Fattori di crescita FATTORI DI CRESCITA. Recettori

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1 FATTORI DI CRESCITA

2 FATTORI DI CRESCITA

3 Fattori di crescita FATTORI DI CRESCITA Recettori

4 FATTORI DI CRESCITA Proliferazione Differenziamento

5 FATTORI DI CRESCITA? Come fa una interazione tra due molecole sulla superficie cellulare a raggiungere il nucleo per attivare la trascrizione di mrna e la traduzione proteica?

6 STUDIO INTERAZIONE RECETTORE-LIGANDO 1. Analisi dell equilibrio di legame a saturazione 2. Cross-linking I + iodogen bolton-hunter lactoperoxidase 125 I 125 I 125 I 125 I

7 Protein + Na 125 I + Protein + Na 125 I +

8 Analisi dell equilibrio di legame a saturazione (Scatchard plot) Cellule GM cells/pozzetto in piastra da 48 pozzetti Aggiunti 100 microlitri di terreno/pozzetto contenente 125 I-FGF2 4 ng/ml, 8 ng/ml, 16 ng/ml, 40 ng/ml, 80 ng/ml, 100 ng/ml +/- FGF2 300x Campioni in quintuplicato 125 I-FGF2: attività specifica 358 CPM/fmole I VALORI SONO OTTENUTI DA HOT medio COLD medio [ 125 I-FGF2] CPM caricate Lavaggio F ph4 4 ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml B B/F

9 Analisi dell equilibrio di legame a saturazione (Scatchard plot) 125 I-GF I-GF 125 I-GF 125 I-GF I-GF 125 I-GF 125 I-GF Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y T = binding totale NSB = binding non specifico (non saturabile) SB = binding specifico

10 F B B/F ? B rappresenta il coefficiente angolare Quando Y=0 X=1,89 fmoli N rec/cell = 1.89 x x x = 1,8 x x 10 3 Ka= 1/B = fmoli in 100 microlitri, Che equivale a 446 pm

11 Cross-linking 125 I-GF I-GF 125 I-GF 125 I-GF I-GF 125 I-GF 125 I-GF Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y X I-GF 125 I-GF 125 I-GF I-GF 125 I-GF 125 I-GF Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate (BS 3 ) is a homobifunctional, water-soluble, non-cleavable and membrane impermeable cross-linker. It contains an amine-reactive N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) ester at each end of an 8-carbon spacer arm. NHS esters react with primary amines at ph 7-9 to form stable amide bonds, along with release of the N-hydroxysulfosuccinimide leaving group. Proteins, including antibodies, generally have several primary amines in the side chain of lysine (K) residues and the N-terminus of each polypeptide that are available as targets for NHS-ester cross-linking reagents.

12 Cross-linking I-GF 125 I-GF 125 I-GF I-GF 125 I-GF 125 I-GF Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y + sample buffer FGF/FGFR SDS-PAGE Dry gel AUTORADIOGRAFIA

13 ATTIVAZIONE DEL SEGNALE

14 La trasduzione del segnale si perpetra attraverso eventi di fosforilazione

15 * + fattore di crescita SDS-PAGE * * * * Western blot

16 La trasduzione del segnale si protrae per integrazione dell informazione

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18 PROTEINE CHE LEGANO PDGFR ATTIVATO

19 Come identificare proteine legate al recettore? Immunoprecipitazione Recupera immunoprecipitato SDS/PAGE Western blot GF Aggiungi resina di Proteina A/G Lisi in tampone adeguato Aggiungi anticorpo anti recettore

20 Immunoprecipitazione Gli anticorpi si legano specificamente alle proteine A o G di staffilococco tramite la porzione Fc Lisato + anticorpo Lavaggio Tampone Eluizione

21 Immunoprecipitazione

22 Costruzione di un recettore chimerico Trasfezione in un background negativo Mutazione del recettore chimerico

23 Immunoprecipitazione di target intracellulare con peptide che mima il sito di legame al recettore: cromatografia di affinità

24 Analisi della fosforilazione del substrato come indice dell attivazione

25 Test di attivazione delle MAPK Far western

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29 FGFR1 signal transduction OUT FGF2 FGF2 IN Src Crk P P P P P P Y730 Y463 Y583 Y585 Y653 Y654 P PLC- γ Y766 Y463 Y583 Y585 Y766 P P Y653 Y654 P Y730 P P Crk PLC- γ Shc Ras Raf MAP kinase pathway Jun-D 80K-H FRS2 Shp-2 Cytoplasm Nucleus

30 Specifiche tirosine fosforilate legano specifiche molecole

31 I trasduttori intracellulari posseggono domini modulari

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33 Dominio SH2 Il nome deriva da una regione omologa nell oncogene src (src homology 2). I domini SH2 sono moduli di circa 100 aminoacidi che legano residui di tirosina fosforilata. La specificità di legame dipende dagli aminoacidi fiancheggianti la tirosina fosforilata.

