (FIM) mediante real-time PCR e del latte di massa (LM) mediante ELISA. Regione A B Campione analizzato Allevamenti esaminati almeno 1 volta 1 prelievo 2 prelievo Campioni Campioni positivi Campioni Campioni positivi analizzati (%; IC 95%) analizzati (%; IC 95%) Totale campioni positivi (%; IC 95%) Totale aziende positive (%; 95%IC) FIM (12,1; 8,0-17,4) (6,3; 3,4-10,5) 38 (9,2; 6,6-12,4) 35 (16,1; 11,4-21,6) LM (9,3; 5,9-13,7) (6,1; 3,4-10,0) 36 (7,7; 5,5-10,5) 35 (14,3; 10,2-19,3) FIM (20,4; 10,2-34,3) 46 8 (17,4; 7,8-31,4) 18 (18,9; 11,6-28,3) 15 (29,4; 17,5-43,8) LM (7,5; 3,1-14,9) 90 9 (10,0; 4,7-18,1) 16 (8,7; 5,1-13,8) 14 (14,6; 8,2-23,3) C FIM (10,8; 6,4-16,7) (10,2; 5,9-16,0) 33 (10,5; 7,3-14,4) 30 (18,0; 12,5-24,6) LM (6,7; 3,8-10,8) (10,5; 6,7-15,3) 38 (8,6; 6,11-11,6) 29 (12,7; 8,7-17,8) FIM (12.6; ) (9.0; ) 89 (10.8; ) 80 (18.3; ) A+B+C LM (7.9; ) (8.5; ) 90 (8.2; ) 78 (13.7; ) Totale 121 (21,3; 18,0-24,9)

4 16 Valutazione della prevalenza di aziende da latte infette da Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis nel sud Italia Tabella 2 - Prevalenza apparente (PA) intra-aziendale nelle tre Regioni esaminate, rispettivamente in tutti i 126 allevamenti in cui è stato effettuato l esame del latte individuale, nei 102 risultati positivi all esame di screening e nei 24 risultati negativi. Regione Prevalenza apparente intra-aziendale (%) Tutti gli allevamenti Allevamenti positivi Allevamenti negativi esaminati all esame di screening all esame di screening Minimo Massimo Media Mediana Minimo Massimo Media Mediana Minimo Massimo Media A 0,00 22,7 6,2 5,3 0,00 22,7 6,9 5,3 0,00 12,8 2,7 B 0,00 21,7 5,0 3,5 0,00 21,7 6,4 4,8 0,00 7,9 2,7 C 0,05 12,5 5,7 6,1 0,05 12,5 5,7 6,1 0,00 3,4 1,2 Totale 0,00 22,7 5,7 5,0 0,00 22,7 6,4 5,3 0,00 12,8 1,9 ning è risultata significativamente maggiore rispetto a quella delle aziende negative allo screening. In 9 dei 102 allevamenti risultati positivi allo screening, non è stato rilevato alcun campione di latte individuale positivo, mentre in 17 dei 24 allevamenti negativi allo screening, alcuni campioni individuali sono risultati positivi al test ELISA (Fig. 1). Considerando solo le 107 aziende in cui sono stati effettuati sia tutti gli esami previsti dalla fase di screening (esame di 2 LM e di 2 FIM, Tab. 3), sia l esame dei campioni individuali, la positività all esame di almeno 1 campione collettivo (LM o FIM) è significativamente associata (p<0,05) con la presenza di almeno un capo positivo alla ricerca di anticorpi nel latte; analogo risultato si ottiene prendendo in considerazione la positività all esame di almeno 1 campione di LM. Al contrario, nessuna associazione statisticamente significativa è stata evidenziata valutando la positività di almeno 1 FIM e la presenza di capi sieropositivi in azienda. La probabilità di ottenere un risultato positivo dall esame di almeno uno dei due campioni di LM prelevati è significativamente associata (p<0,001) con una PA intra-aziendale >5% (mediana della PA). Tale associazione non è stata messa in evidenza per i risultati dell esame dei FIM. Per quanto riguarda la distribuzione percentuale nelle 4 classi di PA intra-aziendale dei 107 allevamenti in cui sono stati esaminati sia tutti i campioni previsti nella fase di screening, sia i campioni individuali, non è stata messa in evidenza nessuna differenza statisticamente significativa tra le tre Regioni (Fig. 2). L esame di screening completo ha una sensibilità variabile da un minimo del 56,2% ad un massimo del 100% (media: 85,6%), in funzione della classe di PA intra-aziendale (Tab. 3). La sensibilità com- Figura 2 - Distribuzione assoluta e percentuale nelle 4 classi di prevalenza apparente intra-aziendale (PA) dei 107 allevamenti in cui sono stati esaminati tutti i campioni previsti nella fase di screening (2 LM e 2 FIM).

5 F. Ostanello et al. Large Animal Review 2015; 21: Tabella 3 - Sensibilità e specificità delle diverse tipologie di risultato al test di screening in funzione della presenza di almeno 1 capo positivo alla ricerca di anticorpi nel latte di massa (dati relativi ai 107 allevamenti in cui sono stati esaminati tutti i campioni previsti nella fase di screening). Presenza di capi Quartile della sieropositivi Sensibilità % Specificità distribuzione Risultato dello screening in azienda (IC 95%) (IC 95%) della PA Sì No Totale Almeno 1 campione collettivo si ,2 (29,9-80,2) 70,0 (34,7-93,3) 2,0 (FIM o LM) positivo no Totale Almeno 1 campione collettivo si ,9 (70,8-97,6) nc 2,1-4,9 (FIM o LM) positivo no Totale Almeno 1 campione collettivo si ,6 (65,1-95,6) nc 5,0-7,9 (FIM o LM) positivo no Totale Almeno 1 campione collettivo si (87,7-100) nc 8,0 (FIM o LM) positivo no Totale Almeno 1 campione collettivo si ,6 (77,0-91,9) 70,0 (34,7-93,3) Totale (FIM o LM) positivo no Totale si ,0 (24,6-75,3) 70,0 (34,7-93,3) 2,0 no Totale si ,4 (49,8-86,2) nc 2,1-4,9 no Totale si ,4 (44,3-82,8) nc 5,0-7,9 no Totale si ,1 (40,6-78,5) nc 8,0 no Totale si ,9 (52,5-72,5) 70,0 (34,7-93,3) Totale no Totale si ,2 (0,2-30,2) 90,0 (55,5-99,7) 2,0 no Totale si ,1 (28,7-68,0) nc 2,1-4,9 no Totale si ,8 (33,4-73,4) nc 5,0-7,9 no Totale si ,6 (59,0-91,7) nc 8,0 no Totale si ,5 (41,2-61,8) 90,0 (55,5-99,7) Totale no Totale Note. nc: non calcolabile. plessiva si riduce, rispettivamente, al 62,9% e al 51,5% prendendo in considerazione rispettivamente solo i risultati dell analisi dei FIM o solo il risultato dell analisi del LM. DISCUSSIONE Il presente lavoro è la prima valutazione della prevalenza di paratubercolosi condotta esaminando un ampio campione di allevamenti di vacche da latte del Sud Italia, mediante una procedura di screening basata sull analisi, mediante test ELI- SA o qpcr, di campioni di latte di massa (LM) e dei filtri dell impianto di mungitura (FIM). Attraverso l esecuzione in parallelo anche di test individuali sul latte, è stata valutata la sensibilità relativa del piano di screening che è risultata del 56,2% negli allevamenti con PA intra-aziendale 2% (1 quartile), dell 88,9% quando la PA era compresa tra il 2,1% e il 4,9% (2 quartile), dell 84,6% per PA comprese tra il

6 20 Valutazione della prevalenza di aziende da latte infette da Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis nel sud Italia 5,0% e il 7,9% (3 quartile) e del 100% se la PA era 8% (4 quartile). La procedura di screening utilizzata ha infatti dimostrato maggiori probabilità di fornire un esito positivo all aumentare della PA intra-aziendale (Tab. 3). La prevalenza di aziende e capi infetti riportata deve essere valutata con attenzione, in considerazione del fatto che è strettamente connessa ai risultati di un piano di screening per l individuazione di aziende positive per MAP. Il rischio è quello di una possibile sottostima della prevalenza di aziende infette e di una sovrastima della prevalenza di capi infetti. Infatti, l esame dei campioni individuali di latte è stato realizzato in una percentuale di aziende positive allo screening più alta rispetto a quelle risultate negative. Queste considerazioni potrebbero spiegare la minor prevalenza di aziende infette (cioè risultate positive allo screening) e il più alto valore di PA intra-aziendale da noi rilevato rispetto a quello messo in evidenza in studi condotti in altre Regioni italiane che hanno evidenziato, mediante test ELISA eseguito sul latte individuale o sul siero di sangue, prevalenze di aziende infette variabili dal 42% al 65% e PA intra-aziendali dal 2,4 al 5,6% 10,11,16. La positività ad un doppio esame mediante test ELISA del LM è risultato significativamente correlato a una PA intraaziendale > 5% come è già stato precedentemente segnalato 17. Questa osservazione presenta una notevole applicazione pratica, in quanto potrebbe consentire una stima predittiva della PA intra-aziendale e, di conseguenza, potrebbe consentire di assegnare una scala di priorità di intervento all interno di programmi di controllo finalizzati alla riduzione della prevalenza di capi infetti. La qpcr eseguita sui FIM fornisce un risultato positivo nel 18,3% degli allevamenti esaminati contro il 13,7% fornito dall esame ELISA del LM, risultando pertanto più sensibile nel rilevare la presenza dell infezione in allevamento. Sia la proporzione di aziende risultate positive allo screening, sia la loro distribuzione all interno delle classi di prevalenza apparente