34 Dominio PTB I domini leganti tirosine fosforilate sono moduli di aa che legano motivi Asn-Pro-X-Tyr. In alcuni casi (Shc) la tirosina deve essere fosforilata. Dominio PTB di Shc legato al peptide HIIENPQpYFS

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36 Dominio SH3 Il nome deriva da una regione omologa nell oncogene src (src homology 3). I domini SH3 generalmente legano peptidi ricchi in prolina (Pro-X-X-Pro) Dominio SH3 dell omologo di Grb2 legato al peptide PPPVPPRRR di Sos.

37 DAL RECETTORE A RAS Shc PTB SH2 Grb2 SH3 SH2 SH3 Sos Proline-rich Catalytic activity (GNRP)

38 LA PROTEINA RAS

39 LA PROTEINA RAS Le GTPasi monomeriche Sono tutte proteine che subiscono modificazioni lipidiche (farnesilazione e/o palmitoilazione) che ne consentono l ancoraggio alle membrane. Nel caso di Ras, l ancoraggio è sulla faccia citoplasmatica della membrana cellulare Cristallo di Ras legato a GTP

40 LA PROTEINA RAS La proteina Ras è attiva quando è legata a GTP, mentre è inattiva se legata a GDP. La sua attività viene regolata da altre due classi di proteine: 1. GTPase activating protein (GAP) che incrementano l idrolisi di GTP legato a Ras a GDP, favorendo l inattivazione della proteina 2. Guanine nucleotide exchange factor (GEF) che stimolano Ras a perdere GDP. La concentrazione di GTP nel citosol è 10 volte più alta di quella di GDP, quindi Ras tenderà a legare GTP una volta lasciato GDP.

41 Gli hotspot maggiori che, se mutati, portano all attivazione della proteina Ras si ritrovano in prossimità del legame a GTP. Le diverse mutazioni aminoacidiche decrementano l idrolisi del GTP da parte della proteine GAP. La molecola Ras mutata rimane prevalentemente legata a GTP e quindi costitutivamente attiva, nonostante l assenza di un segnale di stimolazione extracellulare.

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43 DA RAS ALLA CASCATA DELLE MAP CHINASI La fosforilazione in tirosina e l attivazione di Ras sono eventi transitori e a vita breve. Pressochè immediata è l azione delle fosfatasi sui residui fosforilati e altrettanto veloce è l idrolisi del GTP a GDP. Per stimolare la proliferazione cellulare questi segnali devono essere tramutati in altri che durando più a lungo possono trasportare l informazione fino al nucleo. La cellula interviene con cascate di eventi di fosforilazione che hanno come bersaglio residui di serina e di treonina. CASCATA DELLE MAP (Mitogen-activated protein) CHINASI chiamate anche ERK (extracellular-signal-regulated) chinasi

44 CASCATA DELLE MAP CHINASI L attivazione delle MAP chinasi necessita della fosforilazione contemporanea di un residuo di treonina e di un residuo di tirosina. La proteina che può da sola catalizzare queste reazioni viene chiamata MAP chinasi-chinasi (MAPKK). A sua volta, questa proteina viene attivata, tramite fosforilazione in serina e treonina, dalla MAP chinasi chinasi chinasi (MAPKKK), che è il target di Ras.

45 CASCATA DELLE MAP CHINASI Nucleo La MAPK attivata trasloca dal citosol al nucleo, dove può fosforilare diversi substrati. Tra di essi i più importanti sono i fattori di trascrizione che consentono la produzione di nuovi mrna che codificano per proteine coinvolte nella replicazione cellulare.

46 ATTIVAZIONE DELLE MAP CHINASI

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49 FGFR1 signal transduction

50 Saggi di attività chinasica

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63 Inibitori di attività chinasica

64 Quale inibitore scegliere?

65 Inibitori chimici Inibitori biologici

66 Come utilizzare un inibitore di attività chinasica? +/- stimolo +/- inibitore Attivita biologica Ma a che dose?

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68 Perché sono importanti gli inibitori di attività chinasica?

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70 Selection of antitumor and antivascular drugs under investigation for cancer therapy

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