intra-aziendale è simile nelle 3 Regioni considerate (Tab. 2, Fig. 2). La discordanza degli esiti forniti dai due test utilizzati (qp- CR ed ELISA) era attesa, sia in considerazione del diverso target diagnostico 18 sia di eventuali fattori esterni (es. igiene della mungitura) che possono influenzare i risultati. L osservazione dell assenza di risultati positivi nei campioni di latte individuale in 9 allevamenti che erano risultati positivi allo screening, può essere spiegata con il fatto che i campioni di latte individuale sono stati prelevati a distanza di circa 1-3 mesi dai prelievi di screening. In questo lasso di tempo, gli animali eliminatori potrebbero essere stati messi in asciutta, venduti o riformati. La specificità della qpcr eseguita sul FIM e del test ELISA eseguito sul LM è stata valutata pari al 100% 19 ; è quindi altamente improbabile che il risultato ottenuto in queste 9 aziende sia imputabile a falsa positività. L evento contrario, cioè il fatto che in 17 degli allevamenti negativi allo screening alcuni campioni individuali di latte siano risultati positivi è prevedibile, considerando la ridotta sensibilità sia del test ELISA utilizzato per la ricerca di anticorpi nel LM (30,1%; IC 95%: 27,5-37,3% 17 ), sia del test qp- CR utilizzato, in grado di fornire esito positivo quando la quantità di MAP presente nel FIM è superiore a UFC 14. La positività all esame del FIM mediante qpcr non è risultata significativamente associata alla PA intra-aziendale, come già osservato da altri Autori 19, che hanno riportato una significativa associazione tra lo stato di infezione della mandria e la frequenza dei risultati positivi alla ricerca di MAP dai FIM, ma nessuna associazione tra prevalenza intra-aziendale e la frequenza dei risultati positivi alla ricerca di MAP dai FIM. Non sono disponibili informazioni relative ai fattori che possono influenzare la probabilità di ottenere un risultato positivo all esame dei FIM, ma studi condotti esaminando il LM hanno dimostrato che le probabilità di contaminazione sono influenzate dalla presenza in allevamento di animali forti eliminatori fecali di MAP (c.d. high shedders ) 20 e dall igiene di mungitura 21, piuttosto che dalla PA intra-aziendale. La positività all esame mediante qpcr dei FIM deve essere considerata un chiaro indice di potenziale contaminazione del latte prodotto; per tale ragione, l esame dei FIM può essere un utile strumento per definire le priorità in caso di programmi di controllo finalizzati alla riduzione della contaminazione del latte. L impiego combinato dei due test (qpcr per l esame dei FIM ed ELISA per l esame del LM), ha permesso, complessivamente, l individuazione dell 85,6% degli allevamenti con almeno un capo positivo al test ELISA eseguito sul latte individuale; tale percentuale varia da un minimo del 56,2% negli allevamenti con PA intra-aziendale 2% e raggiunge il 100% se la PA intra-aziendale supera l 8%. Risultati inferiori, in termini di sensibilità della procedura di screening, si ottengono dall analisi dei soli FIM o dei soli campioni di LM, da cui l opportunità, per massimizzare la sensibilità della procedura di screening, di utilizzare una combinazione delle 2 tipologie di analisi associata alla ripetizione dei campionamenti di LM e FIM. L identificazione degli allevamenti infetti da MAP sulla base dell esame colturale da campioni fecali di singole vacche è considerata troppo costosa per gli allevatori 22 ; per questa ragione è stata valutata, negli anni, l efficacia di procedure alternative di screening, basate in genere sull esame campionario del latte individuale o sull esame del latte di massa. Ad esempio, alcuni Autori 21 riportano che il singolo esame, mediante PCR, di campioni di LM ha scarsa sensibilità e scarso valore predittivo positivo. In un altro lavoro 22 sono state valutate cinque diverse strategie di screening, basate sulla coltura fecale o sul test ELISA del latte di tutti gli animali dell allevamento o di un gruppo selezionato, concludendo che l esame del latte individuale di tutta la mandria è la strategia economicamente più conveniente. Tuttavia, il prelievo individuale di latte da tutti gli animali è una procedura costosa e che può richiedere molto tempo, soprattutto negli allevamenti di grandi dimensioni. In Italia, ad esempio, il costo attuale di un test ELISA del latte, eseguito presso l Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia-Romagna è di 2,54, mentre il costo di una qpcr è pari a 26,40 ; ciò significa che la procedura di screening utilizzata in questo studio ha un costo di circa 58 per ogni azienda. Ciò rende economicamente conveniente la procedura di screening adottata, rispetto all esame del latte individuale, in aziende in cui sono presenti più di 23 vacche. Altro fattore da considerare è che, quando viene scelta la strategia dell esame dei campioni individuali di latte nelle aziende di grandi dimensioni, l allungamento dei tempi di mungitura, con conseguente stress degli animali, devono essere considerati come ulteriori costi. Va tuttavia ricordato che l esame dei campioni individuali di latte di tutti gli animali consente non solo di valutare lo stato sanitario dell allevamento nei confronti di MAP, ma per-

7 F. Ostanello et al. Large Animal Review 2015; 21: mette la valutazione della prevalenza e la diagnosi individuale di infezione, con conseguente riforma o gestione degli animali positivi, nell ottica della biosicurezza di allevamento. Data la limitata sensibilità negli allevamenti a bassa prevalenza ( 2%), il piano di screening proposto non è adeguato per certificare l indennità dell allevamento. Al contrario, negli allevamenti infetti con prevalenza superiore al 2%, il piano di screening si è dimostrato uno strumento efficace ed economico per rilevare la presenza di infezione in allevamento e il conseguente rischio di contaminazione del latte. Per tali motivi, il piano di screening utilizzato potrebbe essere utile per assegnare una scala di priorità adeguata alle misure di controllo da adottare nel contesto di piani volti a ridurre la prevalenza di infezione negli allevamenti da latte e/o a ridurre la contaminazione del latte. Prevalence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-infected dairy herds in Southern Italy SUMMARY Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is the etiological agent of paratuberculosis, a chronic contagious bacterial disease primarily affecting dairy cattle. Paratuberculosis represents a dual problem for the milk production chain: in addition to economic losses to affected herds, MAP may have zoonotic potential. Infected herds must be identified in order to implement programs designed to reduce the incidence of disease within and between herds and to prevent MAP from entering the food chain. The objective of this study was to evaluate the sensitivity and specificity of a screening sampling plan (SSP) to detect MAP-positive dairy cattle herds by repetitive analysis of bulk tank milk (BTM) samples by ELISA and in-line milk filter (ILMF) samples by realtime PCR. Samples from BTM and ILMF were collected twice from 569 dairy herds in southern Italy. Additionally, 12,312 individual milk samples were collected: 9,509 from 102 SSP-positive herds and 2,803 from 24 randomly selected SSP-negative herds. In our study we detected a total of 121 SSP-positive herds (i.e., 21.3%; 95% CI: %); the within-herd apparent prevalence (AP) ranged between 0.00 and 22.7% (mean 5.7%). A significant difference in withinherd AP was shown between SSP-positive herds and SSP-negative herds. A highly significant association was shown between the median AP herd status (>5%) and positivity to at least one ILMF or BTM sample. The SSP detected a minimum of 56.2% of low AP herds (AP 2.0%) up to a maximum of 100% of herds with a within-herd AP 8.0%. Overall, the SSP detected 85.6% of herds in which at least one individual milk sample was positive by ELISA. The proposed SSP was an inexpensive and useful tool to detect MAP-positive herds with a higher risk of infection diffusion and milk contamination. Although the SSP cannot be used for MAPfree certification of herds, it could be useful to prioritize appropriate control measures aimed at reducing the prevalence of infection in dairy herds and milk contamination. KEY WORDS Paratuberculosis, screening, dairy cattle herds, epidemiology, Southern Italy. Bibliografia 1. Chiodini R.J., Van Kruiningen H.J., Merkal R.S. (1984). Ruminant paratuberculosis (Johne s disease): the current status and future prospects. Cornell Vet, 74: Tiwari A., VanLeeuwen J.A., McKenna S.L., Keefe G.P., Barkema H.W. (2006). Johne s disease in Canada Part I: clinical symptoms, pathophysiology, diagnosis, and prevalence in dairy herds. Can Vet J, 47: AHA (2012). Information about Johne s disease. Animal Health Australia, Canberra /07/2.-Risk-of-Seedstock-Producers-Poster_PRINT.pdf Nielsen S.S., Toft N. (2009). A review of prevalences of paratuberculosis in farmed animals in Europe. 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